Summary
이 프로토콜은 인체 배설물 미생물의 체외 배치 배양 발효 시스템을 설명하며, 이눌린(잘 알려진 프리바이오틱 및 가장 널리 연구된 미생물 변조기 중 하나)을 사용하여 특정 한 효과의 효과를 추정하는 데 이 시스템의 사용을 입증합니다. 대변 미생물 구성 및 대사 활동에 대한 개입.
Abstract
몇몇 인간적인 질병에 있는 창자 microbiome의 새로운 역할은 새로운 공구, 기술 및 기술의 돌파구를 요구합니다. 이러한 개선은 인간의 건강 혜택에 대 한 미생물 계전체 변조기의 활용을 해독 하는 데 필요한. 그러나, 미생물군유전체 변조를 검증하고 관련 건강상의 이점을 예측하기 위해 변조기의 대규모 스크리닝 및 최적화는 많은 수의 동물 및/또는 인간 피험자의 필요성으로 인해 실질적으로 어려울 수 있다. 이를 위해, 시험관내 또는 생체외 모델은 미생물군유전체 변조기의 예비 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 본 명세서에서, 프로바이오틱스, 프리바이오틱스 및 기타 식품 성분을 포함한 장내 미생물 군비암 변조기의 다양한 개입의 효과를 조사하는데 사용될 수 있는 생체내 배설물 미생물 배양 시스템을 최적화및 입증하였으며, 이외에도 건강 기능 식품 및 약물, 인간의 창 자 microbiota의 다양성과 구성에. 가장 널리 연구된 프리바이오틱 화합물 및 미생물군유전체 변조기 중 하나인 이눌린(Inulin)은 건강한 배설물 미생물 성분과 배설물 pH 및 유기산의 배설물 수준과 같은 대사 활동에 미치는 영향을 조사하기 위해 여기에 사용됩니다. 젖산 및 짧은 사슬 지방산을 포함 하 여 (SCFAs). 이 프로토콜은 배설물 미생물 프로필에 대한 변조기의 다양한 개입의 효과를 추정하고 건강에 미치는 영향을 예측하는 연구에 유용할 수 있습니다.
Introduction
인간 미생물은 박테리아, 고고학, 바이러스 및 진핵 미생물1로구성된 복잡한 커뮤니티로, 인체내외적으로 서식합니다. 최근 증거는 비만, 당뇨병을 포함한 다양한 인간 질병에서 창자 미생물과 장내 미생물군유전체 (인간 위장관에서 발견되는 미생물및 유전자의 전체 수집)의 근본적인 역할을 확립했습니다. 심혈관 질환,암 1,2,3. 또한, 우리의 창자에 살고있는 미생물은 크게 우리의 건강에 영향을 미치는 대사 산물의 넓은 스펙트럼을 생산하고 또한 여러 질병의 병리 생리학뿐만아니라 다양한 대사 기능에 기여할 수 4, 5.이 창자 미생물 집단의 구성 및 기능에 있는 이상한 변경 (섭동)은 일반적으로 "창자 dysbiosis"로 불거지됩니다. Dysbiosis는 일반적으로 호스트의 건강에 해로운 상태와 연관되고 그러므로 호스트의 건강한 통제 상태와 관련되었던 정상 (정규성) 미생물 공동체에서 분화될 수 있습니다. 창자 미생물 군비 병의 특정 패턴은 종종 다양한질병1, 2,3,6,7에서발견된다.
소화되지 않은 음식, 특히 발효 가능한 탄수화물/섬유의 발효는 에너지를 생산할 뿐만 아니라 짧은 사슬 지방산(SCFA), 젖산, 포메이트, 이산화탄소, 메탄, 수소 및 에탄올6. 또한, 장내 미생물은 엽산, 비오틴, 트리메틸아민-N-산화물, 세로토닌,트립토판, 감마-아미노부티르산, 도파민, 노르에피네프린, 아세틸콜린, 히스타민, 데옥시콜산, 4-에틸페닐 황산염. 이것은 주로 여러 신체 과정, 대사 기능 및 후생 유전학 변화에 기여하는 호스트 미생물 틈새 시장 내의 본질적인대사 플럭스의 활용을 통해 발생 1,8,9, 10. 그러나, 이러한 미생물 제품에 대한 다양한 개입의 효과는 쉽고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜의 부족으로 인해 불분명하거나 불분명하게 남아 있습니다. 인간의 창 자 microbiota 구성은 매우 복잡 하 고 다양 한 생태계, 따라서, 인간의 건강 및 질병 병 리에 그것의 역할에 대 한 많은 질문 여전히 대답 남아. 장내 미생물의 조성 및 대사 기능에 대한 많은 일반적인 장내 미생물 군비세포 조절제(예: 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 항생제, 대변 이식 및 감염)의 효과는 대체로 애매합니다. 또한, 생체 내에서 이러한 효과의 검사 및 검증이 어렵다, 특히 장내 미생물에 의해 생성 된 영양소와 대사 산물의 대부분이 흡수 또는 동시에 그리고 창자에 신속하게 폐기되기 때문에; 따라서, 생체 내에서 이들 대사산물(예를 들어, SCFA)의 생산, 양 및 처리를 측정하는 것은 여전히 실질적인 과제로 남아 있다. 실제로, 동물과 인간 피험자와 같은 생리학적 모델은 장내 미생물군유전체의 역할과 숙주 건강에 대한 변조를 결정하는 데 중요하지만, 이로 인해 다양한 유형의 미생물군유전체 변조기의 대규모 스크리닝에는 적합하지 않을 수 있습니다. 윤리적, 금전적 또는 시간적 제약을 가할 수 있습니다. 이를 위해, 체외 및/또는 생체 내 생체 내 모델, 체외에서 창 자 microbiota의 배양 하 고 다음 다른 microbiota 변조기와 개입, 시간 및 비용 절약 기회를 제공할 수 있습니다 및 따라서 예비 또는 대규모 스크리닝을 허용할 수 있습니다. 다양 한 구성 요소 (프로바이오틱스 등, prebiotics, 그리고 다른 내정간섭 화합물) 검사/배설물 microbiota 다양성에 미치는 영향을 예측, 구성 및 신진 대사 프로필. 장내 미생물군유전체의 이러한 생체외 및 생체내 시스템을 이용한 연구는 숙주 건강과 질병에 기여하는 숙주 미생물군유전체 상호작용에 대한 추가 이해를 촉진할 수 있으며, 또한 미생물군유전체를 표적으로 하는 새로운 치료법을 찾는 것으로 이어질 수 있다. 숙주 건강을 개선하고 다양한 질병을예방하고 치료합니다 1.
시험관 내 장 내 미생물 배양 시스템은 실제 장 조건을 진정으로 복제 할 수 없지만, 여러 실험실은 이러한 모델을 개발하기 위해 노력했으며, 그 중 일부는 어느 정도 실용적이라고 밝혀졌으며 성공적으로 사용되었습니다. 다른 목적을 가지고 있습니다. 최근 창자 모델 중 하나는 인간 장 미생물 생태계의 시뮬레이터, 전체 인간의 위장을 모방, 위 포함 하 여, 소장, 그리고 결 장의 다른 영역. 그러나 이러한 기술적으로 복잡한 모델은 전 세계 다른 연구 시설에서는 접근하지 못할 수 있습니다. 따라서, 미생물군유전체 변조기와 장내 미생물 군비유및 숙주 건강에 미치는 영향을 연구하는 실험실에 대해 비교적 간단하고 저렴하며 실용적인 새로운 대체 모델의 개발에 대한 중요한 필요성이 여전히 존재합니다. 따라서, 시험관내(또는 생체내) 배설물 미생물 배양 시스템의 사용은 이러한 내정간섭의 효과를 연구하는데 유용할 것이다11,12. 구체적으로, 장내 미생물의 다양성과 조성, 배설물 pH 및 SCFAs 및 락테이트를 포함한 미생물 대사산물의 주기적인 변화의 관점에서 미생물발효 능력에 대한 상이한 프리바이오틱스의 효과를 연구할 수 있다. 13.본 명세서에서, 이눌린(가장 널리 연구된 프리바이오틱 성분 중 하나)을 마이크로바이브로메 변조기의 예로 사용하여, 이러한 간단한 생체내 미생물 배치 배양 시스템의 단계별 프로토콜을 사용하여 이를 추정하는 데 그 사용을 입증하는 것으로 설명되어 있다. 대변 미생물 및 미생물 대사 산물의 변화는 미생물 군변기와 의한 개입에 따른다.
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Protocol
주의: 적절한 재료 안전 데이터 시트를 참조하고 적절한 생물 안전 수준 2(BSL-2) 교육에 대한 지침과 지침을 따르십시오. 표준 생물 안전 규칙에 따라 모든 배양 단계를 따르고 무균 조건을 사용하여 BSL-2 캐비닛을 사용합니다. 게다가, 다른 모형 및 인간 적인 과목에서 배설물 견본은 미생물 매개 질병 퍼짐의 잠재적인 리스크가 있을 수 있습니다. 부상과 감염이 발생하면 즉시 의료 지원을 받으십시오. 또한, 인간과 동물의 대변 샘플의 사용은 기관 윤리위원회를 통해 승인되어야하며 샘플 및 주제 정보를 사용하는 프로토콜을 준수해야합니다.
1. 문화매체 준비
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문화 매체 준비, 9가지 유형의 재고 솔루션 준비
- 용액 A (1,000 mL): 염화나트륨 5.4 g (NaCl), 2.7 g의 칼륨 이수소 인산염 (KH2PO4),0.16 g의 염화칼슘 디하이드레이트 (CaCl2·2H2O), 0.12 g의 염화나트륨 헥사하이드레이트(MgCl 2Cl) ·6H2O), 망간 염화물 테트라하이드레이트 0.06 g(MnCl2·4H 2O), 코발트염화헥사하이드레이트 0.06 g(CoCl 2·6H2O),황산암모늄 5.4 g(NH4)2SO4 1,000 mL에 총 볼륨을 만들기 위해 탈이온 수에서.
- 용액 B (1,000 mL): 탈이온수에서 2.7 g의 칼륨 수소 인산염 (K2HPO4)을 용해하여 총 부피를 1000 mL로 만듭니다.
- 미량 미네랄 용액 (1,000 mL): 디틸렌디아민 테트라 아세테이트 이수산염 500 mg (Na2EDTA), 철 황산염 헵타하이드레이트 200 mg (FeSO4·7H 2O), 10 mg의 황산테 헵타하이드레이트(ZnSO4) ·7H2O), 망간 3 mg(II) 염화물 테트라하이드레이트(MnCl2·4H 2O), 인산 30 mg(H3 PO4),CoCl2·6H 2O, 컵릭 염화물 이수산 1mg(CuCl2) ·2H2O), 2 mg의 니켈(II) 염화물 헥사하이드레이트(NiCl 2·6H 2O) 및 몰리브데이트 나트륨 3 mg(Na2MoO4·2H 2O)을 탈이온수에서 1,000 mL로 총 부피를 만든다.
참고: 이 솔루션은 빛에 민감하므로 어두운 / 검은 색 또는 알루미늄 포장 튜브 / 병에 보관해야합니다. - 수용성 비타민 용액 (1,000 mL): 티아민 염산 100 mg (티아민-HCl), D-판토테닉 산 100 mg, 니아신 100 mg, 피리독신 100 mg, P-aminobenzoic 산 5 mg, 비타민 B12 0.25 mg을 용해하십시오. 1,000 mL.
- 엽산: 비오틴 용액 (1,000 mL): 엽산 10 mg, D-비오틴 2 mg, 중탄산 암모늄 100 mg(NH4HCO 3)을 탈이온수에 용해하여 총 부피를 1,000 mL로 만듭니다.
- 리보플라빈 용액(1,000 mL): 리보플라빈 10 mg을 5mM HEPES(1.19 g/L) 용액에 녹여 총 부피를 1,000mL로 만듭니다.
- 헤민 용액 (10 mL): 10 mMM 수산화 나트륨 (NaOH) (0.4 g / L) 용액에 헤민 5,000 mg을 용해하여 총 부피를 10 mL로 만듭니다.
- 짧은 사슬 지방산 혼합 (10 mL): N-valerate의 2.5 mL, 이소발레의 2.5 mL, 이소부티레이트 2.5 mL 및 2.5 mL: DL-α-메틸부티레이트.
참고: 이 솔루션은 냄새와 연기를 피하기 위해 연기 후드에 사용하는 것이 좋습니다. - Resazurin (1,000 mL): 탈이온수에서 레사주린 1 g을 녹이고 총 부피를 1,000 mL로 만듭니다.
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시험관 내 혐기성 발효에 사용되는 배지
- 이 매체를 준비하려면 용액 A 330 mL, 용액 B 330 mL, 미량 미네랄 용액 10 mL, 수용성 비타민 용액 20 mL, 엽산 5 mL : 비오틴 용액, 5 mL의 리보플라빈 용액을 혼합하십시오. 헤민 용액의 2.5 mL, 짧은 사슬 지방산 혼합의 0.4 mL, Resazurin의 1 mL, 효모 추출물 0.5 g, 탄산 나트륨 4 g (Na2CO3),0.5 g의 시스테인 HCl-H2O, 및 0.5 g의 트립티케이스를 첨가하고, 증류수 296.1 mL을 첨가한다.
- pH를 확인하고 7.0 정도인지 확인하십시오( 그렇지 않은 경우)는 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 pH를 조정합니다. 무균 워크스테이션 하에서 병 필터를 사용하여 매체를 진공 여과하여 살균합니다.
- 또는 모든 성분(비타민 및 헤민 용액 제외)과 오토클레이브를 121°C에서 20분간 혼합하고 실온으로 식힙니다. 동시에 0.22 μm 멤브레인 필터를 사용하여 비타민과 헤민 용액을 필터 살균하고 분주하기 전에 오토클레이브 및 냉각 매체에 첨가하십시오.
2. 혐기성 챔버 및 필수 재료의 준비
- 실험 시작 최소 48시간 전에 혐기성 챔버 내부의 발효 실험에 필요한 모든 재료, 용액 및 도구를 보관하여 완충제/용액의 공구 및 수용성 산소와 관련된 잔류 산소가 제거하고 모든 재료는 설정 혐기성 조건에 적응된다.
참고: 혐기성 챔버 내부에 필요한 물질 (48 시간 전에 실험을 시작): (i) 발효 매체; (ii) 혐기성 용액 (섹션 4.1에 따라 제조), (iii) 소용돌이, (iv) 계량 저울, (v) 모슬린 치즈 천, (vii) 깔때기, (viii) 1.5, 2.0, 15, 50 mL 튜브, (ix) 파이프터 (2, 20, 200 및 1,000 μt) 파이펫 및 피펫 (5 및 10 mL), (xi) 종이 조직, (xii) 마커, (xiii) 튜브는 다른 튜브, (xiv) 폐기물 상자, (xv)O2 표시기 및 (xvi) 70 % 에탄올 스프레이 병 (소독제).
3. 튜브 및 섬유의 준비
- 무게 300 mg의 이눌린을 50 mL 튜브로 이송한 후 혐기성 챔버에 이미 제조 및 저장된 발효매체 26 mL의 무균 첨가를 하였다. 각 대변 샘플 유형 및 실험 튜브(시험중인 화합물의 수에 따라)에 대해 하나의 빈 튜브를 삼중항으로 준비합니다.
- 발효 실험을 시작하기 전에 샘플의 수화를 허용하기 위해 약 24 시간 동안 혐기성 챔버 내부에이 튜브를 둡니다. 접종 시 튜브 온도가 37 °C인지 확인하고 혐기성 챔버 내에 둘러싸인 인큐베이터에 튜브를 가져 오십시오.
4. 접종준비
- 혐기성 희석 액 (발효 실험 전에 적어도 48 시간): NaCl 5 g, 포도당 2 g 및 시스테인-HCl 0.3 g을 탈이온수에서 용해시키고 총 부피를 1,000 mL로 만듭니다. Autoclave 및 사용 하기 전에 적어도 48 시간 혐 기성 챔버 안에 저장.
- 대변 접종 준비 (발효 실험 당일): 50 mL 원추형 튜브에 신선한 배설물 샘플 5g을 계량하고, 최종 부피 50 mL (1:10 w/v)에 혐기성 희석 액을 추가하고 15 분 동안 또는 완전히 균질화 될 때까지 소용돌이를 추가하십시오. 균질화된 혼합물을 4층의 멸균 치즈클로스(오토클레이브)를 통해 걸링하고 매체를 함유한 튜브에서 즉시 접종하는 데 사용한다.
참고: 실험 목적이 일반적으로 병에 걸린 배설물 microbiota 대 전반적인 건강에 주어진 화합물 /성분의 효과를 비교하는 경우 과목의 그룹에서 배설물 샘플풀 수 있습니다.
5. 발효 및 샘플링
- 섹션 4.2에 따라 튜브를 준비하고 희석 및 여과 된 배설물 접종4 mL로 빈 / 제어 및 실험 튜브를 접종하십시오. 혐기성 챔버 내부의 37°C에서 접종된 튜브를 배양한다. 섬유와 접종을 다시 중단부드럽게 반전하여 매 시간 마다 한 번 튜브를 흔들어.
- 필요에 따라 매시간 0, 3, 6, 9 및 24h로 매시간 시료를 수집하여 2 mL aliquot 샘플을 각각의 발효 튜브로부터 2 mL 튜브로 꺼내어 발효시.
- 실험실 pH 미터를 사용하여 aliquots의 pH를 측정합니다 (샘플에 pH 전극을 직접 삽입하여); 나머지 샘플을 4°C에서 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리합니다. 액체 질소에 상류층과 펠릿을 즉시 동결시키고, 스냅 동결 후, 상층부(scfa) 분석을 위해 상급체를 저장하고-80°C에서 미생물군유전체 분석을 위한 펠릿을 저장한다.
6. 짧은 사슬 지방산 (SCFA) 및 젖산 정량화
참고: 미생물군유전체 배양의 상급제에서의 SCFA 및 락테이트는13,14,15,16의 다른 곳에 상세한 방법에 따라 정확하게 측정될 수 있다.
- 간단히, 얼음에 제어 및 처리 샘플에서 섹션 5에서 얻은 스냅 냉동 초자연자를 해동하고 얼음에 대한 모든 추가 처리 단계를 수행합니다. 0.45 μm 멤브레인 필터를 통해 상판체를 걸러내고 무세포 샘플을 사용하여 HPX-87H 컬럼이 장착된 210nm의 DAD 검출기를 사용하여 HPLC 시스템을 사용하여 SCFA 및 젖산의 농도를 측정합니다. 각 샘플에 대해 10 μL의 주입 부피를 사용하고 H2SO4 (0.005 N)를 사용하여 35 °C에서 0.6 mL / min의 유량으로 컬럼을 용출하십시오.
7. 배설물 미생물군유전체 분석
참고: 7,13,14,17의 방법 및 파이프라인에 따라 미생물군유전체 분석을 수행한다.
- 간략하게, 배설물 DNA 추출 키트(13)를 이용하여 약 200mg의 배설물 슬러리 펠릿으로부터 게놈 DNA를 추출한다.
- 13에 기재된 방법에 따라 바코드된 프라이머를 이용하여 세균 16S rRNA 유전자의 초가변 영역을 증폭하고, 지구 미생물군유전체 프로젝트 프로토콜(18)에 기재된 바와 같은 프라이머 서열을 사용한다.
- 자기 정제 비드로 결과 앰플리콘을 정화하고 Picogreen 또는 동등한 방법으로 정량화. 정제된 PCR 제품을 시퀀서(13)에 동등한어금니 농도 및 서열로 풀.
- 다중화, 품질 필터링 및 클러스터링, 분류학적 할당 및 희귀도, 미생물 생태학(QIIME) 소프트웨어에 대한 정량적 통찰력을 사용하여 다운스트림 분석을 위한 결과 시퀀스를 처리합니다. 카포라소 외19.
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Representative Results
이 프로토콜은 특정 프리바이오틱(즉, 대변 pH의 변화 및 건강한 인간 피험자의 대변에서 젖산 및 SCFA의 농도 측면에서 미생물 구성 및 대사 활동에 대한 이눌린)의 효과를 입증하는 데 사용됩니다. 이눌린으로 치료 후 다른 시간 포인트). 배설물 pH, 젖산 및 SCFA의배설물 수준(그림 1), 및 미생물 구성 (그림2 및 그림3)은 이눌린유무에 관계없이 배양의 0(baseline), 9 및 24h의 배양에서 측정된다. 결과는 배설물 microbiota 조성물 및 그것의 신진 대사 활동이 이눌린 처리의 유무에 관계없이 시험관 내 발효 도중 변조되는 방법을 보여줍니다.
그림 1: 배설물 pH의 변화 (a), 젖산 (b) 및 짧은 사슬 지방산 의 변화. 아세테이트 (c), 프로피오네이트 (d) 및 부티레이트 (e) 0 (기준선), 9 및 24 이눌린 없이 혐기성 발효의 시간. 여기에 제시된 값은 삼중항 샘플의 평균 ± SEM입니다. * P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, 대 기준선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인간 대변에서 의 미생물 다양성 및 조성물의 변화는 0(기준선), 9 및 24시간의 혐기성 발효유무에 관계없이 이눌린을 유무에 관계없이. (a) 원리 좌표 분석(PCoA)을 사용하여 시각화된 베타 다이버시티에 대한 가중치 가중치 및 (b) 무가중치 측정값입니다. (c-f) 알파-다이버시티 비주얼라이제이션 지수(PD 전체 나무 (c); 종 풍부성(Chao1; d) 운영 분류 단위 (OTUs, 전자)의 관찰 된 수; 종 균등성 (섀넌 지수, f)). 주요 필라 (g) 및 제네라 (h)의 상대적 풍부. 여기에 제시된 값은 삼중항 샘플의 평균 ± SEM입니다. * P < 0.05, **P < 0.01, 대 기준선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 선형 판별 분석(LDA) 효과 크기(LEfSe) 9시간 및 24시간 배양 후 의 장내 미생물 변화(INU) 또는 (CTL) 이눌린 이눌린 이눌린 이질. 16S 서열의 LEfSe 분석에서 파생된 분류학적 클라도그램 (상대 풍부도 ≥ 0.5%) 샘플의 다른 그룹 사이의 차별화 풍부한 taxa를 나타냅니다. 각 점의 밝기는 효과 크기(예: 분류 풍부)에 비례합니다. LDA 임계값 >2.4를 통과하는 taxa만 여기에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 시험관 내 배설물 슬러리 발효 모델은 인간 배설물 미생물의 조성에 대한 다른 기질 및 미생물 균주 (예를 들어, 프리 바이오틱스 및 프로바이오틱스)의 효과를 근사화하는 간단한 단일 배치 모델입니다. 대변 pH 및 SCFAs 수준의 신진 대사 활동. 본 명세서에 제시된 결과는 이눌린의 접종이 배설물 pH를 감소시키고 비처리된 배설물 미생물 배양에 비해 이눌린 처리된 배설물시편에서 SCFA 및 젖산의 수준을 현저하게 증가시킨다는 것을 입증한다(도 1). 또한, 장내 미생물 시그니처는 또한 이눌린 처리 및 미처리 샘플 간에 상이한 것으로 보인다(도2 및 도3). 이 데이터는 이 시스템이 배설물 미생물군유전체의 다양성과 조성뿐만 아니라 대사 활동에 대한 이눌린의 효과를 어떻게 반영할 수 있는지를 보여줍니다. 또한, 특정 실험 목표 및 가설에 따라, 다른 요인의 다양한 또한이 시스템을 사용하여 측정 할 수있다. 또한, 16S rRNA 유전자 시퀀싱 이외에, 전체 미생물 메타게놈 시퀀싱(전체 게놈 시퀀서 사용) 또는 qPCR 및 특정 단일 또는 다중 계보, 종 및 균주(예를 들어, 비피도박테리아, 락토바실리, 아케르만시아, 엔테로박테리아,클로스트리디아 등) 실행할 수도 있습니다. 또한 LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID 및 HPLC와 같은 SCFA 분석을 위한 다양한 크로마토그래피 절차도 실험 요건 및 가용성에 따라 악용될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 절차에 대한 샘플 준비는 작동(20)에 필요한계측기 및 조건에 따라 달라질 수 있음을 주목해야 한다.
신선한 배설물 표본의 사용은 최고의 재현 결과를 얻을 수 있지만; 그러나, 스냅 냉동 배설물 샘플(본원에 제시된 실험에서 사용된 바와 같이)은 또한 대부분의 박테리아가 체온으로 소생되고동결(21)후에 더 이상 분해가 일어나지 않도록 그것에서 부활될 수 있기 때문에 효과적으로 사용될 수 있다. 동결된 샘플을 사용하는 것은 실험 당일에 특정 기증자로부터 신선한 배설물 샘플을 얻을 수 없거나 실험을 복제해야 할 때 동일한 공여자로부터 얻을 수 없을 때 특히 유리할 수 있습니다. 그러나 배설물 샘플은 액체 질소를 사용하여 냉동하고 추가 사용 이 될 때까지 -80 °C에서 즉시 보관해야합니다. 또한, 공기 (산소)에 냉동 배설물 샘플의 노출을 방지하기 위해, 샘플은 가능한 한 빨리 혐기성 챔버로 전송되어야한다 / 즉시 냉동실에서 꺼내 즉시 사용 (반복 해동은 피해야한다). 시료 해동, 접종 준비 및 처리를 포함한 모든 후속 실험은 혐기성 챔버 내부에서 이루어져야 합니다.
장내 유기 환경 과 pH 는 특히 비정상적으로 감소 된 pH가 기질 활용으로 인한 산도 증가를 나타낸다는 사실에 비추어 매우 중요합니다. 따라서, 보다 신속한 pH 감소는 보다 빠른 기판이용률(22)에대응할 수 있다. 이 모델에서는 pH가 제어되지 않았지만 동일한 비처리 제어를 포함하면 직접 비교하는 것이 좋습니다. 창자 microbiota에 의하여 소화되지 않는 다당류의 발효 결과로 결장에서 생성된 SCFA는 호스트 건강의 유지와 관련있는 다양한 기계장치에 추가 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 대사 산물은 글루코네오제네시스와 지질 생합성에 기여하고, 대장세포의 에너지원으로 작용하며, 면역 조절, 제어/개선된 장 장벽 기능 및 신경 변조 를 포함한 건강상의 이점을 가질 수 있습니다23. 24,25,26. 또한, SCFA는 호르몬, 엔도칸나비노이드 시스템, 세포 증식 및 사망, 뼈 건강, 미네랄 흡수, 장 운동성, 장 내 pH 및 장내 미생물군유전체에 대한 반전 효과를 포함한 여러 생물학적 경로에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 미생물 대사 기능. 따라서, 장/대변 SCFA의 프로파일 및 농도에 대한 지식은 특정 미생물 조절제 6의 효능을 평가하면서중요한 구성 요소가 될 수 있다. 물론, SCFA 외에, 창 자 microbiome 또한 많은 다른 중요 한 대사 산물을 생산 (예를 들어, 암모늄, 비타민, 히 스타 민). 따라서, 이러한 체외 발효 실험 중에 수집된 상층 표본은 또한 특정 미생물군유전체 조절기에 의해 영향을 받을 수 있는 새로운 장내 미생물군유전체 유래 대사산물을 발견하기 위해 글로벌 대사체학 분석을 위해 평가될 수 있다.
여기서 설명된 시스템은 실험 설정의 용이성, 단순성, 비용 효율성 및 일반적인 채택 가능성과 같은 많은 장점을 가지고 있습니다. 그러나 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 예를 들어, 시스템은 대장의 미생물에 노출되기 전에 상부 소화 시스템 (예 : 타액, 위, 소장)에서 prebiotics (또는 다른 내정간섭)의 상호 작용과 관련이 없습니다. 그러나 이러한 단계는 특정 실험 요구 사항에 따라 채택및 통합될 수 있습니다. 또한, 산성 및/또는 효소 가수분해 과정은 이러한 식품의 소화가 안되는 부분만이 하부에 의해 발효될 수 있기 때문에 전체 식품 또는 소화성 식품을 포함한 특정 기질을 사용하는 경우 발효 전에 수행되어야 할 수도 있습니다. 장 내 미생물. 또한, 창 자 microbiota의 조성 발효 동안 특정 배양 조건으로 인해 이동할 수 있습니다. 예를 들어, 최대 9시간의 배양, 미생물 학적 변화가 24 시간보다 정상에 훨씬 가깝다는 것이 관찰되었습니다. 그러나, 배양 후 24 시간, 비록 pH와 SCFA 수치가 실질적으로 증가, 창 자 microbiota 조성물 미생물 다양성 감소 하는 동안 프로 테오 박테리아 카운트 증가 보여주었다. 그러나, 낮게 배설물 pH를 수반하는 미생물 대사 산물의 증가된 축적이 특정 미생물 서명과 얼마나 정확하고 밀접하게 연관되는지는 알려지지 않았다.
요약하면, 생체내 미생물 생태계를 시뮬레이션하는 간단한 프로토콜이 본원에 기재되어 있다. 이 시스템은 연구원이 호스트 장 및 전반적인 건강의 다양한 기능에 영향을 미칠 수있는 미생물 다양성, 구성 및 대사 기능의 변조에 대한 다른 개입을 테스트 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 감사하게도 당뇨병, 비만 및 물질 대사 및 임상 및 번역 과학 센터, 의학의 웨이크 포레스트 학교, 국방부 자금 조달 (보조금 번호: W81XWH-1-0118)의 자금 지원을 인정합니다. 커밋 글렌 필립스 II 심장 혈관 의학의 의자; 건강의 국가 학회는 클로드 D. 페퍼 이전 미국인 센터 자금 (P30AG12232에 의해 자금); R01AG18915; R01DK114224 및 임상 및 번역 과학 센터 (UL1TR001420에 의해 투자 된 임상 연구 단위), 또한 고맙게도 인정. 우리는 또한 대변 샘플을 제공 해 자원 봉사자에 대 한 감사, 그리고 그들의 기술 적인 도움에 대 한 우리의 다른 실험실 구성원이 이 실험 동안.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
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