Summary
قمنا بنجاح بتحويل معيار التضخيم المكرر لبروتوكول التيتيمير (فخ) ليتم استخدامه في التفاعلات المتسلسلة الرقمية للبوليميريز. هذا الفحص الجديد ، ويسمي ddTRAP ، هو أكثر حساسية وكميه ، مما يسمح للكشف بشكل أفضل والتحليل الإحصائي للنشاط التيلوميراز داخل الخلايا البشرية المختلفة.
Abstract
ان بروتوكول تضخيم التيلوميريه (فخ) هو الاختبار الأكثر استخداما للكشف عن نشاط التيتيلوراز داخل عينه معينه. يسمح الأسلوب القائم علي تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) باجراء قياسات قويه لنشاط الانزيم من معظم الخلايا الخلوية. فخ القائم علي هلام مع فلوريسسينتلي المسمي الإشعال حدود الانتاجيه عينه ، والقدرة علي الكشف عن الاختلافات في عينات يقتصر علي اثنين اضعاف أو أكبر التغييرات في نشاط الانزيم. فخ الرقمية الحبريه, ddTRAP, هو نهج حساسة للغاية التي تم تعديلها من المقايسة فخ التقليدية, تمكين المستخدم من اجراء تحليل قوي علي 96 عينات لكل تشغيل والحصول علي التحديد الكمي المطلق للحمض النووي (التيلوميراز تمديد المنتجات ) المدخلات داخل كل PCR. ولذلك ، فان فحص ddTRAP المطور حديثا يتغلب علي القيود التي تفرضها المقايسة التقليدية القائمة علي الهلام ويوفر نهجا أكثر كفاءه ودقه وكميه لقياس نشاط التيلوميراز داخل المختبرات والإعدادات السريرية.
Introduction
التيلوميرات هي مركبات حيوية من بروتين الحمض النووي في نهايات الكروموسومات الخطية. وتتكون التيلوميرات البشرية من مجموعه من 5 '-TTAGGGn هيكامريميك تكرار التي تختلف في الطول بين 12-15 كيلوبياسيس (kb) عند الولادة1. الإنسان التيلوميراز ، انزيم ريبونكليوبروتين الذي يحافظ علي التيلوميرات ، تم تحديده لأول مره في خليه هيلا (خط الخلايا السرطانية)2. معا ، تلعب التيلوميرات والتيلوميراز دورا رئيسيا في طيف من العمليات البيولوجية مثل حماية الجينوم ، وتنظيم الجينات ، وخلود الخلايا السرطانية3،4،5،6.
يتكون التيلوميراز البشري في المقام الأول من مكونين رئيسيين ، هما الناسخ العكسي التيلوميراز والحمض الريبي التيلوميراز (hTERT و Htert ، علي التوالي). الوحدة الفرعية للبروتين ، hTERT ، هي مكون الناسخ العكسي النشط المحفز لانزيم التيلوميراز. يوفر قالب RNA ، hTERC ، التيلوميراز مع القالب لتمديد و/أو الحفاظ علي التيلوميرات. معظم الانسجه الجسدية البشرية ليس لها نشاط قابل للكشف عن التيلوميراز. ان عدم قدره البوليميرات الحمض النووي علي تمديد نهاية الحبل المتخلف من الحمض النووي إلى جانب عدم وجود التيلوميراز يؤدي إلى التقصير التدريجي للوميرات بعد كل جولة من الانقسام الخلوي. وتؤدي هذه الظواهر إلى تقصير التيلوميريه في معظم الخلايا الجسدية حتى تصل إلى الطول المختصر للغاية ، حيث تدخل الخلايا حاله من الشيخوخة التكرارية. والعدد الأقصى من المرات خليه يمكن تقسيم تمليه طول التيتيمير وهذا كتله لاستمرار انقسام الخلايا ويعتقد لمنع التقدم إلى اونكوجينيسيس7. الخلايا السرطانية قادره علي التغلب علي الشيخوخة المستحثة التيلوميريه والاستمرار في التكاثر عن طريق استخدام التيتيلوراز للحفاظ علي التيلوميرات. وينشط حوالي 90% من السرطانات التيلوميراز ، مما يجعل نشاط التيلوميراز مهما للغاية في كل من الكشف عن السرطان وعلاجه.
وكان تطوير اختبار الفخ في التسعينات مفيدا في تحديد المكونات الضرورية لانزيم التيلوميراز ، فضلا عن قياس التيلوميراز في مجموعه واسعه من الخلايا والانسجه ، سواء كانت طبيعيه أو سرطانيه. الأصلي المستندة إلى هلام الفحص PCR تستخدم راديوب# نشاط المسمي ركائز الحمض النووي للكشف عن النشاط التيلوميراز. في 2006, تم تكييف الفحص في شكل غير مشع باستخدام فلوريسسينتلي المسمي ركائز8,9. باستخدام ركائز فلوريسسينتلي المسمية ، كان المستخدمون قادرين علي تصور منتجات تمديد التيلوميراز كعصابات علي هلام من خلال تعريضه لطول الموجه الاثاره الصحيحة. وقد جعلت حساسية الفحص فخ وقدرته علي الكشف عن النشاط التيلوميراز في الخلايا الخام لهذا الفحص الطريقة الأكثر استخداما للكشف عن النشاط التيلوميراز. ومع ذلك ، الفحص فخ له قيود. ويستند الفحص إلى الهلام ، مما يجعل من الصعب اجراء النسخ المتماثلة الضرورية في الدراسات المتوسطة إلى العالية الانتاجيه ، التالي ، نادرا ما يتحقق التحليل الإحصائي السليم. وعلاوة علي ذلك ، من الصعب تحديد الفحص القائم علي الهلام بشكل موثوق بسبب عدم قدره الكشف عن الاختلافات المزدوجة في نشاط التيلوميراز بين العينات. التغلب علي هذين القيدين أمر بالغ الاهميه لاختبارات النشاط الانزيمي مثل فخ للانتقال إلى الإعدادات السريرية أو الصناعية للكشف عن نشاط التيلوميراز في عينات المريض أو دراسات تصميم المخدرات.
تم تطوير PCR الرقمية في البداية في 1999 كوسيلة لتحويل الطبيعة الاسيه والتناظرية من PCR إلى الفحص الخطي والرقمي10. الحبريه الرقمية PCR (ddPCR) هو أحدث الابتكارات من منهجيه PCR الرقمية الاصليه. وجاءت القطرة الرقمية PCR مع ظهور ميكروفلويديكس المتقدمة والنفط في المياه مستحلب الكيمياء لتوليد موثوق بها قطرات مستقره والحجم علي قدم المساواة. علي عكس الهلام القائم وحتى PCR الكمي (qPCR) ، ddPCR يولد التحديد الكمي المطلق للمواد المدخلة. المفتاح إلى ddPCR هو توليد التفاعلات الفردية ~ 20,000 عن طريق تقسيم عينات إلى قطرات. بعد نقطه النهاية PCR ، يمسح القارئ القطيرات كل قطره في الأزياء التي تشبه التدفق المضخم للخلايا ، والعد ، والتحجيم ، وتسجيل وجود أو غياب الفلورية في كل قطره فرديه (اي غياب أو وجود الرموز المصغرة PCR في كل قطره). ثم ، باستخدام توزيع بواسون ، يتم تقدير جزيئات الإدخال استنادا إلى نسبه القطرات الموجبة إلى العدد الإجمالي للقطيرات. يمثل هذا الرقم تقديرا لعدد جزيئات الإدخال في كل PCR. وعلاوة علي ذلك ، يتم تنفيذ ddPCR وتحليلها علي لوحه 96 البئر الذي يسمح للمستخدم لتشغيل العديد من العينات ، فضلا عن أداء البيولوجية والتقنية والنسخ المتماثلة للتحليل الإحصائي السليم. ونتيجة لذلك ، فقد جمعنا بين القياس الكمي القوي والطبيعة المتوسطة الانتاجيه لddpcr مع مقايسة الفخ لتطوير الفحص الخاص ب Ddpcr11. تم تصميم هذا الفحص للمستخدمين لدراسة وتحديد كميه النشاط التيلوميراز المطلق من العينات البيولوجية11،12. وتسمح حساسية ddTRAP بالتحديد الكمي لنشاط التيلوميراز من العينات المحدودة والثمينة ، بما في ذلك قياسات الخلايا الواحدة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن للمستخدمين أيضا دراسة اثار التلاعب التيلوميراز و/أو المخدرات مع التحديد الكمي المطلق لأقل من التغييرات مزدوجة (~ 50 ٪ الاختلافات). و ddTRAP هو التطور الطبيعي لفحص فخ في الطبيعة الرقمية والانتاجيه العالية من التجارب المختبرية الحديثة والإعدادات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد المخزن المؤقت والتخزين
- اعداد 50 mL من 1x الأوراق المالية RNase-/Dnase-rfree NP-40 تحلل العازلة (10 ملم تريس-HCl [pH 8.0] ، 1 مم MgCl2، 1 مم ايثيلنديدياتيتاتاتاستيك حمض (أدتا) ، 1 ٪ [المجلد/المجلد] NP-40 ، 10 ٪ [vol/vol] الجلسرين ، 150 Mm nacl ، 5 مم β-mercaptoethanol ، و 0.1 mm 4- هيدروكلوريد فلوريد بينزينيسولفونيل (AEBSF بنك). يمكن نقل هذه المخزن المؤقت وتخزينها في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل. تجنب دورات التجميد/الذوبان من أجل الحصول علي تحلل أمثل من الخلايا.
- اعداد 50 مل من 10x المخزون RNase-/Dnase-fan الحرة فخ الفاصل العازلة (200 mM تريس-HCl [pH 8.0] ، 15 مم MgCl2، 630 Mm kcl ، 0.5 ٪ [vol/vol] توين 20 ، و 10 ملم الاثيلين جلايكول-bis (β-امينوايثيل الأثير)-N ، N ، n ′ ، n′-رباعي حامض (egta)). هذا المخزن المؤقت يمكن ان اقتبس إلى 1 مل قسامات وتخزينها في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل.
2-التحلل الخلوية
-
اعداد الخلايا
- ذوبان الجليد المجمدة من NP-40 تحلل العازلة. بمجرد أذابه ، ضع العازل التحلل علي الجليد. أضافه فلوريد فينيل ميثيل السلفونيل (مثبطات الانزيم البروتيني PMSF) إلى تحلل العازلة NP-40 للوصول إلى التركيز النهائي من 0.2 مم.
ملاحظه: يجب ان يتم ذلك مباشره قبل ليسينج الخلايا. - أزاله اي السائل الزائد من الكريات الخلية التي تم جمعها لضمان بيليه الخلية الجافة. لاحظ ان كريات الخلايا ، سواء الطازجة التي تم جمعها أو المجمدة سابقا (-80 درجه مئوية أو فلاش المجمدة في N2السائل) ، يجب ان لا تحتوي علي اي حلول متبقية من سينتريفوجيشنز السابقة لان هذه الحلول قد تتداخل مع الإجراءات المصب.
- قم بزراعه وجمع وتجميد كل من خطوط الخلايا الموجبة والسالبة التيلوميراز (BJ الليفية ، IMR-90 أو U2OS) من أجل استخدامها كعناصر تحكم ايجابيه وسلبيه. استخدام التحكم الجديدة لست] في كل مره يتم اجراء الفحص لضمان فحص استنساخ.
ملاحظه: ينصح بزراعه ثقافة كبيره من خلايا التيلوميراز السالبة ونقلها قبل التجمد لأزاله اي قطع أثريه ذات صله بالانسجه التي قد يتم إدخالها خلال الثقافة طويلة الأمد لخطوط الخلايا للمساعدة في ضمان نتائج قابله للتكرار عينه التحكم السلبية. - ضع كريات الخلايا علي الثلج. إذا كانت الخلايا المجمدة ، والسماح لهم بالذوبان لفتره وجيزة علي الجليد.
ملاحظه: احجام الخلايا النموذجية بيليه ل ddTRAP بين 500,000 و 1,000,000 الخلايا. يمكن أيضا استخدام كريات الخلايا الأصغر إذا لزم الأمر ، ولكن يجب ان يكون رقم الخلية معروفا/مثاليا. ويمكن أيضا ان يتم تنفيذ ddTRAP استنادا إلى مدخلات البروتين باستخدام فحص بروتين BCA (الإدخال هو عاده 1 ميكروغرام).
- ذوبان الجليد المجمدة من NP-40 تحلل العازلة. بمجرد أذابه ، ضع العازل التحلل علي الجليد. أضافه فلوريد فينيل ميثيل السلفونيل (مثبطات الانزيم البروتيني PMSF) إلى تحلل العازلة NP-40 للوصول إلى التركيز النهائي من 0.2 مم.
-
ليسينج من الخلايا
- Lyse الخلايا في المخزن المؤقت تحلل NP-40. الحفاظ علي تكافؤ خليه 25,000 خلايا/μL من المخزن المؤقت. علي سبيل المثال ، lyse بيليه (تحتوي علي خلايا 1,000,000) في 40 μL من NP-40 تحلل المخزن المؤقت. ماصه pipet-x بلطف لاعلي ولأسفل من أجل كسر فتح الخلايا. في محاولة لتجنب صنع فقاعات.
- السماح للخلايا إلى lyse علي الجليد لمده 30 دقيقه. تاكد من الدوامة بلطف محلله لمنع مجموعات من الحطام الخلية من تشكيل. وهذا يمكن ان يتم كل 10 دقيقه ، ويهدف إلى الحفاظ علي محلله خليط متجانس.
- تمييع الخلية محلله (25,000 خلايا/μl) 1:20 في NP-40 تحلل العازلة ، مما يجعل التكافؤ الخلية الجديدة 1,250 الخلايا/μl. علي سبيل المثال ، تمييع 5 μl من الخلية محلله إلى 95 μl من المخزن المؤقت تحلل.
3. رد فعل التمديد التيلوميراز
- اعداد مزيج رئيسي (الجدول 1) للتفاعل التمديد التيلوميراز (لكل رد فعل).
ملاحظه: فمن الأفضل لاعداد التمديد رد فعل المزيج الرئيسي خلال تحلل الخلية وتخزينها علي الجليد.- Pipet 48 μL من الامتداد الرئيسي مزيج في كل أنبوب PCR.
- أضافه 2 μl من المخفف (1,250 خلايا/μl) محلله إلى رد فعل التمديد. يجب ان يكون الحجم الإجمالي الآن 50 μL مع مكافئ الخلية النهائية من 50 خلايا/μL.
- قم باجراء تفاعل التمديد التيلوميراز (الجدول 2).
- تخزين منتجات تمديد التيلوميراز في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 3-5 أيام ؛ ومع ذلك ، فمن الأمثل لاستخدام المنتجات التمديد في غضون 24 ساعة الاولي.
4. قطره PCR الرقمية الاعداد
- اعداد مزيج رئيسي (الجدول 3) لل ddtrap (لكل رد فعل).
ملاحظه: بمجرد الكواشف هي في درجه حرارة الغرفة ، لا تضع لهم أو المزيج الرئيسي علي الجليد. وضع المزيج علي الجليد قد يزيد من اللزوجة ويؤدي إلى تشكيل قطره الفقراء. البوليميرات الحمض النووي في المزيج الفائق ddPCR هو بداية ساخنه وينبغي ان تكون مستقره في درجه حرارة الغرفة. ويمكن تخزين المزيج الفائق من ddPCR عند درجه حرارة 4 درجات مئوية بعد الذوبان الاولي من-20 درجه مئوية.- Pipet 19.8 μL من ddPCR ماستر مزيج في كل أنبوب PCR.
- أضافه 2.2 μL من رد الفعل التمديد لكل أنبوب. لاحظ انه يجب ان يكون إجمالي حجم الآن 22 μL.
ملاحظه: المبلغ الإجمالي للعينه المطلوبة ل ddTRAP هو 20 μL (التكافؤ الخلية 100 الخلايا). حجم إضافي هو الاحتياط لخطا ماصه pipet-x أو فقدان العينة.
- قم باعداد خرطوشه توليد القطرات.
ملاحظه: تحتوي الخرطوشة علي ثلاثه أعمده مختلفه من الآبار التي تمت تسميتها.- تحميل 20 μL من رد فعل أعدت وفقا للخطوة 4.1.2 في عينه جيدا (بئر الأوسط) في خرطوشه. تجنب فقاعات عند الأنابيب العينة.
ملاحظه: إذا كان هناك فقاعات ، انقر برفق علي جانب الخرطوشة بحيث تاتي هذه الفقاعات إلى الجزء العلوي من الحل. - تحميل 70 μL من النفط الجيل القطيرات في بئر النفط (اليسار بشكل جيد).
ملاحظه: من أجل تجنب التلوث ، استخدم بدقه مجموعه منفصلة من الماصات ونصائح لخطوات توليد القطرات ddPCR. ترتيب تحميل الخرطوشة مهم. يجب ان يتم تحميل العينة قبل تحميل النفط والنفط هو أثقل وسوف تملا الغرف ميكروفلويديك ويؤدي إلى تشكيل قطره الفقراء. الحد الأدنى لعدد العينات التي يمكن تشغيلها هو ثمانيه. يجب ان يتم تحميل جميع الآبار من خرطوشه مع العينة كما اي بئر فارغه سوف يؤدي إلى وقف في توليد القطيرات من مولد الحبريه. إذا لم تتوفر عينات كافيه لتحميل جميع الآبار الثمانية داخل خرطوشه ، يمكن تحميل 20 μL من المزيج الرئيسي ddTRAP (الخطوة 4.1) في الخراطيش المتبقية. - تامين طوقا في المكان عن طريق الربط إلى نهايات خرطوشه.
ملاحظه: الافتقار أو وضع غير لائق من طوقا سوف تمنع مولد من توليد قطرات. - ضع الخرطوشة المحملة والمجمعة في مولد القطرة.
ملاحظه: يتم التعرف علي خرطوشه من قبل المغناطيس في المولد ، والتي سوف تبلغ المستخدم عندما يتم وضع خرطوشه بشكل صحيح.
- تحميل 20 μL من رد فعل أعدت وفقا للخطوة 4.1.2 في عينه جيدا (بئر الأوسط) في خرطوشه. تجنب فقاعات عند الأنابيب العينة.
- قم بازاله الخرطوشة بمجرد ان يتم إنشاء القطرات وتكتمل الدورة (~ 60 – 90 ثانيه).
- قم بازاله الطوق برفق من الخرطوشة. Pipet القطرات المتولدة حديثا (الحق في البئر) ، وذلك باستخدام ماصه متعددة القناات ، إلى لوحه PCR 96 البئر.
ملاحظه: يجب ان يكون الحجم التقريبي لمستحلب القطيرات الذي تم إنشاؤه حديثا 40 – 43 μL. - الحرارة ختم لوحه مع رقائق ألومنيوم PCR لوحه الأختام مره واحده يتم تحميل جميع العينات في لوحه 96 البئر من أجل منع التبخر خلال الخطوات PCR.
- قم بازاله الطوق برفق من الخرطوشة. Pipet القطرات المتولدة حديثا (الحق في البئر) ، وذلك باستخدام ماصه متعددة القناات ، إلى لوحه PCR 96 البئر.
- تحميل لوحه 96-بئر في ثيرموسيكلير وتنفيذ رد فعل PCR التالية (الجدول 4).
ملاحظه: يجب تعيين جميع معدلات المنحدر بين درجات درجه الحرارة إلى 2.5 درجه مئوية/ثانيه من أجل تسخين ردود الفعل بشكل صحيح.
5. الكشف عن منتجات تمديد التيلوميراز
- تحميل لوحه 96 البئر في قارئ الحبريه.
ملاحظه: تاكد من توجيه لوحه بشكل صحيح بحيث يطابق نموذج A1 مع ان الحامل.- افتح البرنامج المقترن بقارئ القطرات. انقر نقرا مزدوجا فوق أول A1 جيدا لفتح شاشه محرر العينة/البئر.
- انقر علي التجربة وحدد ABS من القائمة المنسدلة.
ملاحظه: تعرف التجربة نوع الفحص الذي سيتم استخدامه (اي التحديد الكمي المطلق أو فحص رقم النسخة الجينية). ABS لتقف علي التحديد الكمي المطلق. - حدد QX200 ddPCR Evagreen Supermix لضمان استخدام طريقه الكشف الصحيحة من قبل القارئ. انقر فوق تطبيق في الجانب الأيسر السفلي من شاشه محرر البئر لحفظ الإعدادات المعرفة من قبل المستخدم لجميع الآبار المبرزة.
ملاحظه: supermix يحدد نوع المزج PCR والكيمياء الكشف التي سيتم قراءتها من قبل القارئ. - انقر علي الهدف في شاشه محرر البئر من البرنامج من أجل تحديد العينة.
- حدد نوع النموذج بالنقر فوق القائمة المنسدلة الهدف وتحديد اما غير معروفأو مرجعأو الاداره الانتقالية (لا يوجد قالب عنصر تحكم).
ملاحظه: قد يشير المجهول إلى عينه تجريبية ، ويمكن ان يكون المرجع عينه تحكم من نشاط التيلوميراز المعروف ، والتقرير الانتقالي هو عنصر تحكم حاسم لتحديد صحة المقايسة من حيث التلوث و اشاره الخلفية. - تسميه كافة العينات في المقطع اسم نموذج وانقر فوق تطبيق للتاكد من تحرير الآبار المبرزة بشكل مناسب.
- انقر فوق تشغيل لتشغيل/قراءه لوحه. حدد اما الاعمده أو الصفوف في شاشه خيارات التشغيل عند مطالبتك باعلام الجهاز حول الاتجاه الذي يجب قراءه اللوحة به.
6-تحليل البيانات
- تحديد عدد القطرات المقبولة لكل عينه من خلال النقر علي الآبار الفردية. انقر نقرا مزدوجا فوق الآبار الفردية أو رؤوس الاعمده/الصفوف لعرض بيانات العينة وتحليلها.
ملاحظه: أهم المعايير المتعلقة بالمضي قدما في تحليل عينه معينه هي عدد "القطرات المقبولة". بالنسبة إلى ddTRAP ، فان العينات التي تحتوي علي 10,000 أو أكثر من القطرات المقبولة صالحه لمزيد من التحليل. يمكن توفير البيانات للمستخدم في العديد من الاشكال ، بما في ذلك الجدول .csv ، الصور jpg ، الرسوم البيانية ، الخ. هناك العديد من الموارد المتاحة للتحليل المتعمق لبيانات ddpcr ، بما في ذلك ddpcr11،13. تقدم هذه الموارد دليلا لتحليل بيانات ddtrap ، من تحديد عتبات11،13 لاختيار عينات لمزيد من التحليل11،13، وتحديد الإيجابيات الزائفة والسلبية13، و العامة استكشاف الأخطاء وإصلاحها13. - تسليط الضوء علي الآبار التي تمثل نماذج متماثلة وعينات المجلس الانتقالي. تحليل العينات بالمقارنة اما بخطوط التحكم التابعة للمجلس الانتقالي أو السلبية ، مثل خلايا BJ (كما هو مذكور أعلاه في الخطوة 2-1-2).
- تعيين عتبه للعينات يدويا عن طريق النقر علي أيقونه لاعداد عتبات في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة. تعيين عتبات لكل فرد بشكل جيد أو لآبار متعددة في كل مره (مستحسن).
ملاحظه: إذا تم الكشف عن الخلفية في المجلس الانتقالي ، فانه يمكن طرحها من جميع العينات الأخرى إلى "تطبيع" الاشاره والتاكد من انه يتم تحليل الاشاره الايجابيه الحقيقية فقط. وعاده ما تكون قيم الجهاز الانتقالي في نطاق 0.2 – 1 جزيء/μL لنظام المخزن المؤقت تحلل 40. سيلزم اختبار النظم والمكونات الأخرى العازلة (علي سبيل المثال ، مخازن الفصول المؤقتة).
- تعيين عتبه للعينات يدويا عن طريق النقر علي أيقونه لاعداد عتبات في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة. تعيين عتبات لكل فرد بشكل جيد أو لآبار متعددة في كل مره (مستحسن).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام ddTRAP ، تم قياس نشاط التيلوميراز في لوحه خليه تتكون من خطوط الخلايا التالية (الشكل 1): سرطان الرئة غير الصغيرة للخلايا (H2882 ، H1299 ، Calu6 ، H920 ، A549 ، و H2887) ، وسرطان الرئة الخلوية الصغيرة (H82 و SHP77) ، والسلبية التيلوميراز الخلايا الليفية (BJ). 1,000,000 الكريات الخلية التي كانت في المخزن المؤقت NP-40 ، وأجريت تفاعلات تمديد التيلوميراز في ثلاثيات بيولوجية. عنصر التحكم السلبي الشائع والموصي به بشده هو "الاداره الانتقالية" ، عنصر التحكم بدون قالب. يتم إنشاء هذه العينة عن طريق أضافه 40 المخزن المؤقت تحلل (2 μL) إلى تفاعل ملحق التيلوميراز والمتابعة مع منتجات التمديد بطريقه متطابقة مع العينات الأخرى التي تحتوي علي الخلية الفعلية lysate. تسمح هذه العينة للمستخدم بطرح اشاره الخلفية ، ان وجدت ، لقياس نشاط التيلوميراز بشكل أفضل. علي الرغم من ان لا يظهر في هذا الرقم ، فمن الممكن أيضا للحرارة إلغاء تنشيط في محلله في 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق قبل رد فعل تمديد التيلوميراز كعنصر تحكم سلبي آخر. ويفضل هذا التحكم السلبي إذا كانت الخلية/وفره العينة ليست مشكله.
من خلال قياس كثافة فلوري من كل قطره واحده في مستحلب قطره ، وكان القارئ الحبريه قادره علي تقدير تركيز جزيئات الإدخال (جزيئات/ميكروليتر) باستخدام توزيع بواسون (الشكل 1A). وفي حاله ddTRAP ، كانت هذه الجزيئات المدخلة منتجات تمديد التيلوميراز. وكانت اليه فحص ddTRAP كما يلي: تمديد التيلوميراز الركيزة TS. تصرف هذا ركائز موسعه ك ال [بكر] قوالب في ال [دبكر]. وقد وفر القياس الكمي لركائز PCR المضخمة تمثيلا للنشاط الانزيمي التيلوميراز داخل خط خلوي معين. تم رسم كل قطره كما هو موضح في الشكل 1A. قد يكون تعيين عتبه ddTRAP غير موضوعي; ومع ذلك ، مع الضوابط السلبية المناسبة ، يمكن للمستخدم بسهوله القيام بذلك. في المثال الموضح في الشكل 1A، تم تعيين عتبه لكل النسخ المتماثلة البيولوجية الثلاثة لSHP77 و H2887 و المجلس الانتقالي. كانت قطرات ايجابيه كثافة مضان حول 6,000 السعه الفلورية (FA) وشكلت السكان واضحة في الأعلى ومنفصلة عن قطرات السلبية حول 1,100 FA. لذلك ، قد يتم تعيين عتبه في ~ 2,000 FA في هذه التجربة.
وبمجرد جمع البيانات وتصديرها ، كان من الممكن حساب مجموع منتجات تمديد التيلوميراز لكل خليه مكافئه بين جميع العينات (الشكل 1 ب). الاشاره من كل بئر كان تركيز مطلقه (جزيئات/[ميكروليتر]). من خلال ضرب التركيز بنسبه 20 (حجم الإدخال من العينة إلى خراطيش ddPCR) ، قد يحصل المستخدم علي العدد الإجمالي لجزيئات. ويمكن بعد ذلك تقسيم هذا العدد من قبل ما يعادل الخلية المعروفة (في أدائنا من ddTRAP ، استخدمنا 100 الخلايا). هذه القيمة النهائية هي في وحدات المنتجات تمديد التيلوميراز لكل خليه مكافئ كما هو مبين علي محور ص.
الشكل 1: نشاط التيلوميراز في لوحه سرطان الرئة. (ا) السعه 1d لكثافة الفلورية الحبريه (السعه الفلورية) لSHP77 ، H2887 ، والمجلس الانتقالي. تم اختيار الآبار لSHP77 ، H2887 ، والمجلس الانتقالي وتم تعيين عتبه يدوية في 2,000 FA. (ب) تم تقدير نشاط التيلوميراز من التركيز المقيس للأحماض النووية المكتشفة بعد PCR والمرسومة من أجل مقارنه نشاط التيلوميراز في خطوط سرطان الرئة. FA = وحدات السعه الفلورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد قياس نشاط التيلوميراز أمرا حاسما بالنسبة لعدد كبير من المواضيع البحثية بما في ذلك ، علي الرغم من عدم الاقتصار علي ، السرطان ، والبيولوجيا التيلوميريه ، والشيخوخة ، والطب التجديدي ، وتصميم الادويه المستندة إلى البنية. التيلوميراز RNPs منخفضه الوفرة ، حتى في الخلايا السرطانية ، مما يجعل الكشف عن هذا الانزيم ودراسته أمرا صعبا. في هذه الورقة ، وصفنا الإجراءات خطوه بخطوه لفحص ddTRAP المطور حديثا لقياس نشاط التيلوميراز بقوة في الخلايا. من خلال الجمع بين تفاعل التيلوميراز التقليدي مع ddPCR ، تمكنا من الكشف الكمي عن نشاط التيلوميراز (المنتجات الموسعة التيلوميراز) في خلايا سرطان الرئة.
ويعتمد فحص ddTRAP علي نفس النظرية التي تستند اليها المقايسة الخاصة بالفخ. يتم الحصول علي لست] الخلية من قبل الخلايا الليسينجه في المنظفات غير الايونيه (NP-40) تحلل العازلة للحفاظ علي نشاط الانزيم ومن ثم استخدامها لأداء رد فعل تمديد التيلوميراز من "TS" الركيزة/التمهيدي. الجدة من ddTRAP تعتمد علي تشكيل قطرات قبل PCR. ويتيح تقسيم العينة إلى قطرات الفحص للحصول علي كميه مطلقه من نشاط التيلوميراز لكل خليه.
تم قياس نشاط التيلوميراز في خطوط خلايا سرطان الرئة ، باستخدام ddTRAP. واحده من القيود الرئيسية لفحص فخ المستندة إلى هلام هو عدد العينات التي يمكن معالجتها في كل مره. معظم أمشاط هلام يمكن ان تستوعب سوي ما يصل إلى 20 الآبار/العينات. وفي المقابل ، يمكن لل ddTRAP تشغيل ما يصل إلى 96 عينات في كل مره ، مما يزيد بشكل كبير من عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد. لقد قمنا بتهدئة نشاط التيلوميراز في ثمانيه خطوط خلوية. والاهم من ذلك ، قمنا بتشغيل كل تفاعل تمديد التيلوميراز في ثلاثي الفوسفات البيولوجي لما مجموعه 24 تفاعلا للتمديد. ثم كنا قادرين علي تشغيل كل رد فعل التمديد كثلاث نسخ متماثلة التقنية ل PCR لما مجموعه 72 عينات علي لوحه ddPCR. وعلاوة علي ذلك ، يوفر فحص ddTRAP نتائج قابله للتكرار مع سيره ذاتية (معامل التباين) بنسبه 5.1 في المائة لمكافئات الخلايا 100 والسيرة الذاتية اليومية التي تبلغ 8.61 في المائة لمكافئات الخلايا 100. Interday واليومية تمثل البيولوجية ونسخ متماثلة تشغيل علي لوحين مختلفين أو لوحه واحده ، علي التوالي ، علي الخلية هيلا لست]11. إذا تمت معالجه عينات 72 في فخ التقليدية أو اي فحص القائم علي هلام أخرى ، فانه يتطلب الكثير من الأيدي العملية في الوقت المناسب. وهذا يؤدي إلى ارتفاع تكاليف الكواشف ، والوقت الأكثر قيمه اللازمة من الموظفين/الطلاب/المتدربين ، وارتفاع الجل إلى هلام التقلب ، وعدم وجود استنساخ بين المستخدمين والمختبرات. القدرة علي تشغيل ونسخ متماثلة بشكل موثوق وبسهوله في ddTRAP هو تحسن كبير علي الاختبارات القائمة علي هلام ويسمح العديد من العينات التي يمكن معالجتها بكفاءة ، مما يساعد في التحليل الإحصائي للبيانات.
وأخيرا ، فان التباين الأقل بين العينات بشكل عام في ddTRAP وامكانيه تنفيذ النسخ المتماثلة الضرورية يسمح للمستخدمين بمراقبه اقل من التغييرات المزدوجة بين العينات. والقيد الرئيسي لمعظم الفحوصات القائمة علي الجل هو عدم التحديد الكمي المناسب. هنا ، باستخدام ddTRAP ، يمكننا الكشف عن الاختلافات خفيه بين مختلف خطوط سرطان الرئة. يمكن ان تكون الاختلافات الدقيقة حاسمه عندما يتعلق الأمر بمقارنه الادويه التي تستهدف نشاط التيلوميراز وتقرير ما إذا كان يجب المضي قدما مع مركبات جزيئات صغيره من الشاشات عاليه الانتاجيه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بمصادر التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R00-CA197672-01A1). كانت الخلايا الصغيرة لسرطان الرئة (SHP77 و H82) هديه سخية من المركز الطبي لجنوب غرب البلاد ، جون مينا وعدي غازدار.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
