Summary
यह प्रोटोकॉल एक माउस प्रत्यययकृत पित्त वाहिनी 3 आयामी अंगोइड प्रणाली के उत्पादन का वर्णन करता है । इन पित्त ऑर्गेनॉयड संस्कृति में रखा जा सकता है cholangiocyte जीवविज्ञान का अध्ययन । बिलियरी आर्गेनॉइड, दोनों प्रजनक और पित्त कोशिकाओं के मार्कर को अभिव्यक्त करता है और ध्रुवित उपकला कोशिकाओं से बना होता है ।
Abstract
Cholangiopathies, जो प्रत्यययकृत पित्त नलिकाओं (EHBDs) को प्रभावित करते हैं, पित्त अविवरता, प्राथमिक स्कलेरोसिंग चोलवाहिकाशोथ, और cholangiopathies शामिल हैं । वे कोई प्रभावी उपचारात्मक विकल्प नहीं है । EHBD का अध्ययन करने के लिए उपकरण बहुत सीमित हैं । हमारा उद्देश्य एक अंग के विकास के लिए विशिष्ट, बहुमुखी, वयस्क स्टेम सेल व्युत्पंन, पूर्व नैदानिक cholangiocyte मॉडल है कि आसानी से जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से उत्पंन किया जा सकता है । इस प्रकार, हम वयस्क माउस Ehbd से एक EHBD आर्गेनोइड (EHBD) संस्कृति प्रणाली के विकास की उपंयास तकनीक पर रिपोर्ट । मॉडल लागत कुशल, आसानी से विश्लेषण किया जा करने में सक्षम है, और कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों है । विशेष रूप से, हम माउस ehbd अलगाव और एकल कोशिका वियोजन, अंगाभ संस्कृति दीक्षा, प्रचार, और दीर्घकालिक रखरखाव और भंडारण की पद्धति का वर्णन । इस पांडुलिपि में इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए EHBDO प्रोसेसिंग, और रियल-टाइम क्वांटिटेटिव रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा एमआरएनए प्रचुरता के बारे में भी बताया गया है । इस प्रोटोकॉल में EHBD-विशिष् ट ऑर्गेनॉइड उत् पन् न करने के अतिरिक् त महत् वपूर्ण लाभ हैं एल-WRN कोशिकाओं से एक वातानुकूलित माध्यम का उपयोग काफी इस मॉडल की लागत कम कर देता है । माउस EHBDs का उपयोग संस्कृति पीढ़ी के लिए मानव ऊतक के विपरीत, लगभग असीमित ऊतक प्रदान करता है । उत्पन्न माउस EHBDOs अंतर्त्वचीय जनक और विभेदक पित्त कोशिकाओं के मार्कर के साथ उपकला कोशिकाओं की एक शुद्ध जनसंख्या होते हैं । संवर्धित ऑर्गेनॉइड कई मार्ग के माध्यम से समरूप आकारिकी बनाए रखते हैं और तरल नाइट्रोजन में एक दीर्घकालिक भंडारण अवधि के बाद पुनर्प्राप्त किया जा सकता है । मॉडल पित्त जनक सेल प्रसार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, औषधीय हेरफेर किया जा सकता है, और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से उत्पंन किया जा सकता है । भविष्य के अध्ययन आदेश चढ़ाना दक्षता बढ़ाने के लिए, कार्यात्मक सेल परिपक्वता का मूल्यांकन करने के लिए संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन करने की जरूरत है, और सीधे कोशिका भेदभाव । सह-संस्कृति मॉडलों का विकास और अधिक जैविक रूप से तटस्थ बाह्य-कोशिकीय मैट्रिक्स भी वांछनीय है ।
Introduction
कोलेंगियोपैथी लाइलाज जीर्ण प्रगतिशील विकार है कि पित्त कोशिकाओं को प्रभावित अंतर और प्रत्यययकृत पित्त नलिकाओं (EHBDs)1में स्थित हैं । कुछ cholangiopathies प्राथमिक स्कलेरोसिंग चोलवाहिनीशोथ, cholangiopathies, पित्त अविवरता, और choledoंचल अल्सर की तरह, मुख्य रूप से EHBDs को प्रभावित करते हैं । Cholangiopathies के लिए चिकित्सा के विकास के पूर्व नैदानिक मॉडलों की सीमित उपलब्धता द्वारा प्रतिबंधित है । इसके अलावा, पिछले अध्ययनों में एक साथ समूहीकृत cholangiopathies पर ध्यान केंद्रित: जिगर, इंट्रा, और EHBDs । हालांकि, इंट्रा और EHBDs एक अलग भ्रूण मूल है और इस प्रकार, अलग आणविक विकृतियों के रूप में माना जाना चाहिए । Intrahepatic पित्त नलिकाओं और यकृत अंधवर्धी के कपाल भाग से विकसित, पूरी ehbds यकृत अंधवर्ध2के पुच्छीय भाग से विकसित । वे भी वयस्क homeostasis के लिए विभिंन प्रजनक कोशिका डिब्बों पर निर्भर, अंतःयकृत पित्त नलिकाओं और ehbds2,3में periपित्त ग्रंथियों में hering के नहरों सहित । पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए पशु मॉडलों का उपयोग खर्च द्वारा सीमित है और नैतिक कारणों के लिए कम किया जाना चाहिए । इसलिए, reductionist, reproducible, समय और लागत कुशल इन विट्रो मॉडल बहुत वांछनीय हैं ।
अधिकांश पूर्व अध्ययन के cholangiopathies सामान्य माउस या चूहे के कैंसर के मॉडल का उपयोग किया, या मानव cholangiopathies सेल लाइनों intra और ehbds4,5,6,7से व्युत्पन्न. हालांकि, इन रूपांतरित कोशिकाओं के मॉडल हैं और सामान्य cholangiocyte जीव विज्ञान homeostasis में या एक स्वस्थ राज्य में फिर से करना नहीं है । Organotypic संस्कृति मॉडल के विकास में हाल ही में प्रगति विभिन्न ऊतक प्रकार से 3 आयामी संरचनाओं के विकास की अनुमति दी है, hepatobilliऊतकों सहित, हालांकि नहीं सामान्य माउस ehbds8,9, १०। ये "अंग की तरह" संरचनाओं प्राथमिक ऊतक नकल उतार के उद्देश्य से और एक कृत्रिम जगह में बड़े हो रहे हैं आत्म समर्थन अंग के नवीकरण-विशिष्ट स्टेम/
"Organoid" एक व्यापक शब्द है कि सबसे अधिक 3 आयामी ऊतक स्टेम सेल से व्युत्पंन मॉडल का वर्णन है । ऑर्गेनॉइड भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल द्वारा प्रतिनिधित्व reprogrammed pluripotent स्टेम कोशिकाओं से उत्पंन किया जा सकता है । वे भी अंग विशिष्ट वयस्क स्टेम सेल से उत्पंन किया जा सकता है12। पिछले शोध अध्ययनों में कुछ कोलेंगियोसाइट ऑर्गेनॉइड मॉडलों का प्रस्ताव किया गया है । इस प्रकार, मानव pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पंन ऑर्गेनॉयड7,9,13 की सूचना दी गई है और एक मूल्यवान, समय कुशल उपकरण है कि विभिंन प्रकार के सेल के एक साथ पीढ़ी के लिए अनुमति देता है प्रदान करते हैं । हालांकि, इन pluripotent स्टेम सेल व्युत्पंन organoids पूरी तरह से संरचना और प्राथमिक वयस्क EHBD cholangiocytes की कार्यक्षमता को प्रतिबिंबित नहीं करते ।
ह्यूमन9 और फेलीन10 लिवर की एडल्ट स्टेम सेल से व्युत्पन्न ऑर्गेनॉयड भी प्रस्तावित किया गया । Feline मॉडल व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है और अध्ययन के प्रयोजनों के लिए सीमित उपकरण armamentarium है । इसके अलावा, इन यकृत प्राप्त वयस्क स्टेम सेल व्युत्पंन ऑर्गेनॉइड न मॉडल प्रत्यययकृत cholangiocytes बल्कि अंतःयकृत cholangiocytes ।
मानव सामान्य Ehbd14 और माउस ehbd cholangiocarcinoma15से ehbd ऑर्गेनॉइड जनरेशन की सूचना दी गई थी । हालांकि, मानव EHBD ऊतक के लिए उपयोग बहुत सीमित है, और organoids cholangiocarcinoma के एक आनुवंशिक murine मॉडल से व्युत्पंन15 homeostasis में स्वस्थ cholangiocyte जीव विज्ञान का प्रतिनिधित्व नहीं करते है और आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं ।
Pluripotent स्टेम सेल की सीमाओं को संबोधित करने के लिए-और जिगर से व्युत्पन्न कोलीनाओसाइट अंगाभ मॉडल और पूर्व नैदानिक मॉडलों में आवश्यक मानव ऊतकों के लिए सीमित पहुँच, हम एक murine ehbd आर्गेनोइड मॉडल विकसित (चित्र 1ए). इस पांडुलिपि माउस EHBD के लिए एक तकनीक के विकास का वर्णन-वयस्क ऊतक से organoids व्युत्पंन । EHBDOs नाम के ये EHBD ऑर्गेनॉयड इन विट्रो टूल के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण होगा, जो Ehbd कोलेनिओनाइट होमियोसाइट और रोग प्रक्रियाओं, जैसे कि कोलीवाहियोपैथी के रूप में अंतर्निहित है ।
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Protocol
यहां बताए गए सभी तरीकों को मिशिगन यूनिवर्सिटी की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर ऐंड यूज कमिटी (IACUC) ने मंजूरी दे दी है ।
1. माउस EHBD अलगाव के लिए उपकरण और सामग्री की तैयारी
- बोने की तैयारी मध्यम और धोने बफर (सामग्री की मेज) ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखने के उपयोग तक ।
- एक सर्जिकल तालिका सेट करें (चित्र 1b) । रोगाणुरहित शल्य चिकित्सा उपकरणों तैयार (चित्रा 1 सी).
- ३७ ° c ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में एक बाँझ 24-कूप प्लेट को पहले से गर्म करने के लिए रखें ।
- बर्फ पर तहखाने मैट्रिक्स का एक aliquot प्लेस । बेसमेंट मैट्रिक्स का प्रयोग तभी करें जब यह पूरी तरह से लिक्विफाइड हो ।
2. EHBD अलगाव और पित्त Organoid संस्कृति
-
अलगाव और माउस EHBD के एक एकल कोशिका निलंबन की तैयारी
- एक वयस्क माउस (2 महीने से अधिक पुराने) संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार euthanize । चूहे को लापरवाह स्थिति में रखें । एक मध्यरेखीय दृष्टिकोण का उपयोग कर उदर गुहा खोलें और डायाफ्राम पर आराम करने के लिए जिगर को वापस लेना ।
- एक hemostat के साथ धीरे से समीपस्थ ग्रहणी खींच द्वारा जिगर hilum नीचे तुरंत स्थित आम पित्त वाहिनी की पहचान । एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर आसपास के ऊतकों से अलग EHBD । संदंश के साथ आम पित्त नली के समीपस्थ अंत होल्डिंग, यह अलग करना बस ग्रहणी के साथ अपने मोड़ से ऊपर, तो जिगर से वाहिनी के समीपस्थ अंत काटना (चित्रा 1d) । तत्काल अलग EHBD (चित्रा 1E) ठंडे धोने बफर में जगह है ।
- एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग ०.५ mm वर्गों में धोने बफर और कीमा से ehbd निकालें । प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर एक ग्लास प्लेट पर ऊतक रखें (चित्र 1b) ।
- EHBD अनुभागों को वियोजन बफ़र की ५०० μL युक्त ट्यूब में रखें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेक्यूबेट । बर्फ-शीत कोशिका संस्कृति माध्यम के ५०० μL जोड़कर वियोजन बफर बेअसर ।
- Triturate अप और 18 जी और 20 जी सुई, 20 बार प्रत्येक के माध्यम से प्रगति नीचे सेल निलंबन । एक ७० μm कोशिका छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
नोट: पूर्व-स्थिति के साथ छलनी ५०० μL बाँझ फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) से पहले के लिए सेल निलंबन के पारित होने की सुविधा के लिए फ़िल्टरिंग ।
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EHBD ऑर्गेनॉइड की स्थापना
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर चरण 2.1.5 से प्रवाह के माध्यम से अपकेंद्रित्र ।
- सावधानी से सुपरनेटंट को हटा दें । बर्फ-शीत बाँझ PBS के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित । एक नए १.५ मिलीलीटर ट्यूब में पुनः निलंबन स्थानांतरण । चरण 2.2.1 दोहराएं ।
- अपकेंद्रण के बाद, ध्यान से supernatant धोया ट्यूब नीचे में एकत्र कोशिकाओं से हटा दें । P200 सुझावों का उपयोग करके ऊपर और नीचे pipetting द्वारा तरलीकृत बर्फ के ठंडे तहखाने मैट्रिक्स के १२० μL में सेल गोली resuspend ।
नोट: तहखाने मैट्रिक्स में सेल गोली पुनर्निलंबन बर्फ स्नान पर किया जाना है । - प्लेट ४० μL तहखाने मैट्रिक्स में कक्ष की एक अच्छी तरह से एक पूर्व गरम 24-अच्छी तरह से थाली के केंद्र में पुनः निलंबन ।
नोट: , जबकि तहखाने मैट्रिक्स हेरफेर बुलबुला गठन को रोकने के लिए suctioning हवा से बचें । - वापस कोशिकाओं के साथ थाली ३७ डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इंक्यूबेटर के लिए तहखाने मैट्रिक्स में resuspended 15 मिनट के लिए या जब तक तहखाने मैट्रिक्स जम रहा है । बीजारोपण के ६०० μL को जोड़ने के माध्यम से प्रत्येक अच्छी तरह से (सामग्री तालिका) के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस तक गरम । ३७ डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर करने के लिए थाली लौटें ।
- बीजारोपण माध्यम को 3 दिनों और उसके बाद प्रत्येक 3 दिनों में ताजे अंगोइड संस्कृति माध्यम के ६०० μL के साथ प्रतिस्थापित करें । एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ अंगाभ वृद्धि की निगरानी । इंट्राएल्युमल मलबे और organoids पतन के संचय से पहले एक डाउनस्ट्रीम आवेदन या विभाजन के लिए हर 7 से 9 दिनों के लिए ऑर्गेनॉयड का उपयोग करें (चित्र 2a) मनाया जाता है ।
3. EHBD आर्गेनॉइड बीतने और भंडारण
-
EHBD ऑर्गेनॉयड के पारित होने के 1:3 से 1:4 हर 7 से 9 दिन
- मीडियम को कुएं से निकाल लें और उसमें ४०० μL आइस-कोल्ड पीबीएस डालें । धीरे से मिश्रण pipetting द्वारा ऑर्गेनॉइड फिर से निलंबित कर 10 बार में अच्छी तरह से । मिश्रण को एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें ।
- ऑर्गेनॉयड को अलग करने के लिए एक 25 ग्राम सुई के माध्यम से मिश्रण को 4 बार पारित करें । इस मिश्रण को 4 मिनट के लिए ४०० x g पर ४ ° c पर अपकेंद्रित्र कर लें ।
- ध्यान से supernatant को हटाने और आगे की संरचना (चरण 2.2.4) के लिए तहखाने मैट्रिक्स (1:3 से 1:4) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित या आगे की प्रक्रिया के लिए बर्फ ठंड PBS के साथ कोशिकाओं को धोने ।
नोट: आम तौर पर, 250-300 कोशिकाओं को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए 24-कूप प्लेट में चढ़ाया जाता है । चढ़ाना दक्षता उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा 3-5 दिन पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग ऑर्गेनॉइड की संख्या की गणना और प्रारंभिक सेल नंबर से उनके प्रतिशत की गणना से passaging के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है । mRNA को PBS में धोया गया EHBDOs से अलग किया जा सकता है जो guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का उपयोग करके मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करता है ।
-
EHBD ऑर्गेनॉयड के दीर्घकालिक भंडारण
- मीडियम को कुएं से निकालकर कमरे के तापमान वाले पीबीएस के साथ ऑर्गेनॉयड को धोएं । तहखाने मैट्रिक्स ड्रॉप परेशान बिना अच्छी तरह से PBS निकालें ।
- आइस-कोल्ड सेल फ्रीजिंग मीडियम के ५०० μL को अच्छी तरह से जोड़ें । धीरे से तरल तहखाने मैट्रिक्स और सेल बर्फ़ीली मध्यम और मिश्रण क्रायोजेनिक शीशियों में स्थानांतरण में ऑर्गेनॉइड को फिर से निलंबित ।
- शीशियों की दुकान पर-८० डिग्री सेल्सियस के लिए ४८ एच. एक वाष्प चरण में लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक नाइट्रोजन टैंक के लिए शीशियों हस्तांतरण ।
4. EHBD आर्गेनोइड पप्रोसेसिंग पैराफिन एम्बेडिंग के लिए
- EHBDOs ५०० μL में आइस-कोल्ड PBS (4 ° c) के ऊपर और नीचे 5 से 10 बार pipetting द्वारा resuspend । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में द्रवीकृत तहखाने मैट्रिक्स में फिर से निलंबित EHBDO इकट्ठा ।
नोट: को तोड़ने ऑर्गेनॉइड से बचने के लिए, एक P1000 टिप के नीचे 2-3 mm कट और supernatant बहुत ध्यान से हटा दें । - अपकेंद्रित्र EHBD ऑर्गेनॉयड 5 मिनट के लिए ३५० x g पर । ऑर्गेज् म पेलेट को परेशान किए बिना सुपरनेटंट को सावधानी से निकालें ।
- ऑर्गेनॉइड के लिए आइस-कोल्ड 4% पैराफार्मलेडिहाइड (पीएफए) की 1 मिलीलीटर डालें और 4% पीएफए में ऑर्गेनॉयड को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में सेते । रातोंरात ऊष्मायन के बाद एक P1000 टिप का उपयोग कर ऑर्गेनॉइड से 4% पीएफए निकालें ।
- ऑर्गेनॉयड के साथ ट्यूब के लिए कमरे के तापमान PBS के १००० μL जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट । 5 मिनट के लिए ३५० x g पर pbs में ऑर्गेनॉइड के साथ ट्यूब अपकेंद्रित्र । इस प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं ।
- PBS निकालें और ऑर्गेनॉयड के लिए 30% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें । RT पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट
- ३५० पर ट्यूब अपकेंद्रित्र RT. निकालें पर 5 मिनट के लिए x g 30% इथेनॉल । ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए इंक्यूबेट आरटी में ।
- 5 मिनट के लिए ३५० एक्स जी पर केंद्रागेट ७०% इथेनॉल निकालें । १००% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए इंक्यूबेट आरटी में ।
नोट: आगे की प्रोसेसिंग से पहले ऑर्गेनॉइड को १००% एथेनॉल कमरे के तापमान पर ४८ घंटे तक रखा जा सकता है । - गर्मी के लिए एक माइक्रोवेव में नमूना प्रसंस्करण जेल 20 एस या जब तक तरलीकृत । ऑर्गेनॉयड के साथ ट्यूब में नमूना प्रसंस्करण जेल के ५० μL जोड़ें । जब तक नमूना प्रसंस्करण जेल जम गया है बर्फ पर ट्यूब प्लेस ।
- ऊतक प्रोसेसर में आगे की प्रक्रिया के लिए एक कैसेट में नीले स्पंज पैड के बीच ट्यूब और जगह से ऑर्गेनॉइड के साथ नमूना प्रसंस्करण जेल की बूंद निकालें । आगे की प्रक्रिया के दौरान पैराफिन embedder में प्रत्येक कदम के लिए 15 मिनट का उपयोग करें.. ।
- 4 μm पर नमूना प्रोसेसिंग जेल में धारा पैराफिन एंबेडेड ऑर्गेनॉइड । पहले16वर्णित के रूप में immunohistochemical धुंधला के साथ आगे बढ़ें ।
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Representative Results
हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन माउस EHBD ऑर्गेनॉइड कि ऊतक विशिष्ट और वयस्क स्टेम सेल से व्युत्पंन हैं । ऑर्गेनॉयड के सुसंस्कृत होने के बाद, एक सिस्टिक संरचना गठन EHBD अलगाव के बाद 1 दिन के रूप में जल्दी के रूप में मनाया जा सकता है । फाइब्रोब्लास्ट के साथ संदूषण आमतौर पर संस्कृति पीढ़ी के दौरान नहीं देखा जाता है । EHBDO चढ़ाना दक्षता लगभग 2% जब या तो नवजात या वयस्क (2 महीने से अधिक पुराने) चूहों (चित्रा 2b) से अलग है । वयस्क चूहों से व्युत्पन्न ईव्बीडी ऑर्गेनॉयड की प्लेटिंग दक्षता, पैसेज 2 में 11% तक बढ़ जाती है और स्थिर रहती है (चित्र 2बी) । ऑर्गेनॉइड के बहुमत सभी मार्ग के माध्यम से पित्ताशय आकारिकी का प्रदर्शन, दुर्लभ के साथ "अनियमित" ऑर्गेनॉइड (चित्र 2c-ई) । ऑर्गेनॉइड 5-7 दिन के विकास शिखर पर पहुँचते हैं जिसके बाद वे इंट्राएल्युमल मलबे को जमने लगते हैं और खराब हो जाते हैं (चित्र 2a) । इसलिए, अंगाभ संस्कृति के रखरखाव के लिए, वे हर 7-10 दिन विभाजित किया जाना चाहिए (चित्रा 2a) । एक बार स्थापित है और जब उचित संभाला, organoids संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है लगभग अनिश्चित काल के (संस्कृतियों 14 महीने तक मनाया गया) । विभेदित कोशिकाओं के साथ संस्कृति संदूषण से बचने के लिए प्रारंभिक कोशिका अलगाव से अधिक किया, एक बहाव आवेदन के लिए उन्हें का उपयोग करने के लिए पहले से कम दो बार passaged का उपयोग करें ऑर्गेनॉइड. लंबे समय तक भंडारण के लिए, पहले बीतने का उपयोग करें (7 पारित करने के लिए) ऑर्गेनॉइड, क्योंकि वे भंडारण से वसूली के बाद उच्च चढ़ाना दक्षता है ।
जब इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ विश्लेषण किया, EHBDOs ई-कैडहेलिन द्वारा चिह्नित उपकला कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी से मिलकर बनता है (चित्र 3a-C). Organoid कोशिकाओं पित्त जनक कोशिकाओं के मार्कर का प्रदर्शन (अग्नाशय और ग्रहणी Homeobox 1 (PDX1); चित्र 3a) के रूप में अच्छी तरह के रूप में पित्त विभेदन के मार्कर (cytokeratin 19 (CK19) और लिंग निर्धारण क्षेत्र Y-बॉक्स 9 (SOX9); चित्र 3बी, सी) । महत्वपूर्ण बात यह है कि अंगाभ कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत एसिटाइलेटेड α-ट्यूब्युलिन (ए-एटी) द्वारा चिह्नित एक प्राथमिक पक्ष्मि के अधिकारी । चित्रा 3 डी), जो सामान्य cholangiocytes की एक विशेषता है, और उचित अंगाभ कोशिका ध्रुवीकरण का सुझाव. प्रजनक (Pdx1) और पित्त विभेदक कोशिकाओं के मार्कर की अभिव्यक्ति [Ck19, Sox9, aquaporin 1 (Aqp1), सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांजेम्ब्रेन चालकता नियामक(cftr)] भी पुष्टि की जा सकती है रीयल-टाइम मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) (तालिका 1) द्वारा । इन मार्करों का संयोजन ehbds14,17,18में cholangiocytes के लिए विशेषता है ।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है एक ऑर्गेनोइड कल्चर मॉडल की polarized पित्त उपकला कोशिकाओं की उत्पत्ति जनक और विभेदक मार्कर व्यक्त । यह प्रणाली संस्कृति में आकारिकी में परिवर्तन के बिना लंबे समय के लिए बनाए रखा जा सकता है, दीर्घकालिक संग्रहीत, और immunohistochemistry और क्यूआरटी-पीसीआर के साथ विश्लेषण किया ।
चित्रा 1 : EHBD ऑर्गेनोइड कल्चर जनरेशन और सर्जिकल सेट की योजनाबद्ध । (क) ईएबीडी आर्गेनॉइड जनन (ख) के लिए शल्य क्षेत्र की स्थापना की गई थी और एहतियातन आइसोलेशन के लिए एक ग्लास प्लेट (बिंदीदार रेखा) को हर समय बर्फ की ट्रे पर रखा गया था । (ग). बाँझ सर्जिकल उपकरण तेज कैंची, सीधे और घुमावदार दांतेदार चिमटी, hemostat, और स्केलपेल शामिल थे । (घ और ड) ehbd आसपास के संयोजी और अग्नाशई ऊतकों से पृथक होता है और इसके बाद सन्निकट यकृत पित्त नलिकाओं और यकृत (डी, ऐरो) से सावधानीपूर्वक विच्छेदन किया जाता है और ग्रहणी (डी, एरो) से अलग किया जाता है । मापनी चिह्न = 1 मि. इस आकृति का कोई बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : Ehbdo संस्कृति । (क) 12 दिन के पाठ्यक्रम में EHBDOs की सूक्ष्म छवियां । (ख). नवजात से व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड की चढ़ाना क्षमता (संस्कृति प्रति 2 चूहों, n = 3 संस्कृतियों) और वयस्क (> 2 महीने पुरानी, संस्कृति के अनुसार 1 माउस, n = 3 संस्कृतियों) चूहों ३०० संस्कृति के 5 दिवस पर । (ग और घ) एहबीडीओ सिस्टिक बनाम अनियमित आकारिकी का विश्लेषण माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था । (E). सिस्टिक और अनियमित आकार ऑर्गेनॉइड का प्रतिशत जल्दी (< 10) और देर (≥ 10) organoids मार्ग में विश्लेषण किया गया । स्केल पट्टियां = ५०० μm. मात्रात्मक डेटा माध्य के रूप में दिखाया +/-माध्य (SEM), t-परीक्षण के मानक त्रुटि । एन एस = महत्वपूर्ण नहीं है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : Ehbdos प्रजनक और परिपक्व पित्त कोशिकाओं के मार्कर एक्सप्रेस । (ए-सी) । EHBDOs मार्करों उपकला (ए, बी-cadherin, लाल), जनक (एके लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा विश्लेषण किया गया । PDX1, ग्रीन), और विभेदित (ख. CK19, ग्रीन; और सी। a-AT, लाल) पित्त कोशिकाओं । स्केल पट्टियां = 25 μm. *, lumen । (घ) ehbdos Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1, और cftr MRNA की बहुतायत के लिए क्यूआरटी द्वारा विश्लेषण किया गया-पीसीआर (मतलब +/ इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
| जीन | परिग्रहण संख्या | प्रवेशिका अनुक्रम | उत्पाद का आकार | ||
| एचपीआरटी | NM_013556 | आगे 5 '-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3 ' | १७३ bp | ||
| रिवर्स 5 '-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3 ' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | आगे ' 5 '-GAATTCCTTCCAGCTCCA-3 ' | १३३ bp | ||
| 5 रिवर्स '-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3 ' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | आगे 5 '-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3 ' | १०७ bp | ||
| 5 रिवर्स '-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3 ' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | आगे 5 '-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3 ' | १३३ bp | ||
| 5 रिवर्स '-ACCCTCCCGAGकुर्की AACC-3 ' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | आगे 5 '-CAGTACCAGCTGCAGTGC-3 ' | ११२ bp | ||
| 5 रिवर्स '-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3 ' | |||||
तालिका 1: Primers.
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Discussion
यह काम माउस EHBD cholangiocytes के एक organotypic 3 आयामी मॉडल की पीढ़ी का वर्णन । EHBDO संस्कृति उत्पादन में महत्वपूर्ण कदम सावधानी EHBDO विच्छेदन शामिल करने के लिए अग्ंयाशय सेल संदूषण से बचने के लिए, बाँझ शर्तों के रखरखाव बैक्टीरियल और फंगल संदूषण को रोकने के लिए, और केंद्राकरण के बाद सावधान हेरफेर से बचने के लिए सेलुलर सामग्री की हानि । एक करीबी का पालन करने के लिए वर्णित तापमान की स्थिति की आवश्यकता है । वहां तकनीक के लिए कुछ सीमाएं हैं । वयस्क चूहों के EHBDs छोटे हैं (व्यास में के बारे में 1 मिमी; चित्रा 1E), जो अलगाव के लिए चालाकी की आवश्यकता है । डिसेक्शन माइक्रोस्कोप का उपयोग विच्छेदन के साथ सहायता के लिए किया जा सकता है ।
तहखाने मैट्रिक्स इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त एक जैविक मैट्रिक्स है कि ज्ञात और अज्ञात विकास कारक19, एकाग्रता जिनमें से बहुत से बहुत से भिंन हो सकते है शामिल है । हम अनुशंसा करते हैं कि तकनीकी replicates के लिए, एक ही लॉट और/या तहखाने मैट्रिक्स के aliquot परिवर्तनशीलता से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा । हम भी नियमित रूप से जांच की सिफारिश एल wrn सेल संस्कृति के लिए मायकोप्लाज्मा संदूषण और वातानुकूलित माध्यम wnt गतिविधि11के लिए । इस अध्ययन के लिए प्रयोगशाला क्रमशः एक Mycoplasma का पता लगाने किट और WNT गतिविधि परख इस्तेमाल किया । विशेष रूप से, EHBDOs माध्यम में भ्रूण गोजातीय सीरम की कम मात्रा (०.५%; सामग्री की तालिका) ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन एक 3-आयामी उपकला कोशिका के साथ कोशिकाओं युक्त संस्कृति जनक और विभेदक सेल मार्करों के लिए विशेषता cholangiocytes और WNT3a की उपस्थिति में गठन, आर-spondin1, और Noggin विकास कारकों और परिभाषित पूरक (सामग्री की मेज) । यह अंग विशिष्ट है, क्योंकि यह वयस्क माउस EHBDs से प्राप्त है । यह संभावना स्टेम सेल 3 आयामी संरचनाओं और क्षमता में सेल स्वयं संगठन द्वारा सबूत गुणों के साथ वयस्क कोशिकाओं से व्युत्पंन है और बनाए रखा है और लंबी अवधि का विस्तार किया जाएगा । ऑर्गेनॉइड मुख्य रूप से कम "नवोदित" के साथ संरचना में सिस्टिक, जो एक अधिक स्टेम सेल की तरह organoids phenotype संकेत हो सकता है । यह संभव है कि अतिरिक्त स्टेम सेल आला कारकों ऑर्गेनॉइड के एक उच्च चढ़ाना दक्षता के लिए नेतृत्व, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भेदभाव के एक उच्च डिग्री सकता है ।
हमारी तकनीक एक 3 आयामी अंगाभ संस्कृति है कि एक समय में उत्पंन किया जा सकता है पैदा करता है और लागत कुशल तरीके से, जो पशु उपयोग कम, उच्च reproducible है, और कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों परमिट । इस नए उपकरण EHBD अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से उपकरण का अध्ययन करने के लिए वयस्क Ehbd बहुत सीमित हैं । यह उन प्रयोगशालाओं के लिए विशेष लाभ होगा जिनके पास मानव ऊतकों तक पहुंच नहीं है या वे आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडलों का लाभ उठाना चाहते हैं ।
मानव ऊतक के विपरीत, माउस ऊतक, अत्यधिक सुलभ है । वहां कई अभिकर्मक, immunohistochemistry विज्ञान एंटीबॉडी सहित माउस के ऊतकों का अध्ययन कर रहे हैं । इस तकनीक को शुरू में शुरू किया गया था के बाद से संस्कृति वयस्क ऊतक ऑर्गेनॉइड के लिए अभिकर्मकों की लागत काफी कम हो गया है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त एल-WRN सेल कंडीशनल मीडियम सहित नई सामग्रियां उपलब्ध हो गई हैं, जो ऑर्गेनोइड कल्चर कॉस्ट को और कम करती है । EHBDOs प्रोपेगेट, स्टोर, और विश्लेषण के लिए प्रक्रिया करने के लिए आसान कर रहे हैं । इस पांडुलिपि में इम्यूनोहिस्टोकेमिकल, माइक्रोस्कोपिक और क्यूआरटी-पीसीआर एनालिसिस को उदाहरण के तौर पर पेश किया गया है । इसके अतिरिक्त, हमारे समूह ने हाल ही में, आनुवंशिक रूप से निमत चूहों से EHBDOs के उत्पादन और उपयोग और 5-एथिल-2 ́-डीऑक्सीयूरेडीन (एडू)16का उपयोग करके ईएबीडीओ कोशिका प्रसार की मात्रा का वर्णन किया है ।
Ehbdos के संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में शामिल हैं, लेकिन ehbd cholangiocytes homeostasis के तंत्र का अध्ययन करने के लिए cholangiocytes की एक लगभग असीमित राशि की संवर्धन करने के लिए सीमित नहीं हैं । भविष्य में, इस प्रोटोकॉल रोग राज्यों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है; पुनर्योजी दवा (intrabilliimरोपण), आनुवंशिक और फार्माकोलॉजिक हेरफेर, दवा परीक्षण16के विश्लेषण सहित cholangiocyte ऑर्गेनॉइड का परीक्षण करने के लिए; और संक्रामक एजेंटों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए12,20. कोशिका-कोशिका अन्योन्य क्रिया का अध्ययन अन्य कोशिका प्रकारों के साथ EHBD आर्गेनॉइड के सहसंस्कृति का उपयोग करके किया जा सकता है ।
माउस से व्युत्पंन ऑर्गेनॉइड पायलट अध्ययन के लिए मानव EHBDOs की पीढ़ी से पहले इस्तेमाल किया जा सकता है, के बाद से मानव सामग्री मूल्यवान और सीमित है । भविष्य के अध्ययन कारकों की खोज पर ध्यान केंद्रित है कि उच्च चढ़ाना दक्षता को बढ़ावा देने और अंगाभ कोशिका भेदभाव मानव अंगाभ के अध्ययन के लिए वांछित हैं । चल रहे अध्ययन है कि अंगाभ संस्कृति के लिए एक और जैविक रूप से तटस्थ extracellular मैट्रिक्स के लिए खोज भी ehbdos संस्कृति शोधन के लिए प्रासंगिक हैं ।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम के लिए अमेरिकन एसोसिएशन द्वारा जिगर रोग शिखर पुरस्कार के अध्ययन के लिए समर्थन किया गया (एन. आर.) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के संस्थान (पुरस्कार P30 DK34933 एन. आर., P01 DK062041 से J.L.M.). हम इस पद्धति के विकास के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ रेमन Ocadiz-Ruiz (मिशिगन विश्वविद्यालय) धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
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