Summary
ويصف هذا البروتوكول إنتاج نظام ثلاثي الأبعاد أورجانويد القناة الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس. يمكن الاحتفاظ بهذه أورجانويدس الصفراوية في الثقافة لدراسة البيولوجيا تشولانجيوسيتي. التعبير عن علامات للسلف والخلايا الصفراوية الصفراوية أورجانويدس وتتكون من الخلايا الظهارية الاستقطاب.
Abstract
تشولانجيوباثيس، التي تؤثر على القناة الصفراوية اكستراهيباتيك (اهبدس)، تتضمن الكبدية الصفراوية والتهاب الأوعية الصفراوية المصلب cholangiocarcinoma. لديهم لا الخيارات العلاجية الفعالة. أدوات لدراسة عبد محدودة جداً. وكان هدفنا وضع نموذج تشولانجيوسيتي المستمدة من الخلايا الجذعية، والاكلينيكية الخاصة بالجهاز، وتنوعاً، والكبار التي يمكن إنشاؤها بسهولة من نوع البرية والفئران المهندسة وراثيا. وهكذا، نحن تقرير عن تقنية الرواية من وضع نظام ثقافة عبد أورجانويد (عبدو) من اهبدس الماوس الكبار. هذا النموذج فعالة من حيث التكلفة، وقادرة على سهولة تحليلها، ولها تطبيقات متعددة المتلقين للمعلومات. على وجه التحديد، يمكننا وصف المنهجية للماوس عبد العزلة والانفصال من خلية مفردة وبدء الثقافة أورجانويد، والدعوة، والصيانة على المدى الطويل وتخزين. كما توضح هذه المخطوطة اهبدو معالجة إيمونوهيستوتشيميستري ومجهر فلوري كوانتيتاتيون وفرة مرناً بالنسخ العكسي الكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرت-PCR). هذا البروتوكول له مزايا كبيرة بالإضافة إلى إنتاج أورجانويدس عبد على حدة. استخدام وسيلة مكيفة من الخلايا L-تحذير يقلل كثيرا من تكلفة هذا النموذج. ويوفر استخدام الماوس اهبدس الأنسجة غير محدود تقريبا لتوليد ثقافة، خلافا للأنسجة البشرية. ابدوس الماوس الذي تم إنشاؤه يحتوي على عدد سكان نقية من الخلايا الظهارية مع علامات السلف اندوديرمال ومتباينة الخلايا الصفراوية. أورجانويدس مثقف الحفاظ على مورفولوجيا متجانسة من خلال ممرات متعددة، ويمكن استردادها بعد فترة تخزين طويلة الأجل في النتروجين السائل. هذا النموذج يسمح لدراسة انتشار الخلايا السلف الصفراوية ويمكن التلاعب بها عقاقيري، ويمكن إنشاؤها من الفئران المهندسة وراثيا. الدراسات المستقبلية مطلوبة لتحسين ظروف الثقافة من أجل زيادة الكفاءة والطلاء، وتقييم نضج الخلايا الوظيفية، وتمايز الخلية مباشرة. تطوير نماذج الثقافة المشتركة ومصفوفة محايدة أكثر بيولوجيا الخلية أيضا مرغوب فيه.
Introduction
تشولانجيوباثيس هي اضطرابات تقدمية المزمنة المستعصية التي تؤثر على خلايا الصفراوية الموجودة في داخلها والقنوات الصفراوية اكستراهيباتيك (اهبدس)1. بعض تشولانجيوباثيس، مثل التهاب الأوعية الصفراوية المصلب، cholangiocarcinoma والكبدية الصفراوية والخراجات تشوليدوتشال، يؤثر في الغالب اهبدس. تطوير علاجات تشولانجيوباثيس مقيد بمحدودية توافر نماذج الإكلينيكية. وباﻹضافة إلى ذلك، ركزت الدراسات السابقة على تشولانجيوباثيس التي تم تجميعها معا: الكبد وداخلها، واهبدس. ومع ذلك، داخل اهبدس ذات منشأ جنينية متميزة و، وبالتالي، ينبغي أن تعتبر الأمراض الجزيئي متميزة. القناة الصفراوية أحياناً وضع لوحات الأقنية أحياناً وجزء الجمجمة من رتج الكبد، ووضع اهبدس كله من الجزء والذيلية ل الكبد رتج2. كما أنها تعتمد على السلف مختلفة الخلية مقصورات للتوازن الكبار، بما في ذلك قنوات هيرينغ في القناة الصفراوية أحياناً والغدد بيريبيلياري في اهبدس2،3. استخدام نماذج حيوانية للدراسات الإكلينيكية محدود بالمصروفات وينبغي تدنية لأسباب أخلاقية. ومن ثم، اختزالية، استنساخه، الوقت وفعالة من حيث التكلفة من نماذج في المختبر مرغوب فيه للغاية.
استخدمت معظم الدراسات السابقة من تشولانجيوباثيس الماوس العادي أو نماذج سرطان الفئران، أو خطوط الخلايا البشرية cholangiocarcinoma المستمدة من داخلها واهبدس4،5،،من67. ومع ذلك، هذه نماذج خلايا المحولة ولا الخص البيولوجيا تشولانجيوسيتي العادي في التوازن، أو في حالة صحية. أتاح التقدم الذي أحرز مؤخرا في وضع نماذج الثقافة أورجانوتيبيك لتطوير هياكل ثلاثية الأبعاد من أنواع الأنسجة المختلفة، بما في ذلك أنسجة الكبد، على الرغم من أن الماوس العادية لا، اهبدس،من89 10. هذه الهياكل "مثل جهاز" تهدف إلى محاكاة الأنسجة الأولية وتزرع في مكانة مصطنعة دعم التجديد الذاتي ل الخلايا الجذعية/السلف الخاصة بالجهاز11.
"أورجانويد" مصطلح واسع أن معظم عادة يصف نماذج ثلاثية الأبعاد 3-الأنسجة المستمدة من الخلايا الجذعية. أورجانويدس يمكن أن تتولد من أعيدت برمجتها pluripotent الخلايا الجذعية ممثلة بالخلايا الجذعية الجنينية والتي يتسبب فيها الخلايا الجذعية pluripotent. كما أنها يمكن أن تتولد من الخلايا الجذعية الخاصة بالجهاز12. لقد تم اقتراح بعض نماذج أورجانويد تشولانجيوسيتي في الدراسات البحثية السابقة. وهكذا، أورجانويدس المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية وقد تم الإبلاغ عن7،،من913 وتوفير أداة فعالة قيمة، وقت أن يسمح لجيل واحد من أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك، لا تعكس هذه أورجانويدس المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent تماما على هيكل ووظائف من الابتدائي تشولانجيوسيتيس عبد الكبار.
أورجانويدس المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية9 وكما اقترح الماكر10 الكبد. نماذج الماكر ليست متاحة على نطاق واسع وتكون محدودة عتاد أداة لأغراض الدراسة. وعلاوة على ذلك، لا نموذج تلك المستمدة من الكبد الكبار المستمدة من الخلايا الجذعية أورجانويدس تشولانجيوسيتيس اكستراهيباتيك ولكن تشولانجيوسيتيس بدلاً من ذلك أحياناً.
أبلغ عبد أورجانويد جيل من الإنسان العادي اهبدس14 والفأر عبد تشولانجيوكارسينوما15. بيد الوصول إلى الأنسجة البشرية أهبد محدودة للغاية، وأورجانويدس المستمدة من نموذج موريني وراثية cholangiocarcinoma15 لا تمثل الأحياء تشولانجيوسيتي صحية في التوازن والمشتقة من خلايا معدلة وراثيا.
لمعالجة قيود pluripotent المستمدة من الخلايا الجذعية والكبد تشولانجيوسيتي أورجانويد نماذج ومحدودية الوصول إلى الأنسجة البشرية اللازمة في نماذج الإكلينيكية، قمنا بتطوير نموذج أورجانويد عبد مورين (الشكل 1A). ويصف هذه المخطوطة تطوير تقنية للماوس أورجانويدس أهبد المستمدة من أنسجة البالغين. سوف تكون هذه أورجانويدس عبد اسمه ابدوس أداة هامة في المختبر لدراسة الآليات التي تقوم عليها عمليات التوازن ومرض اهبدس تشولانجيوسيتي، مثل تشولانجيوباثيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "جامعة ميتشجان".
1-إعداد المعدات والمواد اللازمة لعزل أهبد الماوس
- إعداد متوسطة البذر والغسيل المخزن المؤقت (جدول المواد) في 50 مل أنابيب مخروطية والاحتفاظ بها عند 4 درجة مئوية أو على الجليد حتى الاستخدام.
- قم بإعداد جدول جراحية (الشكل 1B). إعداد تعقيم الأدوات الجراحية (الشكل 1).
- مكان لوحة 24-جيدا عقيمة في 37 درجة مئوية زراعة الأنسجة الحاضنة الدافئة قبل ذلك.
- مكان قاسمة لمصفوفة الطابق السفلي على الجليد. استخدام مصفوفة الطابق السفلي فقط عند هو مسيل تماما.
2-أهبد العزلة والمرارة أورجانويد الثقافة
-
العزلة، وإعداد تعليق خلية واحدة للماوس عبد
- Euthanize ماوس الكبار (كبار السن من 2 أشهر) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. ضع الماوس في وضع ضعيف. فتح تجويف البطن باستخدام نهج خط الوسط وسحب الكبد للراحة على الحجاب الحاجز.
- تحديد القناة الصفراوية المشتركة الموجودة مباشرة أسفل هيلوم الكبد عن طريق سحب بلطف العفج الدانية مع هيموستات. فصل عبد من الأنسجة المحيطة بها باستخدام شفرة المبضع. عقد نهاية الدانية من القناة الصفراوية المشتركة مع الملقط، تشريح أنه ديستالي فقط أعلاه في المنعطف مع العفج، ثم تشريح الدانية نهاية القناة من الكبد (الشكل 1). فورا وضع عبد معزولة (الشكل 1E) في البرد الغسيل المخزن المؤقت.
- إزالة عبد من المخزن المؤقت الغسيل وتخطر أقسام 0.5 مم باستخدام شفرة مشرط معقم. ضع الأنسجة على طبق من زجاج على الجليد أثناء الإجراء (الشكل 1B).
- وضع المقاطع عبد في أنبوب يحتوي على 500 ميليلتر من المخزن المؤقت الانفصال. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تحييد المخزن المؤقت الانفصال بإضافة 500 ميليلتر من مستنبت الخلية المثلج.
- تريتوراتي تعليق خلية صعودا وهبوطاً تتقدم عن طريق الإبر 18 ز وز 20، 20 مرة كل. تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر وجمع خلال التدفق في أنبوب 50 مل.
ملاحظة: قبل شرط المصفاة مع 500 ميليلتر من المالحة مخزنة الفوسفات العقيمة (PBS) قبل تصفية لتسهيل مرور تعليق خلية.
-
إنشاء عبد أورجانويدس
- أجهزة الطرد المركزي التدفق من خلال الخطوة 2.1.5 في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- بعناية إزالة المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المثلج PBS العقيمة. نقل استثارة في أنبوب 1.5 مل جديدة. كرر الخطوة 2.2.1.
- بعد الطرد المركزي، بعناية إزالة المادة طافية من غسلها الخلايا التي يتم جمعها في أسفل الأنبوبة. ريسوسبيند بيليه الخلية في 120 ميليلتر من الطابق السفلي المثلج المسيلة مصفوفة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً باستخدام تلميحات P200.
ملاحظة: وقد استثارة بيليه الخلية في الطابق السفلي المصفوفة المراد تنفيذها على الجليد-حمام. - لوحة ميليلتر 40 من تعليق خلية في مصفوفة الطابق السفلي في وسط بئر في صفيحة 24-جيدا قبل دافئة.
ملاحظة: تجنب المص الهواء أثناء التعامل مع مصفوفة الطابق السفلي منع تكوين فقاعة. - العودة اللوحة مع خلايا حراكه في مصفوفة الطابق السفلي للحاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، أو حتى هو توطد مصفوفة الطابق السفلي. إضافة 600 ميليلتر من المتوسط بذر ارتفعت درجة حرارة تصل إلى 37 درجة مئوية لكل بئر (جدول المواد). العودة اللوحة إلى حاضنة استنبات الأنسجة 37 درجة مئوية.
- استبدال المتوسطة البذر مع 600 ميليلتر من مستنبت أورجانويد طازجة في 3 أيام وكل 3 أيام بعد ذلك. رصد النمو أورجانويد مع مجهر مقلوب. ويلاحظ استخدام أورجانويدس للتطبيق المصب أو تقسيم كل 7 إلى 9 أيام قبل تراكم انهيار الأنقاض وأورجانويد إينترالومينال (الشكل 2A).
3-عبد أورجانويد مرور وتخزين
-
مرور أهبد أورجانويدس 1:3 إلى 1:4 كل أيام 7 إلى 9
- إزالة المتوسطة من البئر وإضافة 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج. ريسوسبيند أورجانويدس بلطف بيبيتينج الخليط صعودا وهبوطاً 10 مرات في البئر. نقل الخليط إلى أنبوب 1.5 مل.
- مرور المخلوط من خلال إبرة 25 غ 4 مرات لننأى أورجانويدس. الطرد المركزي المخلوط في 400 x ز لمدة دقيقة 4 في 4 درجات مئوية.
- بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في المصفوفة الطابق السفلي (1:3 إلى 1:4) لزيادة استزراع (الخطوة 2.2.4.) أو غسل الخلايا مع الجليد الباردة برنامج تلفزيوني لمزيد من المعالجة.
ملاحظة: عادة، يتم مطلي خلايا 250-300 إلى لوحة 24-جيدا للتطبيقات المتلقين للمعلومات. تصفيح الكفاءة يمكن تقييمه بحقل مشرق الفحص المجهري استخدام مجهر مقلوب في يوم 3-5 بعد باساجينج بإحصاء عدد أورجانويدس وحساب المئة من عدد الخلايا الأولية. يمكن أن يكون مرناً معزولة من ابدوس غسلها في برنامج تلفزيوني استخدام بروتوكول قياسي باستخدام جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم الاستخراج.
-
التخزين على المدى الطويل من أهبد أورجانويدس
- إزالة المتوسطة من البئر وتغسل أورجانويدس مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني من البئر دون الإخلال بإسقاط مصفوفة الطابق السفلي.
- إضافة 500 ميليلتر من الخلية المثلج تجميد المتوسطة إلى البئر. بلطف ريسوسبيند أورجانويدس في مصفوفة المسيلة الطابق السفلي وخلية تجميد المتوسطة ونقل الخليط في قارورة المبردة.
- تخزين القنينات في-80 درجة مئوية ل h. 48 نقل القنينات لخزان النتروجين للتخزين طويل الأجل في مرحلة بخار.
4-أهبد أورجانويد بروسيسينج لتضمين البارافين
- ريسوسبيند ابدوس في 500 ميليلتر من المثلج PBS (4 درجة مئوية) قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 إلى 10 مرات. جمع اهبدو حراكه في مصفوفة الطابق السفلي المسيلة في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: لتجنب كسر أورجانويدس وقطع الجزء السفلي 2-3 مم طرف P1000 وإزالة المادة طافية بعناية فائقة. - بعناية إزالة أجهزة الطرد المركزي عبد أورجانويدس في 350 x ز للحد الأدنى 5 المادة طافية دون إزعاج بيليه أورجانويد.
- إضافة 1 مل من المثلج 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين) إلى أورجانويدس واحتضان أورجانويدس في 4% بين عشية وضحاها منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية. إزالة 4% منهاج العمل من أورجانويدس استخدام تلميح P1000 بعد الحضانة بين عشية وضحاها.
- إضافة 1000 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني للأنبوب مع أورجانويدس واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). الطرد المركزي الأنبوب مع أورجانويدس في برنامج تلفزيوني في 350 x ز لأدنى 5 كرر هذه العملية مرتين أخريين.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل إيثانول 30% أورجانويدس. احتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
- الطرد المركزي الأنبوب في 350 x ز لمدة 5 دقائق في إزالة الرايت 30 ٪ الإيثانول. أضف 1 مل إيثانول 70% واحتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
- سينتريفوجاتي في س 350 ز لإزالة الحد الأدنى 5 70% إيثانول. أضف 1 مل إيثانول 100% واحتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
ملاحظة: أورجانويدس يمكن أن يوضع في الإيثانول 100% عند درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل إجراء مزيد من المعالجة. - الحرارة هلام تجهيز العينة في فرن ميكروويف ل 20 ق أو حتى المسال. إضافة 50 ميكروليتر من عينة تجهيز جل في الأنبوب مع أورجانويدس. ضع الأنبوب على الجليد حتى هو توطد العينة تجهيز هلام.
- إزالة قطره العينة تجهيز هلام مع أورجانويدس من الأنبوب ووضعه بين منصات الأسفنج الأزرق في كاسيت لمزيد من المعالجة في النسيج المعالج. استخدم 15 دقيقة لكل خطوة في امبيدير البارافين خلال إجراء مزيد من المعالجة...
- قسم أورجانويدس جزءا لا يتجزأ من البارافين في العينة تجهيز هلام في 4 ميكرومتر. المضي قدما مع المناعي تلطيخ كما هو موضح سابقا16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لدينا بروتوكول وصف جيل أورجانويدس عبد الماوس الخاصة بالانسجة والكبار المستمدة من الخلايا الجذعية. بعد تستزرع في أورجانويدس، وتشكيل هيكل الكيسي يمكن ملاحظة لها في أقرب وقت بعد أن عزلة أهبد يوم 1. التلوث مع الليفية لا يحترم عادة خلال جيل الثقافة. عبدو تصفيح الكفاءة هو حوالي 2% عند المعزولة من المواليد أو الكبار (كبار السن من أشهر 2) الفئران (الشكل 2). تصفيح كفاءة أورجانويدس أهبد المستمدة من الفئران الكبار زيادات بنسبة 11% في الممر 2 وتبقى مستقرة (الشكل 2). أغلبية أورجانويدس تثبت مورفولوجيا الكيسي من خلال كل المعابر، مع أورجانويدس "غير النظامية" نادرة (الشكل 2-E). أورجانويدس تصل إلى ذروة نمو في 5-7 أيام بعد بدء تراكم intraluminal الحطام وتتدهور (الشكل 2A). ولذلك، للحفاظ على ثقافة أورجانويد، ينبغي تقسيم كل 7-10 أيام (الشكل 2A). وبمجرد إنشاء وعند التعامل معها على نحو مناسب، يمكن الحفاظ على أورجانويدس في الثقافة تقريبا إلى أجل غير مسمى (ثقافات لوحظت تصل إلى 14 شهرا). لتجنب ثقافة التلوث مع خلايا متمايزة مرحلا من العزلة الخلية الأولى، واستخدام أورجانويدس باساجيد على الأقل مرتين قبل استخدامها لتطبيق المتلقين للمعلومات. للتخزين على المدى الطويل، استخدم قبل مرور (حتى سن 7) أورجانويدس، منذ لديهم مستوى أعلى من الكفاءة والطلاء بعد الانتعاش من التخزين.
عندما حلل مع الفلورة، ابدوس تتكون من عدد السكان نقية من الخلايا الظهارية تميزت ه-كادهيرين (الشكل 3 ألف-ج). إظهار الخلايا أورجانويد علامات لخلايا السلف الصفراوية (البنكرياس والاثني عشر هوميوبوكس 1 (PDX1)؛ الشكل 3 ألف) كذلك علامات التمايز الصفراوية (سيتوكيراتين 19 (CK19) وتحديد الجنس المنطقة Y-مربع 9 (SOX9)؛ الشكل 3، ج). الأهم من ذلك، تملك نسبة عالية من الخلايا أورجانويد هدب الأولية تميزت أسيتيلاتيد α-tubulin (-ات؛ الشكل 3D)، الذي هو سمة من سمات تشولانجيوسيتيس العادية، وتقترح الاستقطاب خلية أورجانويد المناسبة. التعبير عن علامات السلف (Pdx1) والخلايا المتمايزة الصفراوية [Ck19، Sox9، أكوابورين 1 (Aqp1)، "التليف الكيسي Transmembrane الموصلية منظم"(Cftr)] يمكن أيضا تأكيد بالوقت الحقيقي النسخ العكسي الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرت-PCR) (الجدول 1). مزيج من هذه العلامات مميزة تشولانجيوسيتيس في اهبدس14،،من1718.
باختصار، هذا البروتوكول يصف توليد نموذج الثقافة أورجانويد لاستقطاب الخلايا الظهارية الصفراوية معربا عن السلف ومتباينة علامات. يمكن صيانة هذا النظام في الثقافة لفترة طويلة دون أحداث تغييرات في التشكل، تخزين طويل الأجل، وتحليلها مع إيمونوهيستوتشيميستري وبكر قرت.
الشكل 1 : التخطيطي عبد أورجانويد ثقافة جيل وحتى تعيين العمليات الجراحية (أ)-جيل أورجانويد "التخطيطي من أهبد". (ب)-المنطقة الجراحية كان تعيين لعزل عبد وشملت لوحة زجاج (الخط المنقط) أبقى على علبة جليد في جميع الأوقات. (ج)-المعدات الجراحية المعقمة شملت مقص حاد، مستقيم ومنحني ملاقط مسنن وهيموستات مشرط. (د وه) عبد معزولة عن المحيط بالنسيج الضام والبنكرياس تليها تشريح دقيق بروكسيمالي من القناة الصفراوية أحياناً والكبد (د، السهم)، وديستالي من العفج (د، السهم). علامات المسطرة = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الثقافة عبدو. (أ)-الصور المجهرية ابدوس مدى 12 يوما. (ب). تصفيح كفاءة أورجانويدس المستمدة من الأطفال حديثي الولادة (الفئران 2 كل ثقافة، n = 3 الثقافات) والكبار (> 2 أشهر من العمر، الماوس 1 كل ثقافة، n = 3 الثقافات) الفئران بعد طلاء الخلايا 300 كل بئر في لوحة 24-جيدا ويعدد المنشأة أورجانويدس في يوم 5 من الثقافة. (ج ود) وقد تم تحليل اهبدو الكيسي مقابل مورفولوجيا غير النظامية بالفحص المجهري. (ﻫ). وقد تم تحليل نسبة أورجانويدس على شكل الكيسي النظامية وغير النظامية في أوائل (< 10) وأواخر الممرات أورجانويد (إيه وان زيرو). تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. بيانات كمية أظهر كمتوسط +/-الخطأ المعياري للوسط (SEM)، تي-اختبار. NS = ليس كبيرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : ابدوس التعبير عن علامات للسلف وتنضج الخلايا الصفراوية. (أ-ج). ابدوس تم تحليلها بواسطة الفلورة تلطيخ لعلامات الظهارية (ألف، باء ه-كادهيرين، الأحمر)، السلف (A. PDX1 الأخضر), ومتباينة (ب. CK19، أخضر؛ وج. الخلايا الصفراوية-AT، أحمر). تغيير حجم أشرطة = 25 ميكرومتر. *، التجويف. (د)-تم تحليل اهبدوس لوفرة من Pdx1، Ck19، Sox9، Aqp1، ومرناً Cftr قبل قرت-بكر (يعني +/-وزارة شؤون المرأة بالنسبة للتعبير عن هبرت). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الجينات | رقم الدخول | تسلسل التمهيدي | حجم المنتج | ||
| هبرت | NM_013556 | إلى الأمام--آكتتجكجكتكاتكتاجكتتج 5 '-3' | 173 شركة بريتيش بتروليوم | ||
| عكس أجاككتكتكجاجتجتجاتاك 5 '-3' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | إلى الأمام--جاتككتكتككاجكتككا 5 '-3' | 133 bp | ||
| عكس جاتجااتككاككااجكتكا 5 '-3' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | إلى الأمام--تككاكجاججتكتكتكتك 5 '-3' | 107 bp | ||
| عكس أجاجكتجكاجاككاجتا 5 '-3' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | إلى الأمام--تكتجاجتكاتكتجكاجككا 5 '-3' | 133 bp | ||
| عكس أكككتكككجاجاتاكاكك 5 '-3' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | إلى الأمام--كاجتاككاجكتجكاجاجتجك 5 '-3' | 112 شركة بريتيش بتروليوم | ||
| عكس كاتكاككتككتكككتاجتكج 5 '-3' | |||||
الجدول 1: الإشعال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا العمل إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد للماوس تشولانجيوسيتيس أهبد أورجانوتيبيك. وتشمل الخطوات الهامة في توليد ثقافة عبدو تشريح عبد دقيق لتفادي التلوث خلية البنكرياس، الحفاظ على ظروف معقمة لمنع التلوث البكتيرية والفطرية، والتلاعب بعناية بعد الطرد المركزي لتجنب فقدان المواد الخلوية. مطلوب تمسك وثيق في ظروف الحرارة الموصوفة. وهناك بعض القيود على هذه التقنية. اهبدس الفئران الكبار صغيرة (حوالي 1 ملم في القطر؛ الشكل 1E)، التي تتطلب براعة للعزلة. يمكن استخدام مجهر تشريح لمساعدة مع التشريح.
الطابق السفلي مصفوفة المستخدمة في هذا البروتوكول هو مصفوفة بيولوجية التي تحتوي على عوامل النمو المعروفة وغير المعروفة19، تركيز التي يمكن أن تختلف من الكثير بالكثير. نوصي بأن ل replicates التقنية، تستخدم نفس الكثير و/أو قاسمة لمصفوفة الطابق السفلي لتجنب التقلبات. كما نوصي بالتحقق بشكل روتيني تحذير ل خلية ثقافة للتلوث مفطورة والمتوسطة مكيفة ل نشاط WNT11. مختبر لهذه الدراسة استخدمت أدوات الكشف مفطورة و WNT بنشاط الإنزيم على التوالي. جدير بالذكر أن المتوسطة ابدوس يحتوي على كمية منخفضة من مصل البقر الجنين (0.5%؛ جدول المواد).
البروتوكول قدم يصف ثقافة خلايا الظهارية 3 الأبعاد التي تحتوي على الخلايا مع السلف وميزت خلية علامات مميزة تشولانجيوسيتيس وشكلت حضور WNT3a، spondin1 آر، وعوامل النمو رأس وتعريفها المكملات الغذائية (الجدول للمواد). أنها خاصة بالجهاز، وهو مستمد من الكبار الماوس اهبدس. الأرجح أنه مشتق من خلايا البالغين مع خصائص الخلايا الجذعية يتجلى في خلية التنظيم الذاتي في هياكل ثلاثية الأبعاد والقدرة على الحفاظ عليها والتوسع في المدى الطويل. أورجانويدس أساسا الكيسي في الهيكل مع الحد الأدنى "مهدها،" التي قد تدل النمط الظاهري أورجانويد أكثر من مثل الخلايا الجذعية. فمن الممكن أن عوامل إضافية الخلايا الجذعية المتخصصة يمكن أن يؤدي إلى مستوى أعلى من كفاءة وطلاء أورجانويدس، فضلا عن درجة أعلى من التفريق.
لدينا تقنية تنتج ثقافة أورجانويد 3 الأبعاد التي يمكن إنشاؤها بطريقة فعالة من حيث وقت وتكلفة، مما يقلل من استخدام الحيوانات، واستنساخه بدرجة عالية، وتصاريح تطبيقات متعددة المتلقين للمعلومات. هذه الأداة الجديدة مهم لدراسات عبد، أدوات لدراسة اهبدس الكبار محدودة جداً. أنه سيكون من المزايا الخاصة للمختبرات التي لا يستطيعون الوصول إلى الأنسجة البشرية أو تريد الاستفادة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا.
الأنسجة الماوس، خلافا للأنسجة البشرية، الوصول للغاية. وهناك كواشف متعددة، بما في ذلك الأجسام المضادة إيمونوهيستوتشيميستري لدراسة الأنسجة الماوس. تكلفة المواد الكاشفة لثقافة الكبار الأنسجة أورجانويدس انخفض كثيرا منذ بدأ هذا الأسلوب في البداية. وبالإضافة إلى ذلك، أصبحت المواد الجديدة المتاحة، بما في ذلك المتوسط خلية مكيفة لتحذير المستخدمة في هذا البروتوكول، مما يقلل من زيادة تكلفة الثقافة أورجانويد. ابدوس سهلة للنشر، وتخزين، وعملية للتحليل. ويعرض المناعي، المجهرية، وتحاليل PCR قرت كأمثلة في هذه المخطوطة. بالإضافة إلى ذلك، وصف مجموعتنا مؤخرا توليد واستخدام ابدوس من الفئران المهندسة وراثيا وكوانتيتيشن لتكاثر الخلايا عبدو استخدام 5-اثينيل-2´-ديوكسيوريديني (إيدو)16.
التطبيقات النهائية المحتملة ابدوس تشمل ولكن لا تقتصر على استزراع كمية غير محدودة تقريبا من تشولانجيوسيتيس لدراسة آليات عبد تشولانجيوسيتي التوازن. وفي المستقبل، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الحالات المرضية؛ لاختبار أورجانويدس تشولانجيوسيتي، بما في ذلك تحليل الطب التجديدي (غرس إينترابيلياري) والتلاعب الجيني ودوائية والمخدرات اختبار16؛ وأن دراسة آثار العوامل المعدية12،20. يمكن دراسة التفاعل خلية خلية استخدام الثقافة المشارك من أورجانويدس أهبد ب أنواع الخلايا الأخرى21.
يمكن استخدام أورجانويدس المستمدة من الماوس للدراسات التجريبية قبل توليد اهبدوس البشرية، نظراً للمواد البشرية القيمة ومحدودة. ركزت الدراسات المستقبلية على اكتشاف العوامل التي تعزز مستوى أعلى من الكفاءة والطلاء وتمايز الخلايا أورجانويد المرغوب فيها لدراسة أورجانويدس البشري. الدراسات الجارية أن البحث عن مصفوفة خارج الخلية أكثر بيولوجيا محايدة للثقافة أورجانويد تتصل أيضا بصقل ثقافة اهبدوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها الرابطة الأمريكية لمنح "الدراسة ذروة أمراض الكبد" (ل N.R.) والمعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي (جوائز P30 DK34933 N.R.، DK062041 P01 إلى J.L.M.). ونحن نشكر الدكتور رامون أوكاديز رويز (جامعة ميشيغان) لمساعدته مع تطوير هذه المنهجية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F.
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L.
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
