Summary
Bu iletişim kuralı bir fare extrahepatic safra kanalını 3 boyutlu organoid sistemi üretimi açıklar. Bu safra organoids cholangiocyte Biyoloji çalışma kültüründe korunabilir. Safra organoids işaretleri hem yaratıcı hem de safra hücreleri hızlı ve polarize epitel hücrelerinin oluşmaktadır.
Abstract
Cholangiopathies, extrahepatic safra kanalları (EHBDs) etkileyen, safra atrezi, Birincil sklerozan kolanjit ve cholangiocarcinoma içerir. Onlar etkili tedavi seçeneği var. EHBD eğitim araçları çok sınırlıdır. Bizim amacımız kolayca vahşi türü ve genetik fareler üretilen bir organ özgü, çok yönlü, Yetişkin kök hücre kaynaklı, preklinik cholangiocyte modeli geliştirmekti. Böylece, biz yetişkin fare EHBDs bir EHBD organoid (EHBDO) kültür sisteminden geliştirme roman tekniği rapor. Modelin maliyet-etkin, kolayca çözümlenmesi mümkün olduğunu ve birden çok akış yönündeki uygulama alanı vardır. Özellikle, fare EHBD yalıtım ve tek hücre ayrılma, organoid kültür başlatılması, yayma ve uzun vadeli bakım ve depolama yöntemi açıklanmaktadır. Bu makale ayrıca immünhistokimya, floresan mikroskopi ve mRNA bereket Nefelometri için gerçek zamanlı nicel ters transkripsiyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından işleme EHBDO açıklar. Bu iletişim kuralının EHBD özgü organoids üreten ek olarak önemli avantajlar vardır. L-UYR hücrelerden şartına bir orta kullanımı önemli ölçüde bu model maliyetini azaltır. Fare EHBDs kullanımı insan dokusu aksine kültür üretimi için neredeyse sınırsız doku sağlar. Oluşturulan fare EHBDOs endodermal progenitör işaretleri saf nüfusuyla epitel hücresi içeren ve safra hücreleri ayrıştırılan. Kültürlü organoids birden çok pasajlar ile homojen Morfoloji korumak ve bir uzun vadeli depolama süresi sıvı azot sonra elde edilebilir. Model safra progenitör hücre çoğalması için çalışma sağlar, farmakolojik manipüle edilebilir ve genetik fareler oluşturulabilir. Gelecekteki çalışmalar Kültür koşulları kaplama verimliliği artırmak, işlevsel hücre olgunluk ve doğrudan hücre farklılaşması değerlendirmek için en iyi duruma getirmek için ihtiyaç vardır. Ortak kültür modeller ve daha biyolojik olarak tarafsız bir hücre dışı matriks geliştirilmesi de arzu vardır.
Introduction
Cholangiopathies içi - ve extrahepatic safra kanalları (EHBDs)1bulunan safra hücrelerini etkiler tedavi edilemez kronik ilerici bozuklukları vardır. Birincil sklerozan kolanjit, cholangiocarcinoma, safra atrezi ve choledochal kistleri, gibi bazı cholangiopathies ağırlıklı olarak EHBDs etkiler. Cholangiopathies için tedavilerin geliştirilmesi Preklinik modellerin sınırlı kullanılabilirliğe tarafından sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, önceki çalışmalarda birlikte gruplandırılmış cholangiopathies üzerinde duruldu: karaciğer, içi- ve EHBDs. Ancak, içi - ve EHBDs ayrı bir embriyonik kökenli ve, böylece, farklı moleküler patolojiler düşünülmelidir. İntrahepatic duktal plakaları ve hepatik divertikülü kafatası parçası intrahepatic safra kanalları geliştirmek, hepatik divertikülü2Kaudal kısmından tüm EHBDs geliştirmek. Onlar farklı progenitör hücre bölmeleri yetişkin Homeostazı, intrahepatic safra kanalları ve peribiliary bezleri EHBDs2,3Hering Kanallar dahil olmak üzere için güvenirler. Hayvan modelleri kullanımını preklinik Etütler gider tarafından sınırlı ve etik nedenlerle indirilmelidir. Bu nedenle, indirgemeci, tekrarlanabilir, zaman ve maliyet-etkin tüp bebek modelleri son derece arzu edilir.
Cholangiopathies en önceki çalışmaları normal fare ya da sıçan kanser modelleri, ya da insan cholangiocarcinoma hücre satır içi - ve EHBDs4,5,6,7elde kullanılmaktadır. Ancak, bu dönüştürülmüş hücrelerin modelleri ve normal cholangiocyte Biyoloji homeostazı veya sağlıklı bir devlet özetlemek değil. Organotypic kültür modelleri gelişiminde son ilerleme 3 boyutlu yapıları gelişimi normal fare rağmen EHBDs8,9hepatobiliary dokular, dahil olmak üzere farklı doku türlerinden izin verdi, 10. Bu "organ gibi" yapılar birincil doku taklit eden amaçlı ve öz-organ özgü kök/progenitor hücreler11yenilenmesi destekleyen yapay bir niş içinde yetişir.
"Organoid" olan bir geniş terim bu en yaygın kök hücrelerden elde edilen 3 boyutlu doku modelleri açıklar. Organoids programlanmış pluripotent kök hücreler embriyonik kök hücreleri tarafından temsil ve pluripotent kök hücreler indüklenen oluşturulabilir. Bunlar da organ özgü erişkin kök hücreler12den oluşturulabilir. Bazı cholangiocyte organoid modelleri önceki araştırma çalışmalarında önerilmiştir. Böylece, insan pluripotent kök hücrelerden türetilmiş organoids bildirilen7,9,13 olmuştur ve farklı hücre tipleri aynı anda oluşturmak için olanak sağlayan değerli, zaman verimli araç sağlar. Ancak, birincil yetişkin EHBD cholangiocytes işlevselliğini ve yapısını bu pluripotent kök hücre kaynaklı organoids tam olarak yansıtmıyor.
Organoids insan9 yetişkin kök hücrelerden türetilmiş ve kedi10 karaciğer de önerdi. Kedi modelleri yaygın olarak mevcut değildir ve aracı armamentarium çalışma amacıyla sınırlı sahip. Ayrıca, bu karaciğer kaynaklı yetişkin kök hücre kaynaklı organoids extrahepatic cholangiocytes ama çok intrahepatic cholangiocytes model değil.
EHBD organoid üretimi insan normal EHBDs14 ve fare EHBD cholangiocarcinoma15bildirildi. Ancak, insan EHBD doku erişim son derece sınırlıdır ve cholangiocarcinoma15 bir genetik fare modelinden türetilmiş organoids sağlıklı cholangiocyte Biyoloji Homeostazı, temsil etmez ve genetiği değiştirilmiş hücrelerden türetilir.
Pluripotent kök hücre ve karaciğer türetilmiş cholangiocyte organoid modelleri ve insan dokulara preklinik modellerinde gerekli sınırlı erişim sınırlamaları gidermek amacıyla geliştirdiğimiz bir fare EHBD organoid model (şekil 1A). Bu el yazması bir tekniği için fare EHBD elde edilen organoids yetişkin dokusundan gelişimi anlatılmaktadır. EHBDOs adlı bu EHBD organoids EHBDs cholangiocyte homeostazı ve hastalık gibi süreçlerini cholangiopathies altında yatan mekanizmaları incelenmesi için önemli bir tüp bebek araç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), The University of Michigan tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması fare EHBD yalıtım için malzeme ve tesisatlar
- Tohumlama orta ve çamaşır arabellek (Tablo reçetesi) 50 mL konik tüpler hazırlamak ve kadar kullanmak 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.
- Bir cerrahi masa (şekil 1B) kurun. Steril cerrahi aletler (şekil 1 c) hazırlayın.
- Steril bir 24-şey plaka önceden ısıtmak için 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesine koyun.
- Bir aliquot Bodrum matris Buza koyun. Sadece tamamen sıvılaşmış Bodrum matris kullanın.
2. EHBD yalıtım ve safra Organoid kültür
-
Yalıtım ve fare EHBD bir tek hücre süspansiyon hazırlanması
- Bir yetişkin fare (2 aydan daha eski) kurumsal esaslarına göre ötenazi. Fare sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Karın boşluğu bir orta hat yaklaşım kullanarak açın ve diyafram üzerinde dinlenmek için karaciğer geri çek.
- Hemen bir hemostat ile proksimal duodenum hafifçe çekerek karaciğer hilus bulunan ortak safra kanalını tanımlar. EHBD bir neşter bıçak kullanarak çevre dokulardan ayırın. Ortak safra kanalını proksimal sonu Forseps ile tutarak, hemen üstünde onun birleşme ile duodenum klemple incelemek, sonra karaciğer (şekil 1 d) üzerinden kanal proksimal sonu incelemek. Hemen izole EHBD (şekil 1E) arabellek yıkama soğuk yerleştirin.
- EHBD çamaşır arabelleğinden kaldırmak ve steril neşter bıçak kullanarak 0,5 mm bölümlere kıyma. Doku (şekil 1B) işlem sırasında buz cam tabağa yerleştirin.
- EHBD bölümleri 500 µL ayrılma arabelleği içeren bir tüpün içine yerleştirin. 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Ayrılma arabellek buz gibi hücre kültür ortamının 500 µL ekleyerek etkisiz hale getirin.
- Yukarı ve aşağı 18 G ve 20 G iğneler, 20 kere her ilerliyor hücre süspansiyon triturate. Hücre süspansiyon 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akışı ile 50 mL tüp içinde toplamak.
Not: Süzgeç ile hücre süspansiyon geçişini kolaylaştırmak için filtre uygulanmadan önce steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 500 µL ön koşulu.
-
EHBD organoids kuran
- Akış yoluyla adım 2.1.5 300 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi
- Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın. 1 mL steril buz gibi PBS hücrelerde resuspend. Resuspension yeni bir 1,5 mL tüp içine aktarın. 2.2.1 arasındaki adımları yineleyin.
- Santrifüjü sonra dikkatli bir şekilde süpernatant tüp alt kısmında toplanan yıkanmış hücrelerden çıkarın. Hücre Pelet sıvılaştırılmış buz gibi Bodrum matris 120 µL içinde P200 ipuçlarını kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend.
Not: Bodrum matris hücre Pelet resuspension buz-banyo üzerinde yapılması gerekiyor. - Bir de önceden ısıtılmış bir 24-şey plaka merkezi haline Bodrum matris hücre resuspension 40 µL plaka.
Not: Hava kabarcık oluşumunu önlemek için Bodrum matris manipüle süre emme kaçının. - Bodrum matris için 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi 15 dk ya kadar Bodrum matris katılaşmış resuspended hücreleri ile plaka dönmek. 37 ° C'ye kadar her şey (Tablo reçetesi) için sağlanan orta 600 µL ısındı ekleyin. Plaka 37 ° C doku kültürü kuluçka için dönmek.
- Tohumlama orta 3 gün ve 3 günde bundan sonra taze organoid kültür orta 600 µL ile değiştirin. Organoid büyüme ters bir mikroskopla izlemek. Kullanım organoids bir aşağı akım uygulama veya bölünmüş her 7-9 gün önce intraluminal enkaz ve organoid çöküşü birikimi (şekil 2A) gözlenir.
3. EHBD Organoid geçiş ve depolama
-
EHBD organoids 1:3 geçit 1:4 7-9 günde için
- Orta kuyudan kaldırın ve buz gibi PBS 400 µL ekleyin. Organoids hafifçe karışım aşağı yukarı 10 kez kuyuda pipetting tarafından resuspend. Karışımı bir 1,5 mL tüp aktarın.
- Karışımı bir 25 G iğne ile organoids ayırmak için 4 kez geçiş. 400 x g 4 dk 4 ° C'de karisimin santrifüj kapasitesi
- Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın ve Bodrum matris (1:3 1:4) (Adım 2.2.4.) daha fazla kültür için hücrelerde resuspend veya daha fazla işlem için buz soğuk PBS hücrelerle yıkayın.
Not: Tipik olarak, 250-300 hücreleri içine aşağı akım uygulamaları için 24-şey levha kaplama. Verimlilik kaplama organoids sayılması ve ilk hücre sayısı onların yüzde hesaplama tarafından passaging sonra günü 3-5 ters bir mikroskop kullanarak parlak alan mikroskobu ile değerlendirilebilir. mRNA guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform ayıklama kullanan standart protokolü kullanarak PBS yıkanmış EHBDOs üzerinden ayrılmış olabilir.
-
EHBD organoids, uzun süreli depolama
- Orta kuyudan çıkarın ve organoids oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. PBS Bodrum matrisi bırakma bozmadan kuyudan çıkarın.
- Orta-iyi buz gibi buz gibi hücrenin 500 µL ekleyin. Yavaşça sıvılaştırılmış Bodrum matris ve orta buz gibi hücre organoids resuspend ve karışımı kriyojenik şişeleri aktarın.
- Şişeleri-80 ° C'de 48 h. transferi için uzun süreli depolama için azot tankı şişeleri buharı aşamasında saklayın.
4. EHBD Organoid parafin katıştırma için Pprocessing
- EHBDOs buz gibi PBS (4 ° C) 500 µL içinde 5-10 kat yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Sıvılaştırılmış Bodrum matris bir 1,5 mL tüp resuspended EHBDO toplamak.
Not: Organoids bozulmaması için alt 2-3 mm P1000 uç kesti ve süpernatant çok dikkatli bir şekilde çıkarın. - Santrifüj EHBD organoids 350 x g 5 dakika süreyle de dikkatli bir şekilde süpernatant organoid Pelet bozmadan çıkarın.
- Buz gibi %4 paraformaldehyde (PFA) 1 mL için organoids ekleyin ve 4 İngiltere'de yılın gecede 4 ° C'de % organoids kuluçkaya %4 kaldırmak PFA dan sonra gece kuluçka P1000 ucu kullanarak organoids.
- Organoids ile tüp 1000 µL Oda sıcaklık PBS ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya. Tüp 350 x g 5 dk. tekrar de PBS içinde organoids ile bu işlemi iki kez daha santrifüj kapasitesi.
- PBS çıkarın ve 1 mL % 30 etanol için organoids ekleyin. Dik, 5 min için kuluçkaya
- 350 x g RT. Kaldır % 30 etanol, 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi. 1 mL % 70 etanol ekleyin ve RT., 5 min için kuluçkaya
- 350 x g 5 dk. Kaldır % 70 etanol için de centrifugate. 1 mL % 100 etanol ekleyin ve RT., 5 min için kuluçkaya
Not: Organoids, daha fazla işleme önce oda sıcaklığında en fazla 48 saat için % 100 etanol içinde tutulabilir. - Isı numune işleme jel bir mikrodalga 20 s veya sıvılaştırılmış kadar. Jel organoids ile tüp içine işleme örnek 50 µL ekleyin. Jel işleme örnek katılaşmış kadar tüp Buza koyun.
- Jel organoids tüp ile işleme numune damla çıkarın ve doku işlemcide işlenmesi için bir kaset içinde mavi sünger pedleri arasında yerleştirin. 15 dk parafin embedder her adımda daha fazla işleme sırasında kullanmak...
- Bölüm organoids numune işleme içinde parafin gömülü 4 µm. devam et immunohistokimyasal yukarıda açıklanan16boyama ile jel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim protokolünü doku özgü ve yetişkin kök hücre kaynaklı fare EHBD organoids nesil açıklar. Sonra organoids kültürlü, Kistik yapısı oluşumu 1 gün sonra EHBD yalıtım olarak erken görülebilir. Fibroblastlar ile kirlenme genellikle kültür oluşturma sırasında gözlenen değil. EHBDO verimliliği kaplama olduğunu yaklaşık %2 ne zaman yenidoğan veya yetişkin üzerinden (2 aydan daha eski) izole fare (şekil 2B). EHBD organoids verimliliğini kaplama yetişkin fareler geçit 2 ve kalır kararlı (2B rakam) % 11 oranında artar türetilmiş. Organoids çoğunluğu nadir "düzensiz" organoids (şekil 2C-E) ile tüm geçişleri ile Kistik Morfoloji göstermektedir. Organoids bir büyüme 5-7 den sonra hangi onlar biriken intraluminal enkaz başlamak ve (şekil 2A) bozulmaya gün ulaşmak. Bu nedenle, organoid kültür bakımı için onlar her 7-10 gün (şekil 2A) bölünmesi. Kez kurulan ve ne zaman gerektiği gibi organoids (kültürler yukarıya için 14 ay gözlendi) kültür neredeyse sonsuza kadar sürdürülebilir. Kültür önlemek için kirlenme farklılaşmış hücreler ile ilk hücre izolasyon, en az iki kez bir aşağı akım uygulama için kullanmadan önce pasajlı kullanım organoids üzerinden taşınır. Onlar kurtarma depolama biriminden sonra daha yüksek kaplama verimliliği beri önceki geçiş (en çok geçiş 7) organoids, uzun süreli depolama için kullanın.
Ne zaman ayirt ile analiz, EHBDOs epitel hücreleri (şekil 3A-C) E-cadherin tarafından işaretlenmiş saf bir nüfusa oluşur. Organoid hücreleri gösteren işaretleri safra progenitör hücre (pankreas ve Duodenal Homeobox 1 (PDX1); Şekil 3A) Safra farklılaşma işaretleri yanı sıra (cytokeratin 19 (CK19) ve cinsiyet belirleme bölgesi Y-Box 9 (SOX9); Şekil 3B, C). Önemlisi, organoid hücreleri yüksek oranda sahip acetylated α tarafından-tübülin (a-AT; olarak işaretlenmiş bir birincil cilium Şekil 3D), hangi normal cholangiocytes bir özelliğidir ve uygun organoid hücre polarizasyon öneriyor. Ifade işaretleri Dede (Pdx1) ve safra farklılaşmış hücre [Ck19, Sox9, Aquaporin 1 (Aqp1), Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü(Cftr)] de doğruladı gerçek zamanlı nicel ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu tarafından (qRT-PCR) (Tablo 1). Cholangiocytes EHBDs14,17,18için karakteristik bu işaretleri birleşimidir.
Özetle, bu protokol polarize safraya ait epitelyal hücreler progenitör ifade bir organoid kültür model nesil açıklar ve işaretlerini tanır. Bu sistem kültüründe Morfoloji, depolanan değişiklik olmadan uzun bir süre için uzun vadeli ve analiz immünhistokimya ve qRT-PCR ile korunabilir.
Resim 1 : EHBD organoid kültür üretimi ve cerrahi set yukarıya şematik (A). şematik EHBD organoid üretimi. (B). cerrahi alan EHBD yalıtım için küme ve bir buz tepsiye her zaman tutulan bir cam levha (noktalı çizgi) dahil. (C). steril cerrahi ekipman keskin makas, düz dahil ve tırtıklı cımbız, hemostat ve neşter kavisli. (D ve E) EHBD bağ ve pankreas dokusu tarafından dikkatli diseksiyon proksimale intrahepatic safra kanalları ve karaciğer (D, ok) ve klemple oniki parmak bağırsağı (D, ok) takip çevreleyen izole. Cetvel işaretlerine = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : EHBDO kültür. (A). EHBDOs mikroskobik görüntüler üzerinde bir 12-günlük ders. (B). organoids verimliliğini kaplama yenidoğan türetilmiş (kültür, n başına 2 fareler 3 kültürler =) ve yetişkin (> 2 aylık 1 fare başına kültür, n = 3 kültürleri) sonra 24-şey plaka bir kuyu başına 300 hücre kaplama ve numaralandırma organoids kurulan fareler 5. gün kültür üzerinde. (C ve D) EHBDO karşı düzensiz Morfoloji Kistik mikroskobu tarafından analiz. (E). Kistik ve düzensiz şekilli organoids yüzde erken analiz (< 10) ve geç (≥10) organoid pasajlar. Ölçek çubukları standart hata ortalamaya (SEM), t+ / ortalama olarak gösterdi 500 µm. Nicel veri =-test. NS = önemli değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : EHBDOs hızlı işaretleri Dede ve olgun safra hücre. (A-C). EHBDOs işaretleri epitel (Ab E-cadherin, kırmızı), yaratıcı(a.boyama ayirt tarafından analiz edildi PDX1, yeşil) ve farklı (B. CK19, yeşil; ve C. bir AT, kırmızı) safra hücreleri. Ölçek çubukları 25 µm. = *, lumen. (D). EHBDOs, Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1ve Cftr mRNA bereket için qRT-PCR ( Hprtifade göre ortalama + /-SEM) tarafından analiz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Gen | Üyelik numarası | Astar sıra | Ürün boyutu | ||
| HPRT | NM_013556 | İleri 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3' | 173 bp | ||
| 5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3 ters ' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | İleri 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3' | 133 bp | ||
| 5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3 ters ' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | İleri 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3' | 107 bp | ||
| 5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3 ters ' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | İleri 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3' | 133 bp | ||
| 5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3 ters ' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | İleri 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3' | 112 bp | ||
| 5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3 ters ' | |||||
Tablo 1: astar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu eser fare EHBD cholangiocytes bir organotypic 3 boyutlu model nesil açıklar. EHBDO kültür üretimi önemli adımlardan dahil pankreas hücresi kirlenmesini, bakteriyel ve mantar kirlenme ve sonra Santrifüjü önlemek için dikkatli işleme önlemek için steril koşulları bakımından önlemek için çok titiz EHBD diseksiyon hücresel malzeme kaybı. Açıklanan sıcaklık koşullarında yakın bir bağlılık gereklidir. Teknik bazı sınırlamalar vardır. EHBDs yetişkin fareler küçük (yaklaşık 1 mm çapı; Şekil 1E), hangi yalıtım için incelik gerektirir. Diseksiyon mikroskop diseksiyon ile yardımcı olmak için kullanılabilir.
Bu protokol için kullanılan Bodrum matrix bilinen ve bilinmeyen büyüme faktörleri19olan konsantrasyonu çok çok değişebilir, içeren biyolojik matris var. Biz teknik çoğaltır için aynı çok ve/veya aliquot Bodrum matris değişkenlik önlemek için kullanılması önerilir. Ayrıca düzenli olarak Mikoplazma kirlenme için L-UYR hücre kültürü ve WNT etkinliği11şartına orta kontrol öneririz. Bu çalışma için laboratuara bir Mycoplasma algılama kiti ve WNT etkinliği tahlil sırasıyla kullanılır. Özellikle, EHBDOs orta fetal sığır serum (% 0.5; düşük miktarda içerir Tablo malzeme).
Sunulan Protokolü progenitör hücre içeren bir 3 boyutlu epitel hücre kültür açıklar ve hücre işaretleri cholangiocytes için karakteristik ve kurulan WNT3a, R-spondin1 ve kafa büyüme faktörleri varlığında ayrıştırılan ve tanımlanan takviyeleri (Malzemeler tablo). Organ özgü gibi yetişkin fare EHBDs türetilmiştir. Bu büyük olasılıkla hücre kendi kendine organizasyon 3 boyutlu yapıları ve yeteneği muhafaza ve uzun vadeli genişletilmiş kanıtladığı kök hücre özellikleri ile yetişkin hücrelerden elde edilir. Organoids bir daha kök hücre gibi organoid fenotip gösteriyor olabilir en az "filizlenen," ile yapı içinde ağırlıklı olarak Kistik. Bir daha yüksek kaplama verimliliğini organoids yanı sıra farklılaşma daha yüksek bir derece için ek kök hücre niş faktörler neden olabilir mümkündür.
Bizim teknik hangi hayvan kullanımı en aza indirir, son derece tekrarlanabilir ve birden çok akış yönündeki uygulama izin veren bir zaman ve maliyet-etkin şekilde oluşturulabilir bir 3 boyutlu organoid kültür üretir. Yetişkin EHBDs çalışmak için araçlar çok sınırlı olduğundan bu yeni araç EHBD çalışmalar için önemlidir. Bu birçok insan doku erişiminiz veya genetiği değiştirilmiş fare modelleri yararlanmak istediğiniz laboratuvarları özel avantaj olacaktır.
Fare doku, insan dokusu, aksine son derece erişilemez. Fare doku çalışmaya immünhistokimya antikorlar da dahil olmak üzere birden çok reaktif vardır. Bu teknik başlangıçta tanıtılan bu yana Kültür yetişkin doku organoids reaktifler maliyetini önemli ölçüde azalmıştır. Buna ek olarak, yeni malzemeler kullanılabilir, daha fazla organoid kültür maliyeti azaltır bu protokol için kullanılan L-UYR şartına cep orta dahil olmuştur. EHBDOs basit-e doğru yaymak, depolamak ve analiz için proses. İmmunohistokimyasal, mikroskobik ve qRT-PCR analizleri bu el yazması örnek olarak sunulmaktadır. Ayrıca, bizim grup yakın zamanda üretimi ve EHBDOs genetik fareler üzerinden kullanımı ve EHBDO hücre çoğalması 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU)16kullanarak Nefelometri nitelendirdi.
EHBDOs potansiyel aşağı akım uygulamaları bunlarla EHBD cholangiocyte homeostazı mekanizmaları incelemek için cholangiocytes, neredeyse sınırsız miktarda kültür için sınırlı değildir. Gelecekte, bu iletişim kuralını hastalık durumlarında çalışma odasına uygulanabilir; cholangiocyte organoids, rejeneratif tıp (intrabiliary implantasyon), genetik ve farmakolojik manipülasyon, uyuşturucu16testi analizi de dahil olmak üzere test etmek için; ve enfeksiyöz ajanlar12,20etkilerini incelemek için. Hücre-hücre etkileşim ile diğer hücre türleri21EHBD organoids ortak kültürü kullanarak okudu olabilir.
İnsan malzeme değerli ve sınırlı olduğundan fare kaynaklı organoids insan EHBDOs, nesil önce pilot çalışmalar için kullanılabilir. Gelecekteki çalışmaları daha yüksek kaplama verimliliği teşvik faktörler keşfi üzerinde duruldu ve organoid hücre farklılaşması insan organoids incelenmesi için istenen. Organoid kültürü için daha biyolojik olarak tarafsız bir hücre dışı matriks için arama devam eden çalışmalar da EHBDOs kültür arıtma için uygun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.
Acknowledgments
Bu eser çalışma karaciğer hastalıkları Pinnacle Ödülü (için N.R.) ve ulusal sağlık enstitüleri, diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim için Amerikan Derneği ve böbrek hastalıkları (P30 DK34933 N.R., P01 DK062041 J.L.M. için Ödülleri) tarafından desteklenmiştir. Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Michigan Üniversitesi) geliştirme Bu metodoloji ile onun yardım için teşekkür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F.
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L.
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
