Summary
Dit protocol beschrijft de productie van een muis extrahepatic gal 3-dimensionale organoid kanaalsysteem. Deze biliaire organoids kan worden gehandhaafd in cultuur te bestuderen van cholangiocyte biologie. Biliaire organoids express markers van voorlopercellen zowel biliaire cellen en zijn samengesteld uit gepolariseerde epitheliale cellen.
Abstract
Cholangiopathies, die gevolgen hebben voor extrahepatic galwegen (EHBDs), bevatten biliaire atresie, acute primaire scleroserende cholangitis en cholangiocarcinoma. Ze hebben geen effectieve therapeutische opties. Hulpmiddelen om te studeren EHBD zijn zeer beperkt. Ons doel was het ontwikkelen van een orgel-specifieke, veelzijdig, volwassen stamcel-afgeleid, preklinische cholangiocyte model dat gemakkelijk kan worden gegenereerd vanuit wild type en genetisch gemodificeerde muizen. Dus rapporteren wij over de nieuwe techniek van de ontwikkeling van een EHBD organoid (EHBDO) cultuur systeem van volwassen muis EHBDs. Het model is kostenefficiënt, kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd, en heeft meerdere downstream toepassingen. Specifiek, beschrijven we de methodologie van muis EHBD isolatie en eencellige dissociatie, organoid cultuur initiatie, voortplanting, en op lange termijn onderhoud en opslag. Dit manuscript wordt ook beschreven EHBDO verwerking voor immunohistochemistry, fluorescent microscopie en mRNA overvloed kwantificatie door real-time kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie (qRT-PCR). Dit protocol heeft belangrijke voordelen naast EHBD-specifieke organoids produceren. Het gebruik van een geconditioneerde medium uit L-WRN cellen aanzienlijk vermindert de kosten van dit model. Het gebruik van de muis EHBDs biedt bijna onbeperkte weefsel voor cultuur generatie, in tegenstelling tot menselijk weefsel. Gegenereerde muis EHBDOs bevatten een zuivere bevolking van epitheliale cellen met markeringen van endodermal voorlopercellen en gedifferentieerde biliaire cellen. Gekweekte organoids handhaven van homogene morfologie door meerdere passages en kunnen worden hersteld na een langdurige opslagperiode in vloeibare stikstof. Het model staat voor de studie van biliaire progenitor celproliferatie, farmacologisch kan worden gemanipuleerd en kan worden gegenereerd op basis van genetisch gemodificeerde muizen. Toekomstige studies zijn nodig om het optimaliseren van de kweekomstandigheden om efficiëntie van de beplating, evalueren functionele cel volwassenheid, en directe celdifferentiatie. Ontwikkeling van co cultuur modellen en een meer biologisch neutraal extracellulaire matrix zijn ook wenselijk.
Introduction
Cholangiopathies zijn ongeneeslijke chronische progressieve aandoeningen die invloed hebben op biliaire cellen gelegen in intra- en extrahepatic biliaire leidingen (EHBDs)1. Sommige cholangiopathies, zoals acute primaire scleroserende cholangitis, cholangiocarcinoma, biliaire atresie en choledochal cysten, is hoofdzakelijk van invloed op EHBDs. Ontwikkeling van therapieën voor cholangiopathies wordt beperkt door de beperkte beschikbaarheid van preklinische modellen. Bovendien, eerdere studies gericht op cholangiopathies gegroepeerd: lever, intra- en EHBDs. Echter, intra- en EHBDs hebben een aparte embryonale oorsprong en, dus, moet worden beschouwd als afzonderlijke moleculaire pathologie. Intrahepatische galwegen ontwikkelen van de Intrahepatische ductaal platen en de craniale deel van hepatische diverticulum, de ontwikkeling van de hele EHBDs van de staartzijde van het hepatische diverticulum2. Zij vertrouwen ook op verschillende progenitor cel compartimenten voor volwassen homeostase, met inbegrip van grachten van Hering in Intrahepatische galwegen en peribiliary klieren in EHBDs2,3. Gebruik van diermodellen voor preklinische studies wordt beperkt door de kosten en moet worden geminimaliseerd om ethische redenen. Daarom zijn reductionistische, reproduceerbaar, tijd en kosten-efficiënte in-vitro modellen zeer wenselijk.
Meeste voorafgaande studies van cholangiopathies gebruikt normale muis of rat kanker modellen, of menselijke cholangiocarcinoma cellijnen afgeleid van intra- en EHBDs4,,5,,6,7. Echter, deze zijn modellen van getransformeerde cellen en doen niet recapituleren normale cholangiocyte biologie op homeostase of in een gezonde staat. Recente vooruitgang in de ontwikkeling van organotypic cultuur modellen heeft toegestaan de ontwikkeling van 3-dimensionale structuren van de verschillende weefselsoorten, met inbegrip van hepatobiliaire weefsels, hoewel niet normale muis EHBDs8,9, 10. Deze structuren "orgel-achtige" gericht op het nabootsen van primaire weefsel en worden geteeld in een kunstmatige niche ondersteuning zelf-vernieuwing van de orgel-specifieke stam/voorlopercellen cellen11.
"Organoid" is een brede term die de meeste vaak beschrijft 3-dimensionale weefsel modellen afgeleid van stamcellen. Organoids kan worden gegenereerd vanuit geherprogrammeerde pluripotente stamcellen vertegenwoordigd door embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Ze kunnen ook worden gegenereerd vanuit orgel-specifieke adulte stamcellen12. Sommige cholangiocyte organoid modellen zijn voorgesteld in vorige onderzoeken. Dus, organoids afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen zijn gerapporteerde7,9,13 en bieden een waardevolle, tijd efficiënt hulpmiddel waarmee voor gelijktijdige opwekking van verschillende celtypes. Echter komen deze pluripotente stamcel afkomstige organoids niet volledig overeen met de structuur en de functionaliteit van primaire volwassen EHBD cholangiocytes.
Organoids afgeleid van adulte stamcellen van het menselijke9 en katachtige10 lever werden ook voorgesteld. Katachtige modellen zijn niet overal verkrijgbaar en hebben beperkte hulpprogramma arsenaal voor studiedoeleinden. Deze lever afkomstige volwassen stamcel afkomstige organoids doen bovendien niet extrahepatic cholangiocytes maar eerder Intrahepatische cholangiocytes model.
EHBD organoid generatie werd gemeld uit menselijke normale EHBDs14 en muis EHBD cholangiocarcinoma15. Echter toegang tot menselijke weefsels EHBD is zeer beperkt, en organoids afgeleid van een genetische lymfkliertest model van cholangiocarcinoma15 vertegenwoordigen niet gezond cholangiocyte biologie aan homeostase en zijn afgeleid van genetisch gemodificeerde cellen.
Om de beperkingen van pluripotente stamcel - en lever-afgeleide cholangiocyte organoid modellen en de beperkte toegang tot menselijke weefsels, in preklinische modellen nodig, ontwikkelden we een lymfkliertest EHBD organoid model (figuur 1A). Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een techniek voor muis EHBD afkomstige organoids uit volwassen weefsel. Deze EHBD organoids genaamd EHBDOs zal een belangrijk in vitro instrument zijn voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de EHBDs cholangiocyte homeostase en ziekte processen, zoals cholangiopathies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. bereiding van uitrusting en materiaal voor muis EHBD isolatie
- Bereiden seeding medium en wassen buffer (Tabel van materialen) in 50 mL conische buizen en houden hen bij 4 ° C of op ijs tot gebruik.
- Een chirurgische tabel (figuur 1B) instellen. Bereiden gesteriliseerde chirurgische instrumenten (Figuur 1 c).
- Plaats een steriele 24-well-plaat in de incubator weefselkweek 37 ° C om vooraf het te warm.
- Plaats een aliquoot deel van kelder matrix op ijs. Kelder matrix alleen gebruiken wanneer het volledig is vloeibaar.
2. EHBD isolatie en gal Organoid cultuur
-
Isolatie en voorbereiding van een enkele celsuspensie van muis EHBD
- Een volwassen muis (ouder dan 2 maanden) volgens de richtlijnen van de institutionele euthanaseren. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een liggende positie. Open de buikholte met behulp van een middellijn aanpak en intrekken van de lever om te rusten op het middenrif.
- Identificeer de Galgang die zich onmiddellijk onder de lever Hilus door zachtjes te trekken van de proximale twaalfvingerige darm met een hemostat. EHBD scheiden van de omliggende weefsels met behulp van een scalpel blad. Houd het proximale einde van de Galgang met een tang en ontleden van het distally net boven haar moment met de twaalfvingerige darm, dan ontleden de proximale einde van de buis van de lever (Figuur 1 d). Onmiddellijk in koud wassen buffer geïsoleerde EHBD (figuur 1E) te plaatsen.
- De EHBD verwijderen uit de buffer wassen en gehakt in 0.5 mm secties met een steriel scalpel blad. Plaats het weefsel op een glazen plaat op ijs tijdens de procedure (figuur 1B).
- Plaats de EHBD secties in een buis met 500 µL van de dissociatie-buffer. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Neutraliseer de dissociatie buffer door 500 µL cultuurmedium ijskoude cel toe te voegen.
- Triturate de celsuspensie naar boven en beneden de 18 en 20 G naalden, 20 keer elk modeltraject. Filtreer de celsuspensie door een 70 µm cel zeef en vang de doorstroming in een tube van 50 mL.
Opmerking: Voorwaarde vooraf de zeef met 500 µL van steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat er wordt gefilterd om de passage van de celsuspensie.
-
Tot oprichting van EHBD organoids
- Centrifugeer de doorstroming uit stap 2.1.5 bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 mL ijskoud steriel PBS. Breng de hersuspensie in een nieuwe 1,5 mL-buis. Herhaal stap 2.2.1.
- Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig het supernatant uit gewassen cellen verzameld aan de onderkant van de buis. Resuspendeer de pellet cel in 120 µL van vloeibaar ijskoude kelder matrix door pipetteren op en neer met behulp van P200 tips.
Opmerking: Cel pellet hersuspensie in kelder matrix moet worden uitgevoerd op ijs-bad. - Plaat 40 µL van de cel hersuspensie in kelder matrix in het midden van een goed in een voorverwarmde 24-well-plate.
Opmerking: Vermijd het suctioning van lucht terwijl het manipuleren van de kelder matrix om te voorkomen dat de formatie van de zeepbel. - Terug naar de plaat met cellen geresuspendeerde in kelder matrix de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 15 minuten of totdat de kelder matrix is gestold. Voeg 600 µL van het seeding medium opgewarmd tot 37 ° C aan elk putje (Tabel van materialen). De plaat terug naar de 37 ° C weefselkweek incubator.
- Vervang het seeding medium met 600 µL van het kweekmedium verse organoid in 3 dagen en daarna om de 3 dagen. Monitor organoid groei met een omgekeerde Microscoop. Gebruik organoids voor een stroomafwaartse toepassing of split elke 7 tot 9 dagen vóór de ophoping van puin en organoid ineenstorting van de intraluminale worden waargenomen (figuur 2A).
3. EHBD Organoid Passage en opslag
-
Passage van EHBD organoids 1:3 tot en met 1:4 elke 7 tot en met 9 dagen
- Verwijder het medium uit de put en Voeg 400 µL van ijskoude PBS. Resuspendeer de organoids door zachtjes pipetteren het mengsel op en neer 10 keer in de put. Breng het mengsel tot een 1,5 mL koker.
- Passage het mengsel door een 25 G naald 4 keer te distantiëren van de organoids. Centrifugeer het mengsel bij 400 x g gedurende 4 min bij 4 ° C.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in de kelder matrix (1:3 tot en met 1:4) voor verder kweken (stap 2.2.4.) of de cellen met ijs koud PBS wassen voor verdere verwerking.
Opmerking: 250-300 cellen zijn meestal verzinkt in de 24-well plaat voor downstream toepassingen. Plating efficiëntie kan worden geëvalueerd door heldere veld microscopie met behulp van een omgekeerde Microscoop op dag 3-5 na passaging door het aantal organoids tellen en hun procent ten opzichte van de oorspronkelijke cel nummer te berekenen. mRNA kan worden geïsoleerd van EHBDOs gewassen in PBS met het standaard protocol met behulp van guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie.
-
Langdurige opslag van EHBD organoids
- Verwijder het medium uit de put en wassen van de organoids met kamertemperatuur PBS. PBS verwijderen uit de put zonder verstoring van de daling van de matrix kelder.
- Voeg 500 µL van ijskoude cel bevriezing medium naar de waterput. Zachtjes resuspendeer de organoids in vloeibaar kelder matrix en cel bevriezing van middellange en breng het mengsel in cryogene flesjes.
- De flesjes bij-80 ° C gedurende 48 h. overdracht de flesjes aan een stikstof tank voor opslag op lange termijn in een damp fase opslaan.
4. EHBD Organoid Pprocessing voor het insluiten van paraffine
- Resuspendeer de EHBDOs in 500 µL van ijskoude PBS (4 ° C) door pipetteren op en neer 5 tot 10 keer. Verzamelen geresuspendeerde EHBDO in vloeibaar kelder matrix in een 1,5 mL-buis.
Opmerking: Om te voorkomen breken organoids, afgesneden van de onderkant 2-3 mm van een P1000 tip en verwijder de bovendrijvende vloeistof zeer zorgvuldig. - Centrifuge EHBD organoids bij 350 x g gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de organoid pellet.
- Voeg 1 mL ijskoud 4% paraformaldehyde (PFA) tot de organoids en Incubeer de organoids in 4% PFA overnacht bij 4° C. Verwijderen van 4% PFA uit de organoids met behulp van een P1000 tip na een incubatieperiode van de overnachting.
- 1000 µL van kamertemperatuur PBS toevoegen aan de buis met de organoids en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer de buis met organoids in PBS bij 350 x g gedurende 5 min. herhalen dit proces nog tweemaal.
- Verwijderen van PBS en voeg 1 mL 30% ethanol tot de organoids. Incubeer gedurende 5 min op RT.
- Centrifugeer de buis bij 350 x g gedurende 5 min op RT. verwijderen 30% ethanol. Voeg 1 mL 70% ethanol en incubeer gedurende 5 min op RT.
- Centrifugate bij 350 x g gedurende 5 min. verwijderen 70% ethanol. Voeg 1 mL 100% ethanol en incubeer gedurende 5 min op RT.
Opmerking: Organoids kan worden gehouden in 100% ethanol bij kamertemperatuur voor tot 48u vóór verdere verwerking. - Verwarm specimen verwerking gel in een magnetron voor 20 s of totdat het vloeibaar. Voeg 50 µL van specimen gel in de buis met organoids verwerking. Plaats de buis op ijs totdat het specimen verwerking gel is gestold.
- Verwijder de daling van het specimen verwerking gel met organoids uit de buis en plaats tussen de blauwe spons pads in een cassette voor verdere verwerking in de weefsel-processor. Gebruik 15 minuten voor elke stap in de paraffine-embedder tijdens de verdere verwerking...
- Sectie paraffine-ingebedde organoids in monster verwerking gel op 4 µm. doorgaan met immunohistochemische kleuring als eerder beschreven16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ons protocol beschrijft de generatie van muis EHBD organoids die weefsel-specifieke en volwassen stamcel-afgeleide. Nadat de organoids worden gekweekt, kan een cystic Structuurformatie zo spoedig 1 dag na de EHBD-isolatie worden waargenomen. Besmetting met fibroblasten meestal niet wordt nageleefd tijdens het genereren van de cultuur. EHBDO plating efficiëntie is ongeveer 2% wanneer geïsoleerd van neonatale of volwassen (ouder dan 2 maanden) muizen (figuur 2B). Efficiëntie van EHBD organoids plating afgeleid van volwassen muizen verhogingen tot 11% in passage 2 en blijft stabiel (figuur 2B). De meerderheid van organoids tonen cystic morfologie door alle passages, met zeldzame "onregelmatige" organoids (figuur 2C-E). Organoids bereiken een groei piek op 5-7 dagen waarna ze beginnen met accumulatie intraluminale puin en verslechteren (figuur 2A). Dus voor onderhoud van de organoid cultuur, moeten ze worden verdeeld om 7-10 dagen (figuur 2A). Zodra vastgesteld en wanneer op de juiste wijze verwerkt, kan organoids worden gehandhaafd in cultuur bijna voor onbepaalde tijd (culturen werden waargenomen omhoog tot 14 maanden). Om te voorkomen dat cultuur besmetting met gedifferentieerde cellen overgenomen uit de oorspronkelijke cel isolatie, gebruik organoids gepasseerd ten minste tweemaal alvorens ze te gebruiken voor een stroomafwaartse toepassing. Gebruik voor langdurige opslag, eerdere passage (tot doorgang 7) organoids, omdat zij hogere efficiëntie van de beplating na herstel uit opslag hebben.
Wanneer geanalyseerd met immunofluorescentie, bestaan EHBDOs uit een zuivere bevolking van epitheliale cellen gekenmerkt door E-cadherine (figuur 3A-C). Organoid cellen tonen markers van biliaire voorlopercellen (Pancreatic en duodenale Homeobox 1 (PDX1); Figuur 3A) evenals markers van biliaire differentiatie (cytokeratin 19 (CK19) en Sex-bepalen regio Y-Box 9 (SOX9); Figuur 3B, C). Nog belangrijker is, een hoog percentage van organoid cellen bezitten een primaire cilium gekenmerkt door geacetyleerd α-tubuline (a-AT; Figuur 3D), die is een functie van normale cholangiocytes en stelt de passende organoid cel polarisatie. De expressie van merkers van voorlopercellen (Pdx1) en biliaire gedifferentieerde cellen [Ck19, Sox9, Aquaporin 1 (Aqp1), Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator van huidgeleiding(Cftr)] kan ook worden bevestigd door real-time kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie (qRT-PCR) (tabel 1). Combinatie van deze markers is karakteristiek voor cholangiocytes in EHBDs14,17,18.
Kortom, dit protocol beschrijft de generatie van een organoid cultuur model van gepolariseerde biliaire epitheliale cellen uiten van voorlopercellen en gedifferentieerde markeringen. Dit systeem kan worden gehandhaafd in cultuur voor een verlengde tijd zonder veranderingen in de morfologie, opgeslagen op lange termijn, en geanalyseerd met immunohistochemistry en qRT-PCR.
Figuur 1 : Schematische van de EHBD organoid cultuur generatie en chirurgische set up (A). schematische van EHBD organoid generatie. (B). chirurgische gebied was ingesteld voor EHBD isolatie en een glasplaat (stippellijn) gehouden op een bakje ijs te allen tijde opgenomen. (C). steriele chirurgische apparatuur inbegrepen scherpe schaar, rechte en gebogen getande pincet, hemostat en scalpel. (D en E) EHBD is geïsoleerd van het omgevende weefsel van het bindweefsel en alvleesklier gevolgd door zorgvuldige dissectie proximally uit de Intrahepatische galwegen en lever (D, pijl), en distally van de twaalfvingerige darm (D, pijl). Liniaalmarkeringen = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : EHBDO cultuur. (A). microscopische beelden van EHBDOs over een 12-daagse cursus. (B). Plating efficiëntie van organoids afgeleid van de neonatale (2 muizen per cultuur, n = 3 culturen) en volwassenen (> 2 maanden oud, 1 muis per cultuur, n = 3 culturen) muizen nadat plating 300 cellen per putje in 24-well plaat en opsommen van organoids gevestigde op dag 5 van cultuur. (C en D) EHBDO cystic versus onregelmatige morfologie werd geanalyseerd door microscopie. (E). het percentage van cystic en onregelmatig gevormde organoids werd geanalyseerd in vroeg (< 10) en eind (≥10) organoid passages. Schaal bars = 500 µm. kwantitatieve gegevens toonde als gemiddelde +/-standaardfout van het gemiddelde (SEM), t-testen. NS = niet significant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : EHBDOs express markers van voorlopercellen en volwassen biliaire cellen. (A-C). EHBDOs werden geanalyseerd door immunofluorescentie kleuring voor markeringen epitheliale (A, B. E-cadherine, rood), voorvader (A. PDX1, groen), en gedifferentieerde (B. CK19, groen; en C. a-AT, rode) biliaire cellen. Schaal bars = 25 µm. *, lumen. (D). EHBDOs werden geanalyseerd voor de overvloed van Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1en Cftr mRNA door qRT-PCR (gemiddeld +/-SEM ten opzichte van de expressie van Hprt). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Gen | Toetreding nummer | Primer volgorde | Grootte product | ||
| HPRT | NM_013556 | Doorsturen van 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3' | 173 bp | ||
| Reverse-5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | Doorsturen van 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3' | 133 bp | ||
| Reverse-5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | Doorsturen van 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3' | 107 bp | ||
| Reverse-5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | Doorsturen van 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3' | 133 bp | ||
| Reverse-5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | Doorsturen van 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3' | 112 bp | ||
| Reverse-5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3' | |||||
Tabel 1: inleidingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft de generatie van een 3-dimensionaal model van de organotypic van muis EHBD cholangiocytes. Belangrijke stappen in de EHBDO cultuur generatie omvatten nauwgezet EHBD dissectie Voorkom alvleesklier cel besmetting, onderhoud van steriele omstandigheden ter voorkoming van bacteriële en schimmelinfecties besmetting en zorgvuldige manipulatie na het centrifugeren om te voorkomen dat de verlies van celmateriaal. Een nauwe aanhankelijkheid aan beschreven temperatuursomstandigheden is vereist. Er zijn enkele beperkingen aan de techniek. EHBDs van volwassen muizen zijn klein (ongeveer 1 mm in doorsnede; Figuur 1E), waarvoor finesse voor isolatie. Een dissectie-Microscoop kan worden gebruikt om te helpen met dissectie.
Kelder matrix gebruikt in dit protocol is een biologische matrix waarin bekende en onbekende groeifactoren19, de concentratie daarvan van veel te veel variëren kan. Het is raadzaam voor technische replicaten, het dezelfde partij en/of de hoeveelheid kelder matrix worden gebruikt om te voorkomen dat de variabiliteit. Wordt ook aangeraden regelmatig controle van cultuur van de cel van de L-WRN besmetting met mycoplasma en geconditioneerde medium voor WNT activiteit11. Het lab voor deze studie gebruikt een Mycoplasma detectie kit en de WNT activiteit assay respectievelijk. Met name bevat EHBDOs medium lage hoeveelheid foetale runderserum (0,5%; Tabel van materialen).
Het gepresenteerde protocol beschrijft een 3-dimensionale epitheliale celcultuur met cellen met voorlopercellen en gedifferentieerde cel markeringen karakteristiek voor cholangiocytes en gevormd in aanwezigheid van WNT3a, R-spondin1 en Noggin groeifactoren en gedefinieerd supplementen (Tabel van materialen). Orgel-specifieke, is zoals het is afgeleid van volwassen muis EHBDs. Het is waarschijnlijk afgeleid van volwassen cellen met eigenschappen van de cel van de stam blijkt uit de cel zelf-organisatie in de 3-dimensionale structuren en het vermogen worden gehandhaafd en uitgebreid op lange termijn. De organoids zijn voornamelijk cystic in structuur met minimale "ontluikende," die zou kunnen op een meer stamcel-achtige organoid fenotype wijzen. Het is mogelijk dat de cel van de stam van de extra niche factoren tot een hogere efficiëntie van de beplating van organoids, alsmede een hogere graad van differentiatie leiden kunnen.
Onze techniek produceert een 3-dimensionale organoid cultuur die kan worden gegenereerd in een tijd - en kosten-efficiënte manier die minimaliseert dierlijke gebruik, zeer reproduceerbaar en meerdere downstream toepassingen toelaat. Dit nieuwe instrument is belangrijk voor EHBD studies, aangezien tools om te studeren volwassen EHBDs zeer beperkt zijn. Het zou van bijzondere voordelen aan laboratoria die niet beschikken over menselijke weefsels of wilt profiteren van genetisch gemodificeerde Muismodellen.
Muis weefsel, in tegenstelling tot menselijk weefsel, is zeer toegankelijk. Er zijn meerdere reagentia, met inbegrip van immunohistochemistry antistoffen muis weefsels bestuderen. De kosten van reagentia aan cultuur volwassen weefsel organoids is aanzienlijk gedaald omdat deze techniek werd aanvankelijk ingevoerd. Daarnaast zijn nieuwe materialen beschikbaar, met inbegrip van het L-WRN cel geconditioneerd medium gebruikt in dit protocol, waardoor verdere organoid cultuur kosten geworden. EHBDOs zijn gemakkelijk te verspreiden, op te slaan, en het proces voor analyse. De immunohistochemische, microscopische, en qRT-PCR-analyses worden gepresenteerd als de voorbeelden in dit manuscript. Bovendien, beschreven onze fractie onlangs generatie en het gebruik van EHBDOs van genetisch gemanipuleerde muizen en kwantificatie van EHBDO celproliferatie met behulp van de 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU)16.
Stroomafwaarts toepassingsmogelijkheden van EHBDOs omvatten maar zijn niet beperkt tot het kweken van een bijna onbeperkt aantal cholangiocytes te bestuderen van de mechanismen van EHBD cholangiocyte homeostase. In de toekomst kan dit protocol worden toegepast op de studie van ziekte staten; voor het testen van cholangiocyte organoids, met inbegrip van analyse van regeneratieve geneeskunde (intrabiliary implantatie), genetische en farmacologische manipulatie, drug testende16; en de effecten van infectieuze agentia12,20te bestuderen. Cel-cel interactie kan worden bestudeerd met behulp van co cultuur van EHBD organoids met andere cel typen21.
Muis afkomstige organoids kan worden gebruikt voor pilotstudies voorafgaand aan de generatie van menselijke EHBDOs, omdat menselijk materiaal waardevol en beperkt is. Toekomstige studies gericht op de ontdekking van de factoren die hogere plating efficiëntie bevorderen en organoid celdifferentiatie gewenst zijn voor studie van menselijke organoids. Lopende studies die naar een meer biologisch neutraal extracellulaire matrix voor cultuur van de organoid zoeken zijn ook relevant is voor de EHBDOs cultuur verfijning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse Vereniging voor de studie van lever ziekten Pinnacle award (naar N.R.) en de National Institutes of Health, nationale Instituut van Diabetes en spijsverterings- en nierziekten (awards P30 DK34933 aan N.R., P01 DK062041 aan J.L.M.). Wij danken Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) voor zijn hulp bij de ontwikkeling van deze methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F.
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L.
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
