Summary

閉経後の心血管機能障害の外因性エストロゲン治療をスクリーニングするためのインビボエストロゲン欠乏マウスモデル

Published: August 13, 2019
doi:

Summary

臨床的には、閉経期の女性のエストロゲン欠乏は脂質破壊およびアテローム性動脈硬化症の発生率を悪化させる可能性がある。apoE-/-マウスの二重後体横切開を介した両側眼欠法による生体内エストロゲン欠乏モデルを確立した。マウスモデルは閉経後の心血管機能障害の外因性エストロゲン治療のスクリーニングに適用可能である。

Abstract

閉経後の女性は閉経前の女性よりも心血管疾患を発症するリスクが高い。卵巣摘出時の雌マウスは卵巣摘出術(OVX)で、無傷の卵巣機能を有する雌マウスと比較して大動脈におけるアテローム硬化性病変を増加させた。しかし、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいエストロゲン欠損マウスを含む実験室モデルは欠けている。この赤字は、閉経期の女性の臨床的なエストロゲン欠乏は、既存または進行中の脂質破壊およびアテローム性動脈硬化症の発生率を悪化させる可能性があるため、重要である。本研究では、アポリポタンパク質E(apoE)-/-マウスにおける二重後体横切開による両側眼欠切による生体内エストロゲン欠損マウスモデルを確立する。次に、ヘーゼルナッツスプレッドを介して経口投与した17β-エストラジオールとシュードプロトジオスチン(PPD)(フィトエストロゲン)の効果を比較する。我々は、PPDがOVX apoE-/-マウスの最終的な体重および血漿TGを減少させる上で何らかの効果を発揮するが、その17β-エストラジオールに匹敵する抗アテローム硬化および心臓保護能力を有することを見出した。PPDは、抗腫瘍特性を発揮することが報告されているフィトエストロゲンである。したがって、提案された方法は、閉経後の女性における伝統的なホルモン補充療法に代わるペラル投与を介して植物エストロゲンをスクリーニングするために適用可能であり、これは潜在的に有害な腫瘍遺伝学を有することが報告されている。容量。ヘーゼルナッツスプレッドを介した経口投与は非侵襲的であり、多くの患者に広く適用可能である。この記事には、ヘーゼルナッツスプレッドを介したapoE-/-マウスおよび前腔17βエストラジオールまたはフィトエストロゲンホルモン置換における二重後側切開による両側眼耳切開のステップバイステップのデモンストレーションが含まれています。心エコー検査を用いて血漿脂質と心血管機能解析を行う。

Introduction

疫学的および臨床的研究は、閉経後の女性が閉経前の女性よりも心血管疾患のリスクがかなり高いことを示しています 1,2.ホルモン補充療法(HRT)は、心血管疾患の相対的なリスクを0.37-0.793に減らすことができます。他の合併症の中で、心血管疾患によって引き起こされるアテローム性動脈硬化症は、世界的な死亡原因の主要な原因である4.しかし、アテローム性動脈硬化を起こしやすい状態を示すエストロゲン欠損マウスを含む実験室モデルは欠けている。このプロトコルは、閉経後の心血管機能障害の外因性エストロゲン治療をスクリーニングするための生体内エストロゲン欠乏マウスモデルを提供する。

以前の研究は、高コレステロール食を与えたアテローム硬化性げっ歯類におけるOVXの適用は、アテローム性動脈硬化症5、6、7、8に苦しむ閉経後の女性を模倣できることを示している。閉経期の女性のアテローム硬化状態に似た再現性と便利な動物モデルは、外因性エストロゲン研究の基礎です。ここで、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいアポリポプロテインEノックアウト(apoE-/-)マウス9、10に両側側切開の二重後側切開を適用した。中腹部または背部切開と比較して、二重背部横切開は、重度の腹腔の接着および炎症を避けることができるより簡単で、より少ない時間のかかる方法である。ヘーゼルナッツスプレッドを介した経口投与(材料の表を参照)は非侵襲的で便利であり、長期投与モード11として広く適用可能である。スローリリースペレット注入も人気6.しかし、インプラントは、特にOVXを受けたマウスにおける感染の発生率を悪化させる可能性がある。経口ガバゲージや水投与などの他の非侵襲的投与モードにも多くの欠点がある。経口ゲージは、典型的にはマウスにストレスを与え、経口損傷を引き起こす可能性がある。飲料水を介してホルモンを投与することは非常に有益です。しかし、外因性エストロゲンが水中に不溶性であるため、乳化剤としてのDMSOの添加は避けられません。ここでは、長期投与のためのヘーゼルナッツスプレッドを介したペラル17βエストラジオールまたはフィトエストロゲンホルモン置換を選択した。

最近、閉経後女性の心血管系に対するHRTの有益な効果は、女性の健康イニシアチブ(WHI)試験12で争われている。一方で, 外因性エストロゲン単独で心血管系に有益な効果を発揮;一方、それは心血管イベントのリスクを高めるために酢酸メトヒドロキシプロゲステロンと組み合わせることができます。より深刻に、HRTは乳房および子宮腫瘍の進行につながる可能性があり、この効果は著しくその使用を制限している13,14.腫瘍細胞15、16、17における有人活性を欠く外因性エストロゲンの心血管保護効果に、より多くの関心が集まっている。ヒトおよび動物における複数の研究は、エストロゲンと同様の構造を有する植物エストロゲンが心血管保護15,18において有益な役割を果たすことができることを示唆している。

したがって、本研究の目的は、(i)apoE-/-マウスおよび(ii)の心血管保護効果を比較するために、二重後体横切開を介して両側眼球切開による生体内エストロゲン欠乏マウスモデルを構築する(i)。ヘーゼルナッツスプレッドを介して17β-エストラジオールおよび擬似プロトジオシン(PPD)を投与した。17β-エストラジオールは、女性の性ホルモン6、11、19に属する外因性エストロゲンの一種である。PPDは、ジオスコア植物由来のステロイドサポニンおよびフィトエストロゲンであり、以前に抗腫瘍特性20を発揮することが報告されている。

Protocol

すべての動物のケアと実験プロトコルは、中国医学アカデミーと北京連合医科大学の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました (許可No.: SYXK (北京) 2013-0023).apoE-/-マウスの起源はC57BL/6J9、10です。 1. apoEにおける二重後部横切開による両側眼切開術-/-マウス 引き取り(28歳)で、アバーチン(トリブロ?…

Representative Results

本研究で用いられる典型的な実験的処置スキームを図1に示す。引き取り(28日目)において、雌のapoE-/-C57BL/6Jマウスをアバーチン(トリブロモエタノール;200mg/kg;精米内)で麻酔した。マウスは、1cmの後部切開を介して両側OVXまたはシャムを操作した。両側OVXの1週間後、マウスに高コレステロール食(1.25%コレステロール、0%のコレート)を12週間…

Discussion

ここで説明する方法論は、閉経期の女性に見られる脂質破壊およびアテローム性動脈硬化症に似たマウスモデルである。閉経後の女性におけるエストロゲン欠乏は、徐々に複雑で広範囲に広がるアテローム性動脈硬化病変1を伴う既存または進行中の高コレステロール血症の発生率を悪化させることができることが十分に文書化されている。診療所におけるアテローム性動脈…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国立自然科学財団(81202526 to J.X.)、中国国立自然科学財団(81302769からB.S.)、北京市自然科学財団(47144226からB.S.)、中国のポスドクによって支援されました。科学財団(2010490325からJ.X.まで)、中国教育省博士プログラム財団(20121106120031からB.S.)。

Materials

17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5*12 19mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women’s Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc’h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F., et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).

Play Video

Cite This Article
Sun, B., Yin, Y., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

View Video