Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Skreddersy in vivo cytotoksisitet analyser for å studere Immunodominance i tumor spesifikke CD8+ T celle svar

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59531
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Western University, 2Department of Medicine, Division of Clinical Immunology and Allergy, Western University, 3Department of Surgery, Division of General Surgery, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Vi beskriver her en flyt flowcytometri-basert in vivo drap analysen som muliggjør undersøkelse av immunodominance i cytotoksisk T-lymfocytter (CTL) svar på en modell svulst antigen. Vi gir eksempler på hvordan denne elegante analysen kan være ansatt for mekanistisk studier og for narkotika effektivitet testing.

Abstract

Carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE)-basert in vivo cytotoksisitet analyser muliggjøre sensitiv og nøyaktig kvantifisering av CD8+ cytolytisk T-LYMFOCYTTER (CTL) respons elicited mot tumor-og patogen-avledede peptider. De tilbyr flere fordeler fremfor tradisjonelle draps analyser. Først tillater de overvåking av CTL-mediert cytotoksisitet innen arkitektonisk intakt sekundære lymfoide organer, vanligvis i milten. For det andre tillater de for mekanistisk studier under priming, effektor og tilbakekalling faser av CTL svar. For det tredje gir de nyttige plattformer for vaksine/legemiddel effekt testing i en virkelig in vivo-innstilling. Her gir vi en optimalisert protokoll for undersøkelse av samtidig CTL svar mot mer enn ett peptid epitope av en modell tumor antigen (AG), nemlig Simian virus 40 (SV40)-kodet store T AG (T AG). Som de fleste andre klinisk relevante tumor proteiner, havner T AG mange potensielt immunogenic peptider. Imidlertid induserer bare fire slike peptider gjenkjennelige svar på CTL i C57BL/6 mus. Disse svarene er konsekvent arrangert i en hierarkisk rekkefølge basert på deres størrelse, som danner grunnlaget for TCD8 "immunodominance" i denne kraftige systemet. Følgelig er det meste av T AG-spesifikke TCD8 Response fokusert mot en enkelt immunodominant epitope mens de tre andre epitopes er anerkjent og reagert på bare svakt. Immunodominance kompromisser bredden av antitumor TCD8 svar og er, som sådan, anses av mange som et hinder for vellykket vaksinasjon mot kreft. Derfor er det viktig å forstå de cellulære og molekylære faktorene og mekanismene som dikterer eller former TCD8 immunodominance. Protokollen vi beskriver her er skreddersydd til etterforskningen av dette fenomenet i T AG immunisering modellen, men kan lett endres og utvides til lignende studier i andre tumor modeller. Vi gir eksempler på hvordan effekten av eksperimentelle immunotherapeutic intervensjoner kan måles ved hjelp in vivo cytotoksisitet analyser.

Introduction

Konvensjonelle CD8+ t celler (TCD8) spille viktige deler i anticancer uimottakelig overvåking. De primært fungere i egenskap av cytolytisk T-lymfocytter (CTLer) som anerkjenner tumor spesifikke eller-assosiert peptid antigener (AGS) vises innenfor den lukkede kløft av store histocompatibility kompleks (MHC) klasse I molekyler. Fullt bevæpnet CTLer utnytte sine cytotoksisk Arsenal å ødelegge ondartede celler. Anticancer TCD8 kan påvises i sirkulasjon eller til og med innenfor primære og metastatisk masser av mange kreftpasienter og tumor-bærende dyr. Men de er ofte anergic eller utmattet og ikke klarer å utrydde kreft. Derfor er mange immunotherapeutic modaliteter utformet for å øke anticancer TCD8 frekvenser og å gjenopprette og øke deres funksjoner.

Tumor proteiner havn mange peptider, hvorav noen kan være immunogenic og potensielt immunoprotective. Men målbare TCD8 svar er elicited med varierende magnitudes mot noen peptider bare. Dette skaper en "immunodominance hierarki" blant TCD8 kloner1. Følgelig immunodominant (ID) TCD8 okkupere fremtredende hierarkiske rekkene, som vanligvis bedømmes av deres overflod. TCD8 celler som t celle RESEPTOR (TCR) er spesifikk for SUBDOMINANT (SD) epitopes forekomme i lavere frekvenser. Vi og andre har identifisert noen av faktorene som dikterer eller former immunodominance i TCD8 svar. Disse inkluderer blant annet modus for AG presentasjon til naiv TCD8 (dvs. direktepresentasjon, kryss-presentasjon, cross-dressing)2,3,4, den type Ag-presentere celler (APCs) deltakelse i TCD8 aktivisering5, overflod og stabilitet av protein AGS og effektivitet og Kinetics av deres degradering av proteasomes7,8, den relativ selektivitet av transporter assosiert med AG Processing (trykk) for peptider9, affinitet av frigjort peptider for MHC i molekyler9,10, tilstedeværelse, forløper frekvenser og TCR mangfold av beslektet tCD8 i T celle Pools11,12,13, kryss-konkurranse blant T celler for tilgang til APCs14,15, og fratricidal kapasitet på TCD8 kloner16. I tillegg er TCD8 immunodominance utsatt for immunoregulatory mekanismer formidlet av flere Suppressor celletyper som naturlig forekommende regulatoriske T (nTreg) celler17, cellen overflaten co-hemmende molekyl programmert Death-1 (PD-1)16, og visse intracellulære enzymer som indoleamine 2, 3-DIOXYGENASE (Ido)18 og pattedyr målet for Rapamycin (mTOR)19. Det er imidlertid viktig å merke seg at de ovennevnte faktorene ikke alltid fullt ut står for immunodominance.

Bortsett fra den grunnleggende biologi av TCD8 immunodominance, undersøkelse av dette spennende fenomenet har viktige implikasjoner i kreft immunologi og immunterapi. Først en ID-status ikke nødvendigvis konferere på en gitt TCD8 klone evnen til å forebygge tumor initiering eller progresjon20. Hvorvidt og hvordan ID og SD TCD8 bidra til antitumor immunitet kan være avhengig av type og omfanget av kreft og det eksperimentelle systemet ansatt. For det andre er det antatt at ID TCD8 kloner kan være "for synlig" for immunsystemet og følgelig mer utsatt for sentrale og/eller perifere toleranse mekanismer16,21. Tredje, heterogeneic svulster kan inneholde neoplastic celler som unngår påvisning av mange, om ikke de fleste, CTLer ved å vise bare et smalt spektrum av peptid: MHC komplekser. Under disse omstendighetene, TCD8 svar av utilstrekkelig bredde er sannsynlig å ha råd til slike tumorceller en overlevelse fordel, og dermed poten sine utvekst22. Det er for de ovennevnte grunnene til at mange ser immunodominance som et hinder for vellykket TCD8-basert vaksinasjon og behandling mot kreft.

Inoculation av C57BL/6 mus med Simian virus 40 (SV40)-transformert celler som uttrykker store tumor AG (T AG) gir et kraftig prekliniske system for å studere TCD8 immunodominance. Denne modellen tilbyr flere fordeler. For det første er peptid-epitopes av denne klinisk relevante oncoprotein godt karakterisert i denne muse belastningen23 (tabell 1). For det andre, T AG epitopes, som kalles områder I, II/III, IV og V, utløser TCD8 svar som er konsekvent arrangert i følgende hierarkisk rekkefølge: site IV > > området jeg ≥ site II/III > ≫ område V. Følgelig, område IV-spesifikke TCD8 Monter den mest robuste responsen til T AG. I kontrast, nettsteder I og II/III er subdominant, og nettstedet V-spesifikke TCD8 er minst rikelig og vanligvis bare oppdages i fravær av respons til andre epitopes23,24. Tredje, T AG+ tumor cellelinje benyttet i protokollen beskrevet her, nemlig C57SV fibrosarcoma celler, og de som brukes i våre tidligere undersøkelser16,17,18,19 ,25,26, blir forvandlet med subgenomic SV40 fragmenter25. Derfor er de ikke i stand til å montere og frigi SV40 virions som potensielt kan infisere verten APCs. I tillegg C57SV celler er blottet for klassiske costimulatory molekyler som CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), og CD137 ligand (4-1BBL)16. Attributtene ovenfor gjør disse linjene ideelle for undersøkelse av in vivo TCD8 aktivering via kryss-grunning. Cross-priming er en viktig vei i inducing TCD8 svar, spesielt de lansert mot tumorceller av ikke-blodkreft opprinnelse som ikke direkte Prime naiv T-celler25.

Antitumor TCD8 frekvenser og/eller funksjoner kan OVERVÅKES av MHC jeg tetramer farging, intracellulære farging for effektor cytokiner (f. eks, INTERFERON [IFN]-γ) eller lytisk molekyler (f. eks, perforin), enzym-knyttet Immunospot (ELISpot) analyser og ex vivo cytotoksisitet analyser. Siden oppstarten i 1990-årene27,28, carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE)-basert in vivo drap analysene har aktivert evaluering av cytotoksisk svar formidlet av antiviral CTLer29,30 , 31, antitumor CTLer16,32, Natural Killer (NK) celler33, glycolipid-reaktiv invariant Natural killer T (iNKT) celler34, og eksisterende og de Novo donor-spesifikke alloantibodies26. Derfor kan deres programmer være av interesse for et bredt lesekretsen, inkludert men ikke begrenset til etterforskere som arbeider i de områdene av tumor immunologi og immunterapi, anti-patogen immunitet, og forebyggende og terapeutiske vaksine design.

For å vurdere celle-mediert cytotoksisitet i typiske scenarier, to populasjoner av naive splenocytes som viser enten en irrelevant AG eller en beslektet AG (s) er merket med to forskjellige doser av CFSE, blandet i like tall og injisert i naiv (kontroll) eller killer celle-harboring mus. Tilstedeværelsen/fraværet av hver mål populasjon undersøkes deretter av strømnings flowcytometri.

Vi har optimalisert og ansatt i vivo Killing analyser i våre studier på immunodominance i både antivirale og antitumor TCD8 svar12,16,17. Her gir vi en detaljert protokoll for samtidig vurdering av ID og SD TCD8 svar til T AG epitopes, som lett kan vedtas for lignende undersøkelser i andre eksperimentelle systemer. Vi gir også representative resultater som viser at nTreg celle tømming og PD-1 blokade kan selektivt forbedre ID TCD8-og SD tCD8-indusert cytotoksisitet, henholdsvis. På slutten, vil vi diskutere flere fordeler med in vivo drap analyser samt noen av deres iboende begrensninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentene beskrevet her følger dyr bruker protokoller godkjent av institusjonelle enheter og overholdt etablerte nasjonale retningslinjer.

1. inoculation av C57BL/6 mus med T AG-uttrykke tumor celler

  1. Grow den SV40-transformert fibrosarcoma cellelinje C57SV (eller en lignende T AG+ tilhenger cellelinje) i Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) med 4,5 g/l D-glukose og L-glutamin (1x) og supplert med 1 mm natrium pyruvat og 10% varme-deaktivert Foster storfe serum (FBS) i vev kultur-behandlede flasker ved 37 ° c i fuktet atmosfære som inneholder 10% CO2.
  2. Når cellene blir fullt confluent eller litt overconfluent, forsiktig fjerne og forkaste mediet og skyll monolag med pre-varmet sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS).
    Merk: maksimalt T AG-uttrykk oppnås når T AG+ celler nå 100% confluency.
  3. Inne i en biologisk sikkerhetskabinett, legge pre-varmet Trypsin-EDTA (0,25%) å dekke monolag ved romtemperatur til cellene er forskyves i flekker. Trykk på sidene av kultur flasken (e) flere ganger for å frigi de resterende tilhenger cellene.
    Merk: om nødvendig og for å fremskynde trypsinization prosessen, Overfør flasken (e) inn i en 37 ° c inkubator. Forskyves celler vil raskt vedta en avrundet form under et lett mikroskop. Dette trinnet skal vare ca 5 min.
  4. Tilsett 5 mL DMEM-medium og distansere klumper for å forberede en enkelt celle suspensjon ved å pipettering innholdet i hver kolbe opp og ned.
  5. Overfør cellen suspensjon gjennom en celle sil med 70-μm porene i et rør.
  6. Snurr ned røret ved 400 x g i 5 min ved 4 ° c.
  7. Kast supernatanten. Resuspend pelleted celler i 10 mL sterilt kulde PBS.
  8. Gjenta trinn 1,6 og 1,7 to ganger.
  9. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Forbered en ensartet suspensjon som inneholder 4 x 107 celler/ml steril PBS.
  10. Injiser 500 μL av suspensjonen over intraperitonealt (IP) i hver voksen (6-12-ukers) hann-eller hunn C57BL/6-mus.

2. behandling regimer

  1. Behandling regime å undersøke bidraget av nTreg celler til TCD8 Immunodominance
    1. Fire dager før in vivo priming av C57BL/6 mus med C57SV celler (trinn 1,10), injisere hvert dyr en gang IP med 0,5 mg av en lav-endotoksin, Natriumazid-Free anti-CD25 monoklonale antistoff (mAb) (klone PC-61.5.3), som reduserer nTreg celler, eller med en rotte IgG1 isotype kontroll (for eksempel klone KLH/G1-2-2, klone HRPN, eller klone TNP6A7).
  2. Behandling regime å teste in vivo betydningen av PD-1-PD-L1 (2) interaksjoner i Shaping TCD8 Immunodominance
    Merk: engasjementet til PD-1 av PD-L1 ofte, men ikke alltid, formidler co-hemming og/eller utmattelse av AG-spesifikke TCD8. Derfor kan behandling med anti-PD-1 utføres parallelt med administrering av anti-PD-L1 og anti-PD-L2 mAbs å avdekke nøyaktig intercellulære interaksjon involvert i et biologisk fenomen.

3. utarbeidelse av Target Splenocytes

  1. Euthanize sex-matchet naiv C57BL/6 mus (6-12 ukers alder) som vil tjene som splenocyte donorer ved cervical forvridning.
  2. Plasser hver mus med buken vendt opp inne i et biologisk sikkerhetskabinett. Spray huden med 70% (v/v) EtOH. Ved hjelp av steril tang og saks, løft huden og lage en liten ventrale midtlinjen snitt. Så, kutt huden inne en krysset-like moten å vise frem det peritoneum.
  3. Bruke tang, trekke opp peritoneum i en telt-lignende måte uten snatching noen av de indre organene. Skjær peritoneum åpne for å avdekke bukhulen og forsiktig fjerne milten.
  4. Plasser milten (e) inne i en 15 mL Dounce vev kvern som inneholder 5 mL sterilt PBS. Påfør manuelt trykk ved hjelp av jeksel glass stempelet til milt vevet avleder inn i en rød homogen celle suspensjon.
    Merk: avhengig av antall mottaker dyr per eksperimentell gruppe, kan flere donor mus spleens være nødvendig for målet celle forberedelse. Opp til 3 spleens kan homogenisert sammen inne i en 15 mL jeksel.
  5. Overfør homogenate til et 15 mL rør. Snurr ned røret ved 400 x g i 5 min ved 4 ° c.
  6. Kast supernatanten. Resuspend pelleted celler i 4 mL av ammonium-klorid-kalium (ACK) lysering buffer for 4 min for å eliminere erytrocytter.
    Merk: Dette er et tidsfølsomt trinn. Overexposing splenocytes til ACK lysering buffer vil øke sin skjørhet og gjøre dem mottakelige for ikke-spesifikk celle død.
  7. Til hvert rør legger du til 8 mL RPMI 1640 medium som inneholder 10% varme-deaktivert FBS, L-alanyl-L-glutamin, 0,1 mM minimum essensielle medier (MEM) unødvendige aminosyrer, 1 mM natrium pyruvat, 10 mM HEPES og 1x penicillin/Streptomycin, som heretter vil bli referert til som komplett RPMI medium (tabell av materialer).
  8. Overfør innholdet gjennom 70 μm porene i en celle sil inn i en ny 15 mL tube.
  9. Snurr ned røret ved 400 x g i 5 min ved 4 ° c.
  10. Kast supernatanten. Resuspend pelleted celler i 12 mL av komplett RPMI.
  11. Splitt splenocyte suspensjonen i 3 like deler (4 mL hver) i 3 separate rør.

4. belegg Target Splenocytes med irrelevante og beslektet peptider

  1. Merk rørene i henhold til peptider som skal brukes til puls mål splenocytes. Kontroll splenocytes vil være pulserende med en irrelevant peptid, og hver populasjon av beslektet målet splenocytes vil være pulserende med en syntetisk peptid som tilsvarer T AG-avledet immunodominant epitope (Site IV) eller en subdominant T AG epitope (Site I eller nettsted II/III) (tabell 1).
    Merk: valget av irrelevante peptider avhenger av eksperimentell oppsett og musen belastningen brukes i hver undersøkelse. Forfatterne bruker ofte gB498-505 (en h-2kb-begrenset immunodominant peptid epitope av HERPES simplex virus [HSV]-1) og/eller GP33-41 (en H-2Db-begrenset immunodominant peptid epitope av lymfatisk choriomeningitis-viruset ([LCMV]) i C57BL/6-mus (tabell 1). Disse peptider er optimale valg fordi: (i) de er avledet fra patogener ikke tidligere oppstått i muse modellen beskrevet her; (II) ligner på T AG-avledede peptider, gB498-505 og GP33-41 er begrenset av og binder seg til H-2b molekyler. I ' tre-peak ' in vivo drap analyser, hver av de to toppene som tilsvarer beslektet Target celler kan representere splenocytes pulserende med en immunodominant eller subdominant peptid. Valget av hver peptid sett varierer i henhold til målene for hvert eksperiment. Se figur 1 og figur 2 som eksempler på slike variasjoner. For resten av denne protokollen, T AG-avledet nettsteder I og IV vil representere subdominant og immunodominant peptider, henholdsvis.
  2. Puls innholdet i hvert merket rør med 1 μM av de respektive peptid for 1 t ved 37 ° c og 5% CO2.
  3. Bruk en separat celle sil (med 70-μm porer) for hvert rør for å fjerne klumper og rusk om nødvendig.
  4. Snurr ned røret ved 400 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten.
  5. Resuspend pelleted celler i 12 mL steril kald PBS og gjenta trinn 4,4 igjen.
    Merk: det er viktig å fjerne så mye FBS som mulig fordi FBS kan binde CFSE i neste trinn.

5. merking av mål splenocytes med CFSE

  1. Resuspend peptid-pulserende splenocytes i 4 mL sterilt PBS.
  2. Legg CFSE på 0,025 μM, 0,25 μM, og 2 μM inn i rørene som inneholder irrelevant peptid-, site I-, og nettstedet IV-pulserende splenocytes, henholdsvis.
    Merk: for å oppnå ensartet CFSE-merking, hold hvert rør i en 45 ° vinkel før du legger CFSE til siden litt over celle fjæringen, etterfulgt umiddelbart av skånsom virvlingen. Dette vil sikre utseendet av glatte histogrammer på slutten. Batch-til-batch-og Aldersavhengige variasjoner i CFSE-intensitet er ikke uvanlig. Derfor kan man trenge å eksperimentere med differensial CFSE doser før de bestemmer seg for optimale konsentrasjoner som skal brukes.
    FORSIKTIG: CFSE er giftig ved konsentrasjoner som er høyere enn 5 μM.
  3. Plasser rørene inne i en 37 ° c inkubator i 15 min og invertere dem en gang hver 5 min.
  4. Tilsett 3 mL varme-deaktivert FBS til hvert rør for å stoppe CFSE-reaksjonen. Topp opp innholdet med sterile PBS.
  5. Snurr ned røret ved 400 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten.
  6. Resuspend pelleted celler i 12 mL sterilt PBS og gjenta trinn 5,5.

6. undersøkelse av tilstrekkelig/lik CFSE merking av mål Splenocyte populasjoner

  1. Resuspend pelleted celler i 3 mL PBS.
  2. Rør forsiktig på rørene. Overføring 10 μL, hver, av CFSElav, CFSEIntermediate (int), og CFSEhøy celle suspensjoner i en 5 ml-bunnen polystyren FLUORESCENS-aktivert celle sortering (FACS) tube inneholder 200 μL av PBS.
  3. Avhøre celler ved hjelp av en Flow flowcytometer utstyrt med en 488 NM laser. Tegn en lymfocytter port basert på Forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) egenskaper av cellene før anskaffe 5000 hendelser som faller innenfor lymfocytter porten i FL-1 kanal.
  4. Innenfor det ' foreldre ' CFSE+ befolkning, tegn i tillegg histogram portene å identifisere CFSElav, CFSEint, og CFSEhøy subpopulasjoner.
  5. Bekreft like eller nær-likeverdige hendelses numre innenfor de tre portene. Om nødvendig, justere celle tall i "kilden" rør (trinn 6,1) før miksing og sprøytebruk målet splenocytes til naive og primet mus i § 7.

7. injeksjon av CFSE-merkede målceller til naive og T-AG-primet mottakere

  1. Vortex kilde rørene forsiktig. Overfør de tre CFSE-merket celle suspensjoner i like forhold til et nytt rør.
  2. Topp opp innholdet med sterile PBS.
  3. Snurr ned røret ved 400 x g i 5 min ved 4 ° c. Resuspend pelleted celler med steril PBS.
  4. Telle celler i trypan blå av en hemocytometer for å sikre cellulær levedyktighet på minst 95%.
  5. Juster volumet for å injisere 1 x 107 blandede målceller/200 μL PBS intravenøst (IV), via hale blodåre, i hver mottaker C57BL/6 mus.
    Merk: Oppbevar cellene på isen mellom injeksjoner. Bland målceller forsiktig før hver injeksjon. Ta opp nøyaktig injeksjons tid for hver mus, som vil avgjøre når dyret må euthanized. Det er viktig å holde varigheten av in vivo cytotoksisitet konsekvent blant alle dyrene i samme eksperiment.

8. innhenting av data

  1. To eller fire timer etter injeksjon av CFSE-merket målceller, euthanize mottakeren mus ved cervical forvridning.
    Merk: varigheten av in vivo cytotoksisitet kan variere avhengig av eksperimentell system ansatt, immunogenisitet av målet AGS, den forventede overflod av peptid antigen-spesifikke TCD8 i milten, og robusthet av deres lytisk funksjon blant andre faktorer.
  2. Fjern og behandle hver milt separat som i trinn 3.2 − 3.9.
  3. Kast supernatanten og resuspend de pelleted cellene i 3 mL PBS.
    Merk: Vær ekstra forsiktig med å håndtere milt vev og celle preparater ved 4 ° c eller på is før cytofluorimetric analyser. Dette er for å hindre fortsatt cytotoksisitet ex vivo.
  4. Overfør omtrent 1 x 107 celler fra hver behandlet milt til et rent FACS-rør.
  5. Avhøre celler umiddelbart ved hjelp av en strømnings flowcytometer utstyrt med en 488-NM laser. Tegn en lymfocytter gate basert på FSC og SSC egenskaper av cellene.
  6. Identifiser CFSE- mottakers SPLENOCYTES og CFSE+ overførte målceller. Tegn flere porter som kan romme distinkte CFSELow, CFSEintog CFSEhøy mål celle populasjoner.
  7. Få totalt 2000 CFSElave hendelser i FL-1-kanalen.

9. data analyse

  1. Beregn den spesifikke lyse sammensetningen av hver beslektet mål cellepopulasjon ved hjelp av følgende formel:
    % Spesifikk cytotoksisitet =Equation
    der hvor x = CFSEint/høy begivenhet antallet inne t AG-primet musen , y = CFSElav begivenhet antallet inne t AG-primet musen, en = CFSEint/høy begivenhet antallet inne naiv musen, og b = CFSElav begivenhet tall i naiv mus.
    Merk: i ' tre-peak ' cytotoksisitet analyser der den spesifikke lyse av mer enn én beslektet mål befolkning evalueres, er det ikke hensiktsmessig å bruke målet celle frekvenser. Dette er rett og slett fordi frekvensen av en beslektet målcellen befolkning er påvirket ikke bare av prosentandelen av irrelevante kontroller, men også av den andre beslektet målet splenocytes. Derfor bør hendelses numre innenfor hver port brukes i formelen ovenfor for å beregne nøyaktig lyse Rings mengden for hver beslektet mål cellepopulasjon (enten CFSEint eller CFSEhøy celler) mot CFSElave kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med eksperimentet som resultatene er avbildet i figur 1 var å fastslå om tilstedeværelsen og funksjonene til nTreg celler form eller endre immunodominance hierarki av t AG-spesifikke tCD8. C57BL/6 mus ble injisert IP med PBS eller med 0,5 mg en anti-CD25 mAb (klone PC-61.5.3 [PC61]) fire dager før de fikk 2 x 107 C57SV tumorceller IP I separate eksperimenter, en rotte IgG1 isotype kontroll ble brukt i stedet for PBS. Vellykket nTreg celle tømming av PC61 ble bekreftet av strømnings flowcytometri17.

Ni dager etter C57SV celle inoculation, et tidspunkt der T AG-spesifikke TCD8 svar nå sitt maksimum23, hvert dyr fikk en IV injeksjon av en celle suspensjon inneholder 3 distinkte populasjoner av CFSE-merket målceller. Kontroll målceller ble syngeneic naive splenocytes samtidig pulserende med to irrelevante peptider (GP33-41 og GB498-505) og merket med en lav dose av CFSE (0,02 μM). For å forberede beslektet målceller, syngeneic naive splenocytes var pulserende med enten T AG-avledet nettsted jeg peptid eller site IV peptid (tabell 1), og deretter merket med CFSE på 0,2 μM og 2 μM, henholdsvis. Kontroll og beslektet målceller ble vasket og blandet i like tall (i en 1:1:1 ratio) før de ble injisert i naiv (kontroll) og T AG-primet C57BL/6 mus. To timer etter mål celle injeksjon, ble mus ofret for sin milt der tilstedeværelsen/fraværet av CFSE-merket målceller ble bestemt av Flow flowcytometri. Target celler ble preget basert på deres differensial CFSE farging intensitet.

Som forventet, nesten like topper som tilsvarer kontroll og beslektet målceller ble synlig i naive mus (figur 1, venstre panel). I kontrast var område IV-viser målceller nesten helt fraværende i T AG-primet mus uavhengig av deres tidligere behandling med PC61 eller PBS (figur 1). Interessant, nTreg celle tømming av PC61 Augmented in vivo CTL-mediert lyse av området I-pulserende målceller17. Disse resultatene bedt oss om å konkludere med at nTreg celler selektivt hemme stedet I-spesifikke cytotoksisitet. Derfor nTreg celle-tappe/inaktivere agenter kan forbedre cytolytisk effektor funksjon av CTLer erkjenner visse tumor-avledet epitopes.

Det over sette-opp skaffer en eksempel av hvor inne vivo cytotoksisitet analyser kan ansatt å samtidig test det lytisk funksjonen av ID og SD CTL Klon inne det likt dyr.

Figure 1
Figur 1: representative cytofluorimetric analyse av TCD8-mediert cytotoksisitet mot T AG-avledet epitopes i nærvær eller fravær av nTreg celler. Target splenocytes pulserende med kontroll peptider, site I eller site IV, som ble differensielt merket med CFSE, ble sporet av flyt flowcytometri i milten av en naiv mus (venstre panel), en PBS-injisert T AG-primet mus (midtre panel), og en PC61 (NTI-CD25)- injisert (nTreg-utarmet) T AG-primet mus (høyre panel). Prosent spesifikk drap av målceller ble beregnet ved hjelp av formelen som er beskrevet i protokollen, og representative tall vises. Dette tallet er vedtatt, med tillatelse fra Haeryfar et al.17. Opphavsrett 2005. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I en nyere etterforskning, spurte vi om blokkering PD-1 påvirker "bredden" av TCD8 svar på t AG16 (figur 2). Dette var et klinisk relevant spørsmål i lys av de observerte terapeutiske fordelene ved PD-1-baserte "Checkpoint-hemmere" i flere kreftformer. Selv om slike hemmere antas å arbeide primært ved å reversere T celle utmattelse, var vi nysgjerrige på å vite om forstyrre med PD-1-PD-L1 interaksjoner kan i tillegg utvide (eller smal) anticancer TCD8 svar. I vår T AG anerkjennelse modell, intracellulære cytokin farging (ICS) eksperimenter avslørte at behandling med enten anti-PD-1 eller anti-PD-L-1 selektivt utvider IFN-γ-produserende TCD8 erkjenner nettsteder I og II/III16. Vi deretter utvidet vår studie for å undersøke in vivo cytolytisk effektor funksjon av disse SD CTLer. C57BL mus ble injisert IP med 100 μg av en anti-PD-1 mAb (klone RMP1-14) eller en rotte IgG2a isotype kontroll (klone 2A3) to timer før C57SV celle inoculation. Mus mottatt to ekstra doser av anti-PD-1 eller isotype tre og seks dager etter tumor celle injeksjon. På dag 9 post-priming, kohorter av naive og primet mus ble gitt, via lateral halen årer, en celle blanding som inneholder like mange CFSElav (CFSE merking dose: 0,025 μM), CFSEint (CFSE merking dose: 0,25 ΜM), og CFSEHi (CFSE merking dose: 2 μM) syngeneic naiv splenocytes pulserende med gB498-505, site II/III, og stedet jeg, henholdsvis. Fire timer senere, ble dyrene euthanized, og CFSE-merket målceller ble sporet cytofluorimetrically i milten deres. Representative FACS-plott (figur 2a) og data fra 3 dyr per kohort (fig. 2b) er illustrert. Mens PD-1 blokaden ikke påvirker ID TCD8 svar mot site IV16, nettsteder I-og II/III-spesifikke SD svar var oppkvikket. Vi konkluderte derfor med at det å forstyrre PD-1-PD-L1-interaksjoner kan indusere "epitope spredning" i anticancer TCD8 -svar.

Det over sette-opp representerer inne vivo mordene analyser det sette i stand kvantifisering av cytotoksisitet elicited av to SD CTL Klon inne det likt dyr.

Figure 2
Figur 2: in vivo cytotoksisitet av T AG-spesifikke TCD8 i anti-PD-1-behandlede mus. (A) representative histogram tomter demonstrere CFSE topper tilsvarende målet splenocytes pulserende med en IRRELEVANT peptid (CFSElav), site II/III (CFSEint), og stedet jeg (CFSEHigh) i T AG-primet mus som mottatt en isotype (venstre panel) eller en PD-1-blokkerende mAb (høyre panel). (B) prosent spesifikke drapet på hver beslektet målcellen befolkningen ble beregnet ved hjelp CFSE+ Event tall i T AG-primet mus (n = 3 per gruppe) og naive mottakere (ikke vist) og formelen som er beskrevet i protokollen. Feilfelt representerer standard feil i gjennomsnittet (SEM), og * * betegner en statistisk forskjell med p < 0,01 ved ikke-sammenkoblet student t-tester. Dette tallet er vedtatt, med tillatelse, fra Memarnejadian et al.16. Opphavsrett 2017. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protein antigen kilde Peptid epitope Betegnelse Sekvens MHC jeg begrensning
SV401 stor T AG2 T AG206-215 Site jeg SAINNYAQKL H-2Db
SV40 Large T AG T AG223-231 Site II/III CKGVNKEYL H-2Db
SV40 Large T AG T AG404-411 Sted IV VVYDFLKC H-2Kb
SV40 Large T AG T AG489-497 Sted V QGINNLDNL H-2Db
HSV-13 glykoprotein B gB498-505* gB498-505 for SSIEFARL H-2Kb
LCMV4 glykoprotein GP33-41* ALLMENNMEDISIN33-41 KAVYNFATC H-2Db
1 den andre Simian virus 40
2 andre priser Stor tumor antigen
3 andre priser Herpes simplex virus type 1
4 andre priser Lymfatisk choriomeningitis virus
* brukt som en irrelevant peptid

Tabell 1. Peptider innført i denne protokollen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CFSE-basert in vivo cytotoksisitet analyser tilbyr flere fordeler i forhold til tradisjonelle draps analyser som radioaktivt krom (51CR) Release og fargemetrisk melkesyre DEHYDROGENASE (LDH) Utgivelses analyser. Først tillater de overvåking av CTL funksjon i en arkitektonisk intakt sekundære lymfoide organ.

For det andre gjenspeiler den spesifikke drapet på målcellene i in vivo cytotoksisitet analysene det absolutte antallet AG-spesifikke TCD8, som vanligvis er, men ikke alltid, en funksjon av TCD8 frekvenser tilstede i milten. Dette er i kontrast med 51CR/LDH Release analyser der et konstant antall celler er ansatt som en kilde til effektor TCD8. Følgelig, 51CR/LDH Release analyser ikke pålitelig anslå det totale antall AG-spesifikke TCD8 som kan være tilgjengelig for verten å eliminere tumorceller eller for å bekjempe infeksjoner. Dette er viktig siden i mange tilfeller og forhold, størrelsen og cellularitet av sekundære lymfoide organer/vev som imøtekomme AG-spesifikke TCD8 er endret. For eksempel kan en hypotetisk scenario tenkes der en viral infeksjon løfter det totale antall TCD8 spesifikke for peptid X samtidig utvide flere andre tCD8 kloner harboring andre særegenheter. Som et resultat, frekvensen av X-spesifikke TCD8 blant total milt tCD8 kan ikke øke, i så fall en 51CR/LDH Release analysen vil ikke være nyttig. Som et annet eksempel, har vi nylig demonstrert at enkelte bakterielle superantigens utvide minnet TCD8 spesifikke for np147-155, en immunodominant peptid epitope av INFLUENSA en virus i BALB/c mus, som korrelert godt med økt in vivo lyse av NP147-155-pulserende målceller31. Siden eksponering for superantigens provoserer T celle spredning ikke-spesielt, ville det ha vært svært usannsynlig å demonstrere betydelige NP147-155-spesifikke cytotoksisitet bruker 51CR/LDH Release analyser.

For det tredje, målrette celler pulserende med peptider som binder til samme MHC klasse jeg molekyl kan merkes med ulike doser av CFSE, blandes og brukes i in vivo cytotoksisitet analyser. Samtidig analyse av CTL-funksjoner mot slike peptider er ikke et alternativ i 51CR/LDH Release analyser.

Fjerde, in vivo cytotoksisitet analyser tillate mekanistisk studier under grunning, effektor og tilbakekalling faser av CTL svar. For eksempel kan tumor celle inoculation eller antitumor vaksinasjon utføres i genetisk endrede mus for vurdering av CTL induksjon. Videre kan splenocytes fra Gen knock-in og Knock-Out mus brukes som målceller i løpet av effektor fasen. Til slutt kan ulike agenter (f. eks, farmakologiske hemmere og legemiddel kandidater) administreres før grunning, under effektor fase, eller begge deler. Derfor, in vivo cytotoksisitet analyser gir en kraftig plattform for narkotika/vaksine effekt testing i en virkelig in vivo-innstilling. I denne kroppen av arbeidet, har vi gitt eksempler på immunologiske intervensjoner som økning i vivo CTL svar (figur 1 og figur 2).

Som andre rutinemessig brukt drap analyser, in vivo cytotoksisitet analyser gir ikke noen direkte informasjon om evnen til CTLer å resirkulere fra ett mål til et annet før de blir oppbrukt. I tillegg har vi testet flere tumor celletyper som potensielle målceller i in vivo cytotoksisitet analyser, men til ingen nytte så langt. Dette er rett og slett fordi tumorceller ikke når milten minst i synlig tall etter at de er injisert IV Derfor, avhengig av mus splenocytes som målceller kan betraktes som en iboende begrensning av in vivo cytotoksisitet analyser. Det er bemerkelsesverdig, men at adoptively overført mål splenocytes kan lett finnes i flere andre organer (i tillegg til milten), for eksempel i leveren. Derfor kan AG-spesifikke CTL-funksjonen bli vurdert i flere organer eller vev.

Vi har optimalisert in vivo cytotoksisitet analyser for undersøkelse av immunodominance i t AG-spesifikke tCD8 svar16,17. Mange verktøy og reagenser er tilgjengelige for å studere disse svarene i sammenhenger av antitumor immunitet og terapi. Den fibrosarcoma cellelinjen som brukes i protokollen som er beskrevet her (dvs. C57SV celler) gir ikke opphav til svulster i immunkompetente mus. Derfor er det et nyttig verktøy i å undersøke antitumor vaksinasjon. T AG-drevet neoplastic transformasjon i utvalgte vev har generert flere verdifulle modeller av autochtonous kreft. For eksempel, SV11 mus som utvikler akkord plexus papillomer inne i hjernen deres ventriklene35 ikke havn endogene T AG-spesifikke TCD8 fordi disse cellene er valgt mot og slettet i thymus. Men overføring C57BL/6 splenocytes i subletalt bestrålt, tumor-bærende SV11 mus fører til utvidet kontroll av svulster, som er angivelig forbundet med in vivo grunning av nettstedet IV-spesifikke TCD836,37 . I den transgene adenokarsinom av musen prostata (TRAMP) modell38, site IV-spesifikk respons dwindles bort med progresjon av kreft. Men ellers immunorecessive området V-spesifikke TCD8 celler unnslippe negativt valg i thymus og også unngå perifere toleranse mekanismer21. Dette gir gode muligheter for eksperimentelle terapeutiske intervensjoner kretser rundt nettstedet V-spesifikke TCD8 funksjoner. In vivo cytotoksisitet analyser bør vise seg informative i å studere og potensielt reversere immunologiske toleranse i ulike modellsystemer, inkludert i T AG anerkjennelse modellen.

Immunodominance er en konsistent funksjon av TCD8 svar generert ikke bare mot tumor AGS men også mot patogen-avledet epitopes. Faktisk har vi tidligere brukt in vivo cytotoksisitet analyser for å studere immunodominance i anti-influensa TCD8 Responses12. Derfor kan den optimaliserte analysen beskrevet i denne protokollen endres og brukes i et bredt spekter av immunologiske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institutes of Health Research (CIHR) tilskudd MOP-130465 og PJT-156295 til SMMH. JC er delvis støttet av en dronning Elizabeth II Graduate stipend i vitenskap og teknologi fra Ontario departementet for opplæring, høyskoler og universiteter. CEM var en mottaker av en Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (doktorgrads) fra Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yewdell, J. W., Bennink, J. R. Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses. Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).
  2. Chen, W., et al. Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination. The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).
  3. Otahal, P., et al. Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope. The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).
  4. Lauron, E. J., et al. Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).
  5. Crowe, S. R., et al. Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections. The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).
  6. Probst, H. C., et al. Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression. The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).
  7. Gileadi, U., et al. Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein. The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).
  8. Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).
  9. Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL. The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).
  10. Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).
  11. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  12. Haeryfar, S. M., et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies. The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).
  13. Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase. Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).
  14. Kedl, R. M., et al. T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells. The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).
  15. Kastenmuller, W., et al. Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).
  16. Memarnejadian, A., et al. PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination. The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).
  17. Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities. The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).
  18. Rytelewski, M., et al. Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase. PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).
  19. Maleki Vareki, S., et al. Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin. American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).
  20. Irvine, K., Bennink, J. Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses. Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).
  21. Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes. Journal of Immunotherapy. 24 (3), 237-241 (2001).
  22. Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M. Immunodominance and tumor escape. Seminars in Cancer Biology. 12 (1), 25-31 (2002).
  23. Mylin, L. M., et al. Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes. Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).
  24. Fu, T. M., et al. An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope. Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).
  25. Chen, W., et al. Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon. European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).
  26. Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo. Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).
  27. Aichele, P., et al. Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology. Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).
  28. Oehen, S., Brduscha-Riem, K. Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division. The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).
  29. Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1. The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).
  30. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).
  31. Meilleur, C. E., et al. Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. , Epub ahead of print (2018).
  32. Goldszmid, R. S., et al. Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma. The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).
  33. Oberg, L., et al. Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways. European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).
  34. Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency. The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).
  35. Brinster, R. L., et al. Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors. Cell. 37 (2), 367-379 (1984).
  36. Tatum, A. M., et al. CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors. The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).
  37. Schell, T. D., Tevethia, S. S. Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen. The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).
  38. Greenberg, N. M., et al. Prostate cancer in a transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).

Tags

Immunologi og infeksjon CD8+ T celler cytotoksisitet kreft immunodominance tumor-avledet peptider store T antigen regulatoriske T-celler PD-1 Checkpoint hemmere narkotika effektivitet testing Flow flowcytometri
Skreddersy in vivo cytotoksisitet analyser for å studere Immunodominance i tumor spesifikke CD8<sup>+</sup> T celle svar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, … More

Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter