Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.
Abstract
Cholangiopathies, die extrahepatische Gallengänge (EHBDs) beeinflussen, gehören biliären Atresie, Primär sklerosierende Cholangitis und Gallengangskarzinom. Sie haben keine effektive therapeutische Optionen. Werkzeuge, um EHBD zu studieren, sind sehr begrenzt. Unser Ziel war es, eine Organ-spezifischen, vielseitig, Erwachsenen Stammzellen abgeleitet, präklinische Cholangiocyte Modell zu entwickeln, die leicht vom Wildtyp und gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden können. So berichten wir über die neuartige Technik der Entwicklung eines EHBD organoide (EHBDO) Kultur von Erwachsenen Maus EHBDs. Das Modell ist kostengünstig, leicht analysiert werden, und hat mehrere downstream-Anwendungen. Im einzelnen beschreiben wir die Methodik der Maus EHBD Isolation und einzelne Zelle Dissoziation, organoide Kultur Einleitung, Fortpflanzung, und langfristige Wartung und Lagerung. Dieses Manuskript beschreibt auch EHBDO Verarbeitung für Immunohistochemistry, Fluoreszenz-Mikroskopie und mRNA Fülle Quantifizierung durch Echtzeit-quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Dieses Protokoll hat deutliche Vorteile neben der Produktion von EHBD-spezifische Organellen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums aus L-WRN Zellen reduziert deutlich die Kosten für dieses Modell. Die Verwendung der Maus EHBDs bietet fast unbegrenzte Gewebe für Kultur-Generation, im Gegensatz zu menschlichem Gewebe. Generierte Maus EHBDOs enthalten eine reine Bevölkerung von Epithelzellen mit Markern der endodermische Stammvater und differenzierte biliären Zellen. Kultivierte Organellen homogene Morphologie durch mehrere Gänge zu erhalten und nach längerer für langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff gewonnen werden können. Das Modell ermöglicht die Untersuchung der Gallenwege Stammvater Zellproliferation, pharmakologisch manipuliert werden und kann aus gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden. Zukünftige Studien werden benötigt zur Optimierung der Kulturbedingungen um Effizienzsteigerung Beschichtung, funktionale Zelle Reife und direkten Zell-Differenzierung zu bewerten. Entwicklung von Kokulturen Modellen und einer mehr biologisch neutral extrazelluläre Matrix sind ebenfalls wünschenswert.
Introduction
Cholangiopathies sind unheilbare chronische progressive Störungen, die biliären Zellen in Intra- und extrahepatische Gallenwege Kanäle (EHBDs)1betreffen. Einige Cholangiopathies, wie primäre sklerosierende Cholangitis, Gallengangskarzinom und biliären Atresie Choledochal Zysten betreffen überwiegend EHBDs. Entwicklung von Therapien für Cholangiopathies ist durch die begrenzte Verfügbarkeit von präklinischen Modellen eingeschränkt. Darüber hinaus früheren Studien konzentrierten sich auf Cholangiopathies zusammengefasst: Leber, Intra- und EHBDs. Allerdings Intra- und EHBDs haben einen ausgeprägten embryonalen Ursprung, und gilt somit als unterschiedliche molekulare Pathologien. Intrahepatischen Gallenwege entwickeln sich aus den intrahepatischen duktalen Platten und der kranialen Teil der hepatischen Divertikel, ganze EHBDs zu entwickeln, aus dem kaudalen Teil des hepatischen Divertikel2. Sie verlassen sich auch auf verschiedene Vorläuferzellen Zelle Fächer für Erwachsene Homöostase, einschließlich Kanäle von Hering in intrahepatischen Gallenwege und Peribiliary Drüsen im EHBDs2,3. Verwendung von Tiermodellen für präklinische Studien wird durch Kosten begrenzt und aus ethischen Gründen minimiert werden. Reduktionistische, reproduzierbare, Zeit und Kosten sparende in-vitro-Modelle sind daher sehr wünschenswert.
Die meisten frühere Studien von Cholangiopathies verwendete normale Maus oder Ratte Krebs Modelle oder menschlichen Gallengangskarzinom Zelllinien aus intra- und EHBDs4,5,6,7. Aber diese sind Modelle der transformierten Zellen und nicht normal Cholangiocyte Biologie Homöostase oder in einem gesunden Zustand rekapitulieren. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von organotypischen Kultur Modellen ermöglichte die Entwicklung von 3-dimensionalen Strukturen aus verschiedenen Gewebetypen, einschließlich Artischockenblättern Gewebe, obwohl nicht normale Maus EHBDs8,9, 10. Diese "Orgel-ähnlichen" Strukturen abzielen, primäre Gewebe imitiert und in eine künstliche Nische Unterstützung Selbsterneuerung der Organ-spezifischen Stamm/Stammvater Zellen11angebaut.
"Organoide" ist ein breiter Begriff, der meisten allgemein beschreibt 3-dimensionale Gewebemodelle Stammzellen abgeleitet. Organellen können aus umprogrammiert pluripotenten generiert werden Stammzellen vertreten durch embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen. Sie können auch aus adulten Stammzellen organspezifischen12generiert werden. Einige Cholangiocyte organoide Modelle wurden in früheren Studien vorgeschlagen. So, Organellen, die von menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet wurden berichteten7,9,13 und sind wertvoll, Zeit effiziente Tools, die für die gleichzeitige Erzeugung von verschiedenen Zelltypen ermöglicht. Diese pluripotenten Stammzelle-derived Organellen spiegeln jedoch nicht vollständig die Struktur und Funktionalität der primären adult EHBD Cholangiocytes.
Organellen von adulten Stammzellen des menschlichen9 abgeleitet und feline10 Leber wurden auch vorgeschlagen. Feline Modelle sind nicht weit verbreitet und haben begrenzte Tool Rüstzeug zu Studienzwecken. Darüber hinaus können diese Leber abgeleitet adulten Stem Cell-derived Organellen nicht extrahepatische Cholangiocytes aber eher intrahepatischen Cholangiocytes modellieren.
EHBD organoide Generation wurde von menschlichen normal EHBDs14 und Maus EHBD Gallengangskarzinom15berichtet. Allerdings Zugang zu menschlichen EHBD Gewebe ist äußerst begrenzt, und Organellen, abgeleitet von einer genetischen Mausmodell Gallengangskarzinom15 repräsentieren nicht gesund Cholangiocyte Biologie an der Homöostase und genetisch veränderten Zellen abgeleitet sind.
Um die Grenzen der pluripotenten Stammzelle - und Leber-derived Cholangiocyte organoide Modelle und des eingeschränkten Zugangs zu menschlichem Gewebe benötigt in präklinischen Modellen zu begegnen, haben wir ein EHBD organoide Mausmodell (Abbildung 1A) entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung einer Technik für Maus EHBD-abgeleitete Organellen von Erwachsenen Gewebe. Diese EHBD Organellen benannt EHBDOs werden in-vitro-Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die EHBDs Cholangiocyte Homöostase und Krankheit Prozesse, z. B. Cholangiopathies.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt.
1. Vorbereitung der Ausrüstung und Materialien für die Maus EHBD Isolierung
- Bereiten Sie seeding Medium und waschen Puffer (Table of Materials) in 50 mL konische Röhrchen vor und halten sie bei 4 ° C oder auf Eis bis zur Verwendung.
- Richten Sie eine OP-Tisch (Abb. 1 b). Bereiten Sie sterilisierte chirurgische Instrumenten (Abbildung 1).
- Legen Sie eine sterile 24-Well-Platte im 37 ° C Gewebekultur Inkubator, es Vorwärmen.
- Legen Sie eine aliquote Keller Matrix auf Eis. Verwenden Sie Keller Matrix nur, wenn es vollständig verflüssigt ist.
2. EHBD Isolation und biliären organoide Kultur
-
Isolation und Vorbereitung einer einzelnen Zelle Aussetzung der Maus EHBD
- Einschläfern Sie Erwachsenen Mäuse (älter als 2 Monate) nach den institutionellen Richtlinien. Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage. Öffnen der Bauchhöhle mit einer Mittellinie Ansatz aus- und Einfahren der Leber auf das Zwerchfell.
- Der Gallengang befindet sich unmittelbar unterhalb der Leber Hilum durch leichtes Ziehen der proximale Duodenum mit einer Gefäßklemme zu identifizieren. Das umliegende Gewebe mit einer Skalpellklinge trennen Sie EHBD. Halten Sie das proximale Ende der Choledochus mit Zangen, distal oberhalb der Stelle mit den Zwölffingerdarm zu sezieren Sie, dann sezieren Sie das proximale Ende des Kanals aus der Leber (Abbildung 1). Legen Sie sofort isolierte EHBD (Abbildung 1E) in kalten Waschpuffer.
- Entfernen Sie die EHBD aus dem Puffer waschen und in 0,5 mm-Abschnitte mit einem sterilen Skalpellklinge Blatt vor den Mund. Legen Sie das Gewebe auf einer Glasplatte auf dem Eis während des Verfahrens (Abbildung 1 b).
- Legen Sie die EHBD Abschnitte in ein Röhrchen mit 500 µL des Puffers Dissoziation. 20 min bei 37 ° c inkubieren Neutralisieren Sie die Dissoziation Puffer durch Zugabe von 500 µL eiskalte Zellkulturmedium.
- Genannte die Zellsuspension nach oben und unten durch 18 G und 20 G Nadeln, jeweils 20 Mal voran. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 µm Zelle Sieb und sammeln Sie der Durchfluss in einem 50 mL-Tube.
Hinweis: Pre-Zustand das Sieb mit 500 µL steriler Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor der Filterung, um den Durchgang von der Zellsuspension zu erleichtern.
-
Aufbau EHBD Organellen
- Zentrifuge die Durchströmung von Schritt 2.1.5 bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie vorsichtig den überstand. Die Zellen in 1 mL eiskaltes sterile PBS aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Wiederfreisetzung in eine neue 1,5 mL Tube. Wiederholen Sie Schritt 2.2.1.
- Entfernen Sie nach Zentrifugation vorsichtig den Überstand aus gewaschenen Zellen am unteren Rohr gesammelt. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 120 µL des verflüssigten eiskalten Keller Matrix durch nach oben und unten mit P200 Tipps pipettieren.
Hinweis: Zelle Pellet Wiederfreisetzung im Keller Matrix hat auf Eis-Bad durchgeführt werden. - Platte 40 µL der Zelle Wiederfreisetzung im Keller-Matrix in die Mitte eines Brunnens in eine vorgewärmte 24-Well-Platte.
Hinweis: Vermeiden Sie Absaugen von Luft beim Bearbeiten von Keller-Matrix, um Blasenbildung zu vermeiden. - Die Platte mit Zellen im Keller Matrix in den 37 ° C Gewebekultur Inkubator für 15 Minuten oder bis Keller Matrix verfestigt Nukleinsäuretablette zurück. Fügen Sie 600 µL des Mediums Aussaat in jede Vertiefung (Table of Materials) bis zu 37 ° C erwärmt. Die Platte in der Gewebekultur Inkubator 37 ° C zurück.
- Ersetzen Sie die Aussaat Medium mit 600 µL des Kulturmediums frische organoide in 3 Tagen und danach alle 3 Tage. Organoide Wachstum mit einem inversen Mikroskop zu überwachen. Verwendung Organellen für eine nachgeschaltete Anwendung oder Split alle 7 bis 9 Tage vor der Anhäufung von Schutt und organoide Zusammenbruch Intraluminal eingehalten werden (Abbildung 2A).
3. EHBD organoide Passage und Lagerung
-
Durchgang von EHBD Organellen 1:3 bis 1:4 alle 7 bis 9 Tage
- Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und fügen Sie 400 µL eiskaltem PBS hinzu. Aufschwemmen der Organellen durch sanft Pipettieren das Gemisch nach oben und unten 10 Mal in den Brunnen. Übertragen Sie die Mischung auf eine 1,5 mL-Tube.
- Passage der Mischung durch eine 25 G Nadel 4 Mal um die Organellen zu distanzieren. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 400 X g für 4 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Aufschwemmen der Zellen im Keller Matrix (1:3 bis 1:4) für die weitere Kultivierung (Schritt 2.2.4.) oder Waschen der Zellen mit Eis kaltem PBS zur Weiterverarbeitung.
Hinweis: 250-300 Zellen sind in der Regel in der 24-Well-Platte für downstream-Anwendungen beschichtet. Plattieren Effizienz kann durch Hellfeld Mikroskopieren mit einem inversen Mikroskop am Tag 3-5 Nach Passagierung durch das zählen der Organellen und berechnen ihre Prozent aus anfänglichen Zellzahl ausgewertet werden. mRNA kann von EHBDOs waschen mit PBS-Puffer über das standard-Protokoll über Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert werden.
-
Langzeitlagerung von EHBD Organellen
- Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und waschen Sie die Organellen mit Raumtemperatur PBS. PBS aus dem Brunnen zu entfernen, ohne zu stören den Keller Matrix Tropfen.
- Fügen Sie 500 µL eiskalte Zelle Einfrieren Medium zum Brunnen. Sanft Aufschwemmen der Organellen in verflüssigtem Keller Matrix und Zelle Einfrieren Medium und übertragen Sie die Mischung in kryogenen Fläschchen.
- Speichern Sie den Fläschchen bei-80 ° C für 48 h Transfer die Fläschchen mit einem Stickstofftank für die langfristige Lagerung in einer Dampfphase.
4. EHBD organoide Pprocessing für die Einbettung von Paraffin
- Die EHBDOs in 500 µL eiskaltem PBS (4 ° C) durch pipettieren und ab 5 bis 10 Mal aufzuwirbeln. Sammeln Sie resuspendierte EHBDO in verflüssigtem Keller Matrix in eine 1,5 mL-Tube.
Hinweis: Um zu vermeiden, brechen Organellen, unten ca. 2-3 mm ein P1000-Tip abgeschnitten und den Überstand vorsichtig zu entfernen. - Zentrifuge EHBD Organellen bei 350 X g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne störende organoide Pellet.
- Die Organellen 1 mL eiskaltes 4 % Paraformaldehyd (PFA) hinzu und inkubieren die Organellen in 4 % PFA über Nacht bei 4° c Entfernen Sie die 4 % PFA von Organellen, die mit einer P1000-Spitze nach der Inkubation über Nacht.
- Das Rohr mit der Organellen 1000 µL der Raumtemperatur PBS hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Zentrifugieren Sie dem Rohr mit Organellen mit PBS-Puffer bei 350 X g für 5 min. Wiederholen dieses Prozesses zwei weitere Male.
- Entfernen Sie PBS zu und fügen Sie 1 mL 30 % Ethanol zu den Organellen. 5 min bei RT inkubieren
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 350 X g für 5 min bei RT. Entfernen Sie 30 % Ethanol. 1 mL 70 % igem Ethanol zugeben und 5 min bei RT inkubieren
- Entmischen bei 350 X g für 5 min. entfernen 70 % Ethanol. Fügen Sie 1 mL 100 % Ethanol und 5 min bei RT inkubieren
Hinweis: Organellen können in 100 % igem Ethanol bei Raumtemperatur für bis zu 48 h vor der Weiterverarbeitung aufzubewahren. - Erhitzen Sie Probe Verarbeitung Gel in einer Mikrowelle für 20 s oder bis verflüssigt. Fügen Sie 50 µL der Probe Verarbeitung Gel in das Rohr mit Organellen. Legen Sie das Rohr auf Eis, bis die Probe Verarbeitung Gel verfestigt wird.
- Entfernen Sie die Tropfen der Probe Verarbeitung Gel mit Organellen aus der Tube und zwischen die blauen Schaumstoffpatrone in einer Kassette zur Weiterverarbeitung in der Gewebe-Prozessor. Verwenden Sie 15 Minuten für jeden Schritt im Paraffin-Embedder, bei der Weiterverarbeitung...
- Abschnitt Paraffin-eingebetteten Organellen in Probe Verarbeitung gel bei 4 µm. fortfahren mit immunhistochemischen Färbung als zuvor beschriebenen16.
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Representative Results
Unser Protokoll beschreibt die Generation der Maus EHBD Organellen, die gewebespezifische und Erwachsenen Stammzellen abgeleitet sind. Nachdem die Organellen kultiviert werden, kann eine zystische Struktur Formation bereits 1 Tag nach der EHBD Isolation beobachtet werden. Kontamination mit Fibroblasten wird in der Regel nicht während Kultur Generation beobachtet. EHBDO Beschichtung Effizienz beträgt ca. 2 % Wenn Sie isoliert von Neugeborenen oder Erwachsenen (älter als 2 Monate) Mäuse (Abb. 2 b). Plattieren Effizienz der EHBD Organellen abgeleitet von Erwachsenen Mäusen erhöht auf 11 % in Durchgang 2 und bleibt stabil (Abbildung 2 b). Die Mehrheit der Organellen demonstrieren zystische Morphologie durch alle Gänge, mit seltenen "irregulären" Organellen (Abbildung 2-E). Organellen erreichen einen Wachstum Höhepunkt bei 5-7 Tage nach denen sie starten akkumulieren Intraluminal Schutt und verschlechtern (Abbildung 2A). Daher sollten sie für die Wartung der organoide Kultur, alle 7-10 Tage (Abbildung 2A) aufgeteilt. Sobald festgelegt und entsprechend behandelt, können Organellen in Kultur fast unbegrenzt beibehalten werden (Kulturen wurden bis zu 14 Monate beobachtet). Kultur zu vermeiden Kontamination mit differenzierten Zellen übernommen von der ersten Zelle Isolation, Verwendung Organellen passagiert mindestens zweimal vor der Verwendung für eine nachgeschaltete Anwendung. Verwenden Sie für die langfristige Speicherung frühere Durchgang (bis zu Abschnitt 7) Organellen, da sie höheren Effizienz der Beschichtung nach der Wiederherstellung aus dem Speicher haben.
Wenn mit Immunfluoreszenz analysiert, bestehen EHBDOs aus einer reinen Bevölkerung von Epithelzellen geprägt von E-Cadherin (Abb. 3A-C). Organoide Zellen zeigen Marker der biliären Vorläuferzellen (pankreatischen und Zwölffingerdarm Homeobox 1 (PDX1); Abbildung 3A) sowie Marker der biliären Differenzierung (Cytokeratin 19 (CK19) und Geschlecht-Bestimmung der Region Y-Box 9 (SOX9); Abbildung 3 b, C). Wichtig ist, ein hoher Anteil an organoide Zellen besitzen eine primäre Zilie geprägt von Schimmelpilzschäden α-Tubulin (AT; Abbildung 3D), das ist eine Funktion des normalen Cholangiocytes und schlägt geeignete organoide Zelle Polarisation. Der Ausdruck der Marker von Vorläuferzellen (Pdx1) und biliären differenzierte Zellen [Ck19, Sox9, Aquaporin-1 (Aqp1), Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler(Cftr)] kann auch bestätigt werden durch Echtzeit-quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) (Tabelle 1). Kombination dieser Marker ist charakteristisch für Cholangiocytes in EHBDs14,17,18.
Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll beschreibt die Generation eine organoide Kulturmodells der polarisierten biliären Epithelzellen Vorläuferzellen ausdrücken und differenzierte Marker. Dieses System ist in der Kultur über einen längeren Zeitraum ohne Änderungen in der Morphologie, gespeichert langfristig und mit Immunohistochemistry und qRT-PCR analysiert pflegbar.
Abbildung 1 : Der EHBD organoide Kultur Generation und chirurgische Set up schematische (A). schematische EHBD organoide Generation. (B). OP-Bereich war für EHBD Isolierung und enthalten eine Glasplatte (gepunktete Linie) auf eine Eiswürfelschale zu allen Zeiten gehalten. (C). Sterile chirurgische Geräte enthalten scharfe Schere, gerade und gebogene Gefäßklemme, gezahnte Pinzette und Skalpell. (D und E) EHBD ist isoliert aus den umliegenden Binde- und pankreatischen Gewebe gefolgt von sorgfältige Dissektion proximal von der intrahepatischen Gallenwege und der Leber (D, Pfeil) und distal von Zwölffingerdarm (D, Pfeil). Linealmarkierungen = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : EHBDO Kultur. (A). mikroskopische Aufnahmen von EHBDOs über ein 12-Tages-Kurs. (B). Plating Effizienz der Organellen der Neugeborenen abgeleitet (2 Mäuse pro Kultur, n = 3 Kulturen) und Erwachsene (> 2 Monate alt, 1 Maus pro Kultur, n = 3 Kulturen) Mäuse nach Beschichtung 300 Zellen pro Bohrloch in 24-Well-Platte und Auflisten von Organellen gegründet am 5. Tag der Kultur. (C und D) EHBDO zystische gegen irreguläre Morphologie wurde durch Mikroskopie analysiert. (E). die Prozent der zystischen und unregelmäßig geformte Organellen wurde analysiert, in früh (< 10) und Ende (≥10) organoide Passagen. Skalieren von Balken = 500 µm. Quantitative Daten zeigten als Mittelwert +/-Standardfehler des Mittelwertes (SEM), t-test. NS = nicht signifikante. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : EHBDOs express Marker der Stammvater und Reifen biliären Zellen. (A-C). EHBDOs analysiert wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung für Marker epithelialen (A, B. E-Cadherin, rot), Stammvater (A.) PDX1, grün), und differenziert (B. CK19, grün; und C. a-AT, rot) biliären Zellen. Skalieren von Balken = 25 µm. *, Lumen. (D). EHBDOs analysiert wurden, für die Fülle von Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1und Cftr -mRNA durch qRT-PCR (Mittelwert +/-SEM relativ zum Ausdruck des Hprt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Gen | Zbl-Nummer | Primer Sequenz | Produktgröße | ||
| HPRT | NM_013556 | Weiterleiten von 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3 " | 173 bp | ||
| Umkehren der 5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3 " | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | Weiterleiten von 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3 " | 133 bp | ||
| Umkehren der 5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3 " | |||||
| Sox9 | NM_011448 | Weiterleiten von 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3 " | 107 bp | ||
| Umkehren der 5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3 " | |||||
| Ck19 | NM_008471 | Weiterleiten von 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3 " | 133 bp | ||
| Umkehren der 5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3 " | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | Weiterleiten von 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3 " | 112 bp | ||
| Umkehren der 5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3 " | |||||
Tabelle 1: Primer.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt die Generation eine organotypischen 3-dimensionales Modell der Maus EHBD Cholangiocytes. Wichtige Schritte zur EHBDO Kultur Generation gehören sorgfältige EHBD Dissektion zur Vermeidung von Bauchspeicheldrüse Zelle Kontamination, Wartung von sterilen Bedingungen gegen Bakterien- und Pilzinfektionen Kontamination und sorgfältige Manipulation nach der Zentrifugierung zu vermeiden die Verlust von Zellmaterial. Eine enge Einhaltung der beschriebenen Temperaturbedingungen ist erforderlich. Es gibt einige Beschränkungen in Bezug auf die Technik. EHBDs erwachsener Mäuse sind klein (ca. 1 mm im Durchmesser; Abbildung 1E), erfordern die Finesse für Isolierung. Eine Dissektion Mikroskop lässt sich mit Dissektion zu unterstützen.
Keller-Matrix, die in diesem Protokoll verwendeten ist eine biologische Matrix, die bekannten und unbekannten Wachstumsfaktoren19, enthält die Konzentration von Charge zu Charge variieren kann. Es wird empfohlen, für technische repliziert, die gleiche Menge und/oder Aliquote Keller Matrix verwendet werden, um Schwankungen zu vermeiden. Wir empfehlen auch routinemäßig L-WRN Zellkultur für Mykoplasmen Kontamination und konditionierten Medium für WNT Aktivität11. Das Labor für diese Studie verwendet bzw. eine Mycoplasma Detection Kit und WNT Aktivität Assay. EHBDOs Medium enthält vor allem geringe Menge an fetalen Rinderserum (0,5 %; Tabelle der Materialien).
Die vorgestellte Protokoll beschreibt eine 3-dimensionale Epithelzelle Kultur enthält Zellen mit Stammvater und differenzierte Zelle Marker charakteristisch für Cholangiocytes und geformt in Anwesenheit von WNT3a, R-spondin1 und Birne Wachstumsfaktoren und definiert Ergänzungen (Table of Materials). Es ist organspezifischen, wie sie von Erwachsenen Maus EHBDs abgeleitet ist. Es ist wahrscheinlich abgeleitet von adulten Zellen mit Stammzellen Eigenschaften belegt durch Selbstorganisation der Zelle in die 3-dimensionale Strukturen und Fähigkeit zu erhalten und langfristig ausgebaut werden. Die Organellen sind vor allem zystische Struktur mit minimalen "angehende" dem einen Stammzell-ähnlicher organoide Phänotyp hindeuten könnten. Es ist möglich, dass zusätzliche Stammzelle Nische Faktoren zu einer höheren Effizienz der Beschichtung der Organellen, sowie ein höheres Maß an Differenzierung führen könnte.
Unsere Technik erzeugt eine 3-dimensionale organoide-Kultur, die auf eine Zeit- und kosteneffiziente Weise die Tiernutzung minimiert, ist sehr reproduzierbar und erlaubt mehrere downstream-Anwendungen erzeugt werden kann. Dieses neue Werkzeug ist wichtig für EHBD Studien, da Tools für Erwachsene EHBDs studieren sehr begrenzt sind. Es wäre der Sonderleistungen, die Laboratorien, die nicht Zugang zu menschlichen Geweben oder gentechnisch veränderte Mausmodelle nutzen möchten.
Maus-Gewebe, im Gegensatz zu menschlichem Gewebe ist sehr gut zugänglich. Es gibt mehrere Reagenzien, einschließlich Immunohistochemistry Antikörper um Maus Gewebe zu studieren. Die Kosten für Reagenzien, Kultur Erwachsenen Gewebe Organellen hat sich deutlich verringert, da diese Technik ursprünglich eingeführt wurde. Darüber hinaus haben neue Materialien zur Verfügung, darunter das L-WRN Zelle bedingt Medium in diesem Protokoll, wodurch weitere organoide Kultur Kosten reduziert werden. EHBDOs sind leicht zu verbreiten, zu speichern und Verfahren zur Analyse. Die immunhistochemische, mikroskopische, und qRT-PCR-Analysen sind als Beispiele in diesem Manuskript vorgestellt. Darüber hinaus beschrieb unserer Gruppe vor kurzem Erzeugung und Verwendung von EHBDOs aus gentechnisch veränderter Mäuse und Quantifizierung der EHBDO Zellproliferation mit 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxyuridine (EdU)16.
Mögliche downstream-Anwendungen von EHBDOs sind unter anderem beschränkt sich auf die Kultivierung von eine fast unbegrenzte Menge an Cholangiocytes, Mechanismen der EHBD Cholangiocyte Homöostase zu studieren. In Zukunft kann dieses Protokoll für die Untersuchung von Krankheitszuständen angewendet werden; Cholangiocyte Organellen, einschließlich Analyse der regenerativen Medizin (intrabiliary Implantation), genetische und pharmakologische Manipulation, Drogentests16testen; und die Untersuchung der Auswirkungen von Infektionserregern12,20. Zell-Zell-Interaktion kann andere Zelle Arten21Kokultur EHBD Organellen mit untersucht werden.
Maus-abgeleitete Organellen können für Pilotstudien vor die Erzeugung von menschlichen EHBDOs verwendet werden, da menschliches Material wertvoll und begrenzt ist. Zukünftige Studien konzentrierten sich auf Entdeckung der Faktoren, die höheren Effizienz der Beschichtung zu fördern und organoide Zelldifferenzierung sind für die Studie der menschlichen Organellen erwünscht. Laufende Studien, die Suche nach mehr biologisch neutral extrazelluläre Matrix für organoide Kultur sind auch relevant für EHBDOs Kultur Raffinesse.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der American Association für die Studie der Leber Krankheiten Pinnacle Award (n.r.) und die National Institutes of Health, National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen (awards P30 DK34933, n.r., P01 DK062041, J.L.M.) unterstützt. Wir danken Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) für seine Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
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- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
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