Summary
Vi konverterade framgångs rikt standarden telomer upprepa amplifiering protokoll (trap) assay som skall användas i droplet Digital polymeras kedje reaktioner. Denna nya analys, som kallas ddtrap, är känsligare och kvantitativa, vilket möjliggör bättre detektion och statistisk analys av telomeras aktivitet inom olika mänskliga celler.
Abstract
Den telomer upprepa amplifiering protokoll (trap) är den mest använda analysen för att upptäcka telomeras aktivitet inom ett givet ett prov. Polymeras kedje reaktion (PCR)-baserad metod möjliggör robusta mätningar av enzym aktivitet från de flesta celllysater. Den gel-baserade trap med fluorescensmarkerade märkt primers begränsar prov genom strömning, och förmågan att upptäcka skillnader i prover är begränsad till två gånger eller större förändringar i enzym aktivitet. Droplet Digital TRAP, ddTRAP, är ett mycket känsligt tillvägagångs sätt som har modifierats från den traditionella TRAP-analysen, vilket gör det möjligt för användaren att utföra en robust analys på 96 prover per körning och få absolut kvantifiering av DNA (Telomerase extension produkter ) inom varje PCR-ingång. Därför övervinner den nyutvecklade ddTRAP-analysen begränsningarna hos den traditionella gel-baserade TRAP-analysen och ger en mer effektiv, noggrann och kvantitativ metod för att mäta telomerasaktiviteten inom laboratorie-och kliniska miljöer.
Introduction
Telomerer är dynamiska DNA-proteinkomplex i ändarna av linjära kromosomer. Humana telomerer består av en matris av 5 '-TTAGGGn hexameric repetitioner som varierar i längd mellan 12-15 kilobases (KB) vid födseln1. Human telomeras, det ribonukleoprotein-enzym som upprätthåller telomererna, identifierades först i HeLa celllysat (cancer cellinjen)2. Tillsammans spelar telomerer och telomeras en viktig roll i ett spektrum av biologiska processer såsom genomskydd, gen reglering och cancer cells odödlighet3,4,5,6.
Human telomeras består huvudsakligen av två viktiga komponenter, nämligen telomeras omvänt transkriptas och telomeras RNA (hTERT respektive hTERC). Proteinet subunit, hTERT, är katalytiskt aktiv omvänt transkriptase komponenten i telomeras enzymet. RNA-mallen, hTERC, ger telomeras med mallen för att utvidga och/eller underhålla telomerer. De flesta humana somatiska vävnader har ingen detekterbar telomerasaktivitet. Oförmågan hos DNA-polymeras att förlänga slutet av den släpar strängen av DNA tillsammans med avsaknaden av telomeras leder till en progressiv förkortning av telomerer efter varje runda av cellulära Division. Dessa fenomen leder till telomerförkortning i de flesta somatiska celler tills de når en kritiskt förkortad längd, varvid cellerna kommer in i ett tillstånd av replikativ senescens. Det maximala antalet gånger en cell kan dela styrs av dess telomerlängd och detta block till fortsatt cell delning tros förhindra progression till onkogenes7. Cancer celler kan övervinna telomer-inducerad replikativ senescens och fortsätta att förökar sig genom att använda telomeras att bibehålla sina telomerer. Cirka 90% av cancer aktivera telomeras, vilket gör telomeras aktivitet kritiskt viktigt i både cancer upptäckt och behandling.
Utvecklingen av TRAP-analysen på 1990-talet bidrog till identifieringen av de nödvändiga komponenterna i telomerasenzymet, liksom för mätning av telomeras i ett brett spektrum av celler och vävnader, både normala och cancerösa. Den ursprungliga gel-baserade PCR-test som används radioaktivt märkt DNA-substrat för att upptäcka telomeras aktivitet. I 2006, var analysen anpassas till en icke-radioaktiv form med fluorescensmarkerade märkta substrat8,9. Genom att använda fluorescensmarkerade märkt substrat, användare kunde visualisera telomeras förlängningen produkter som band på en gel genom att utsätta den för rätt excitation våglängd. Känsligheten hos trap-analysen och dess förmåga att detektera telomerasaktivitet i råa celllysater har gjort detta test till den mest använda metoden för att upptäcka telomeras-aktiviteter. TRAP-analysen har dock begränsningar. Analysen är gel-baserad, vilket gör det svårt att utföra de nödvändiga replikaten i måttlig till hög genom strömning studier, och därför är korrekt statistisk analys sällan uppnås. Dessutom är den gelbaserade analysen svår att kvantifiera på grund av oförmågan att upptäcka mindre än dubbla skillnader i telomerasaktivitet mellan proverna. Att övervinna dessa två begränsningar är avgörande för enzymatiska aktivitet analyser såsom trap att flytta till kliniska eller industri inställningar för detektion av telomeras aktivitet i patientprover eller studier läkemedels design.
Digital PCR utvecklades initialt i 1999 som ett sätt att omvandla den exponentiella och analoga karaktären av PCR till en linjär och digital analys10. Droplet Digital PCR (ddPCR) är den senaste innovationen av den ursprungliga digitala PCR-metodiken. Droplet Digital PCR kom omkring med tillkomsten av avancerade mikrofluidik och olja-i-vatten emulsion kemi för att tillförlitligt generera stabila och lika stora droppar. Till skillnad från gelbaserad och även kvantitativ PCR (qPCR) genererar ddPCR absolut kvantifiering av indatamaterialet. Nyckeln till ddPCR är att generera ~ 20 000 individuella reaktioner genom att partitionera proverna i droppar. Efter punkt PCR skannar DROPP läsaren varje droppe i en flödescytometerliknande mode, räknar, dimensionering och registrerar närvaron eller frånvaron av fluorescens i varje enskild droppe (dvs. frånvaro eller förekomst av PCR-amplikoner i varje droplet). Sedan, med Poissons fördelning, beräknas ingångs molekylerna utifrån förhållandet mellan positiva droppar och det totala antalet droppar. Detta tal representerar en uppskattning av antalet ingångs molekyler i varje PCR. Dessutom är ddPCR utförs och analyseras på en 96-brunn platta som gör det möjligt för användaren att köra många prover, samt utföra biologiska och tekniska replikat för ordentlig statistisk analys. Som ett resultat har vi kombinerat den kraftfulla kvantifiering och måttlig-genomflöde karaktär ddPCR med TRAP-analysen för att utveckla ddTRAP-analysen11. Denna analys är utformad för användare att studera och kraftfullt kvantifiera absolut telomeras aktivitet från biologiska prover11,12. Känsligheten hos ddTRAP gör det möjligt att kvantifiera telomerasaktiviteten från begränsade och värdefulla prover, inklusive encellig mätning. Dessutom, användare kan också studera effekterna av telomeras manipulationer och/eller droger med absolut kvantifiering av mindre än två förändringar (~ 50% skillnader). Den ddTRAP är den naturliga utvecklingen av TRAP-analysen i den digitala och högre genom strömning karaktär moderna laboratorie experiment och kliniska inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelse och förvaring av buffert
- Bered 50 mL 1x lager RNase-/DNase-fri NP-40-lyseringsbuffert (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1mm etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 1% [Vol/Vol] NP-40, 10% [Vol/Vol] glycerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-merkaptoetanol och 0,1 mm 4- benzensulfonylfluorid hydroklorid (AEBSF)). Denna buffert kan vara Ali citerad och lagras vid-20 ° c för framtida bruk. Undvik frys/Tina cykler för att få en optimal Lys av celler.
- Förbered 50 mL 10x lager RNase-/DNase-fri TRAP extension buffert (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm KCl, 0,5% [Vol/Vol] Tween 20, och 10 mm etylenglykol-bis (β-aminoetyleter)-N, N, n ′, n′-tetraättiksyra (EGTA)). Denna buffert kan aliciteras i 1 mL Ali kvoter och lagras vid-20 ° c för framtida bruk.
2. celllys
-
Beredning av cellerna
- Tina en fryst alikvot av NP-40 lyseringsbuffert. Efter tinat, placera lyseringsbufferten på isen. Tillsätt Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF-proteashämmare) till NP-40-lysbufferten för att nå en slutlig koncentration på 0,2 mM.
Anmärkning: detta bör göras omedelbart före lyseringslösning cellerna. - Ta bort överflödig vätska från de insamlade cell pelletar för att säkerställa en torr cell pellet. Observera att cell pellets, vare sig den är nyinsamlad eller tidigare fryst (-80 ° c eller blinkar fryst i flytande N2), inte får innehålla överblivna lösningar från tidigare centrifugationer eftersom dessa lösningar kan störa nedströms procedurer.
- Växa, samla in och frysa både Telomerase-positiva och Telomerase-negativa cellinjer (BJ fibroblaster, IMR-90 eller U2OS) för att använda dem som positiva och negativa kontroller. Använd ny kontroll cellysater varje gång analysen utförs för att säkerställa analysen reproducerbarhet.
Obs: det rekommenderas att en stor kultur av Telomerase-negativa celler odlas och aliciteras före frysning för att ta bort alla vävnads-kulturrelaterade artefakter som kan införas under den långsiktiga kulturen av cellinjer för att säkerställa reproducerbara resultat av det negativa kontroll provet. - Placera cell pellets på isen. Om cellerna frystes, låt dem Tina kort på isen.
Obs: typiska cell pellets storlekar för ddTRAP är mellan 500 000 och 1 000 000 celler. Mindre cell pellets kan också användas om det behövs, men cell numret måste/helst bör vara känt. DdTRAP kan också utföras baserat på proteintillförsel med hjälp av en BCA-proteinanalys (indata brukar vara 1 μg).
- Tina en fryst alikvot av NP-40 lyseringsbuffert. Efter tinat, placera lyseringsbufferten på isen. Tillsätt Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF-proteashämmare) till NP-40-lysbufferten för att nå en slutlig koncentration på 0,2 mM.
-
Lysing av cellerna
- Lyse cellerna i NP-40-lysbufferten. Upprätthålla en cellekvivalens för 25 000 celler/μL buffert. Till exempel, lysera en pellet (som innehåller 1 000 000 celler) i 40 μL NP-40 lyseringsbuffert. Försiktigt Pipettera den lysate upp och ner för att bryta öppna cellerna. Försök att undvika att göra bubblor.
- Låt cellerna lysera på is i 30 min. se till att försiktigt virvla lysat för att förhindra kluster av cell skräp bildas. Detta kan göras var 10 min och är tänkt att hålla lysate en homogeniserad blandning.
- Späd cellen lysate (25 000 celler/μL) 1:20 i NP-40 lyseringsbuffert, vilket gör den nya cellen likvärdighet 1 250 celler/μL. Späd till exempel 5 μL celllysat till 95 μL lyseringsbuffert.
3. Telomerase förlängning reaktion
- Förbered en mastermix (tabell 1) för telomeras Förlängnings reaktion (per reaktion).
Obs: det är bäst att förbereda Förlängnings reaktionen Master mix under cell lysis och förvara den på is.- Pipet 48 μL av Förlängnings ledar blandningen i varje PCR-rör.
- Tillsätt 2 μL av det utspädda (1 250 celler/μL) lysat till Förlängnings reaktionen. Den totala volymen bör nu vara 50 μL med en slutlig cellekvivalens på 50 celler/μL.
- Utför telomeras-förlängningsreaktionen (tabell 2).
- Förvara telomeras-förlängningsprodukterna vid 4 ° c i upp till 3 – 5 dagar. Det är dock optimalt att använda Förlängnings produkterna inom de första 24 h.
4. droplet Digital PCR-inställning
- Förbered en mastermix (tabell 3) för ddtrap (per reaktion).
Anmärkning: när reagenserna är i rums temperatur, placera dem inte eller Mastermixen på is. Att placera blandningen på isen kan öka viskositeten och leda till dålig DROPP bildning. DNA-polymerasen i ddPCR-supermixen är en varm start och bör vara stabil vid rums temperatur. DdPCR-superblandningen kan förvaras vid 4 ° c efter en första Tina från-20 ° c.- Pipet 19,8 μL av ddPCR-masterblandningen i varje PCR-rör.
- Tillsätt 2,2 μL av Förlängnings reaktionen till varje tub. Observera att den totala volymen nu ska vara 22 μL.
Anmärkning: den totala mängden prov som behövs för en ddTRAP är 20 μL (cellekvivalens för 100 celler). Den extra volymen är en försiktighets åtgärd för Pipettera fel eller prov förlust.
- Ställ in DROPP produktions kassetten.
Obs: patronen innehåller tre olika kolumner av brunnar som är märkta.- Fyll på 20 μL av reaktionen som förberetts enligt steg 4.1.2 i prov brunnen (Mittbrunnen) i cylinderampullen. Undvik bubblor vid pipettering av provet.
Obs: om det finns bubblor, Knacka försiktigt på sidan av patronen så att dessa bubblor kommer till toppen av lösningen. - Fyll på 70 μL av DROPP produktions oljan i olje brunnen (vänster brunn).
Obs: för att undvika kontaminering, Använd strikt en separat uppsättning pipetter och tips för steg för att generera ddPCR-droplet. Ordningsföljden för laddning av patronen är viktig. Provet måste lastas före lastning olja som olja är tyngre och kommer att fylla mikroflödessystem kamrarna och leda till dålig droplet formation. Det minsta antalet prover som kan köras är åtta. Alla brunnar i patronen måste fyllas med provet som en tom brunn kommer att leda till ett stopp i droplet generationen från droplet-generatorn. Om det inte finns tillräckligt med prover för att lasta alla åtta brunnar i en cylinderampull, kan 20 μL av ddTRAP Master Mix (steg 4,1) läsas in i de återstående patronerna. - Fäst packningen på plats genom att tjudra den till ändarna av patronen.
Obs: avsaknaden eller felaktig placering av packningen kommer att förhindra generatorn från att generera droppar. - Placera den laddade och monterade patronen i DROPP generatorn.
Obs: patronen känns igen av en magnet i generatorn, som kommer att informera användaren när patronen är placerad ordentligt.
- Fyll på 20 μL av reaktionen som förberetts enligt steg 4.1.2 i prov brunnen (Mittbrunnen) i cylinderampullen. Undvik bubblor vid pipettering av provet.
- Ta bort patronen när dropparna genereras och cykeln är klar (~ 60-90 s).
- Ta försiktigt bort packningen från patronen. Pipet de nygenererade dropparna (höger brunn), med hjälp av en flerkanalspipett, i en 96-väl PCR-platta.
Anmärkning: den ungefärliga volymen för den nygenererade dropletemulsionen ska vara 40 – 43 μL. - Värm tätningen plattan med aluminiumfolie PCR plattan tätningar när alla proverna lastas i 96-well plattan för att förhindra avdunstning under PCR-steg.
- Ta försiktigt bort packningen från patronen. Pipet de nygenererade dropparna (höger brunn), med hjälp av en flerkanalspipett, i en 96-väl PCR-platta.
- Sätt in 96-brunnen i termocykleren och utför följande PCR-reaktion (tabell 4).
Obs: alla ramp hastigheter mellan temperatur steg måste ställas in på 2,5 ° c/s för att korrekt värma reaktionerna.
5. Påvisande av telomeras Förlängnings produkter
- Ladda 96-brunnen plattan i droplet läsaren.
Obs: se till att rikta plattan ordentligt så att a1 -provet överensstämmer med innehavarens.- Öppna program varan som är associerad med droplet-läsaren. Dubbelklicka på den första brunnen a1 för att öppna prov/brunn redaktör skärmen.
- Klicka på experiment och välj ABS i den nedrullningsbara menyn.
Anm.: experiment definierar den typ av analys som ska användas (dvs. absolut kvantifiering eller analys av gen kopie nummer). ABS står för absolut kvantifiering. - Välj QX200 ddPCR Evagreen supermix för att säkerställa att rätt detektions metod används av läsaren. Klicka på Verkställ i den nedre högra sidan av brunnen redaktör skärmen för att spara användardefinierade inställningar till alla de markerade brunnar.
Obs: supermix definierar vilken typ av PCR-mix och detektions kemi som ska läsas av läsaren. - Klicka på mål i brunnen redaktör skärmen på program varan för att definiera provet.
- Definiera typ av prov genom att klicka på den nedrullningsbara menyn mål och välja antingen okänd, referenseller NTC (ingen mallkontroll).
Anmärkning: okänd skulle hänvisa till ett experimentellt prov, referens kan vara ett kontroll prov av känd telomerasaktivitet, och ett NTC är en kritisk kontroll för bestämning av analysens giltighet i form av förorening och bakgrunds signalen. - Märk alla prover i avsnittet exempel namn och klicka på Verkställ för att se till att de markerade brunnarna redige ras på rätt sätt.
- Klicka på kör för att köra/läsa plattan. Välj antingen kolumner eller rader på skärmen kör alternativ när du uppmanas att informera maskinen om orienteringen plattan ska läsas in.
6. data analys
- Bestäm antalet accepterade droppar för varje prov genom att klicka på enskilda brunnar. Dubbelklicka på de enskilda brunnarna eller kolumn-/radrubrikerna för att visa och analysera exempel data.
Anmärkning: de viktigaste kriterierna för huruvida man ska gå vidare med analysen av ett visst prov är antalet "accepterade droppar". För ddTRAP är prover med 10 000 eller fler accepterade droppar giltiga för vidare analys. Data kan ges till användaren i många format, inklusive en. csv-tabell,. jpg bilder, histogram, etc. Det finns många tillgängliga resurser för den djupgående analysen av ddpcr-data, inklusive ddtrap11,13. Dessa resurser erbjuder en guide föratt analysera ddtrap-data, från att välja tröskelvärden11,13 till att välja prover för ytterligare analys11,13, identifiera falska positiva identifieringar och negativ13, och allmän fel sökning13. - Markera de brunnar som representerar prov replikat och NTC-prover. Analysera proverna i jämförelse med antingen NTC eller negativa kontroll linjer, till exempel BJ-celler (som anges ovan i steg 2.1.2).
- Ange tröskelvärdet för proverna manuellt genom att klicka på ikonen för att ange tröskelvärden nere till vänster på skärmen. Ange tröskelvärden för varje enskild brunn eller för flera brunnar i taget (rekommenderas).
Anmärkning: om bakgrunden upptäcks i NTC, kan den subtraveras från alla andra prover för att "normalisera" signalen och se till att endast den sanna positiva signalen analyseras. NTC-värden är vanligt vis i intervallet 0,2 – 1 molekyl/μL för NP-40-lysbuffertsystemet. Andra buffertsystem och komponenter måste testas (till exempel CHAPS buffertar).
- Ange tröskelvärdet för proverna manuellt genom att klicka på ikonen för att ange tröskelvärden nere till vänster på skärmen. Ange tröskelvärden för varje enskild brunn eller för flera brunnar i taget (rekommenderas).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av ddTRAP mättes telomerasaktiviteten i en cell panel bestående av följande cellinjer (figur 1): Icke-småcellig lung cancer (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 och H2887), småcellig lung cancer (H82 och SHP77) och telomeras-negativa fibroblaster (BJ). 1 000 000 cell pellets lyserades i NP-40 buffert, och telomeras förlängning reaktioner utfördes i biologiska triplicates. En vanlig och starkt rekommenderad negativ kontroll är "NTC", ingen mallkontroll. Detta prov genereras genom tillsats av NP-40 lyseringsbuffert (2 μL) till telomeras Förlängnings reaktion och fortsätter med Förlängnings produkterna på ett identiskt sätt till andra prover som innehåller faktiskt celllysat. Detta exempel tillåter användaren att subtrahera bakgrunds signalen, om någon, för att bättre kvantifiera telomeras aktivitet. Även om det inte visas i denna siffra, det är också möjligt att värma inaktivera lysat vid 95 ° C för 5 min före telomeras förlängning reaktion som en annan negativ kontroll. Denna negativa kontroll är att föredra om cell/Sample överflöd är inte ett problem.
Genom att mäta fluorescensintensiteten hos varje enskild droppe i DROPP-emulsionen kunde DROPP läsaren uppskatta koncentrationen av ingående molekyler (molekyler/mikroliter) med Poissonfördelningen (figur 1a). När det gäller ddtrap, dessa ingående molekyler var telomeras Förlängnings produkter. Mekanismen för ddtrap-analysen var följande: telomeras utökade TS-substratet. Dessa utökade substrat fungerade som PCR-mallarna i ddPCR. Kvantifiering av PCR-amplifierade substrat gav en representation av telomeras enzymatisk aktivitet inom en given cellinjen. Varje droppe var plottad som visas i figur 1a. Inställning av tröskeln för en ddTRAP kan vara subjektiv; men med rätt negativa kontroller, kan användaren enkelt göra det. I exemplet som visas i figur 1afastställdes ett tröskelvärde för alla tre biologiska REPLIKAT för SHP77, H2887 och NTC. Positiva droppar hade en fluorescensintensitet runt 6 000 fluorescensamplitud (FA) och bildade en tydlig population upptill och separerad från negativa droppar runt 1 100 FA. Tröskelvärdet kan därför anges till ~ 2 000 FA i det här experimentet.
När uppgifterna samlades in och exporterades var det möjligt att beräkna de totala tilläggs produkterna för telomeras per cell ekvivalent mellan alla proverna (figur 1b). Signalen från varje brunn var en absolut koncentration (molekyler/mikroliter). Genom att multiplicera koncentrationen med 20 (ingångs volymen för provet i ddPCR-patroner) kan användaren få det totala antalet molekyler. Detta nummer kan sedan delas med den kända cell motsvarigheten (i vårt utförande av ddTRAP, vi använde 100 celler). Detta slutliga värde är i enheter av telomeras Förlängnings produkter per cell ekvivalent som visas på y-axeln.
Figur 1: telomerasaktivitet i en lung cancer panel. (A) 1d-amplituden för droplet-fluorescensintensiteten (fluorescensamplitud) för SHP77, H2887 och NTC. Brunnar för SHP77, H2887 och NTC valdes ut och ett manuellt tröskelvärde fastställdes till 2 000 FA. Btelomerasaktiviteten beräknades från den uppmätta koncentrationen av de nukleinsyror som upptäcktes efter PCR och plottas för att jämföra telomerasaktiviteten i lung cancer linjer. FA = enheter för fluorescensamplitud. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mätningen av telomeras aktivitet är kritisk till en uppsjö av forsknings ämnen inklusive, men inte begränsat till, cancer, telomerbiologi, åldrande, regenerativ medicin, och strukturbaserad läkemedels design. Telomerase RNPs är låg riklig, även i cancer celler, vilket gör upptäckten och studiet av detta enzym utmanande. I detta dokument beskrev vi steg-för-steg-procedurer för den nyutvecklade ddTRAP-analysen för att kraftfullt kvantifiera telomerasaktiviteten i cellerna. Genom att kombinera den traditionella telomeras förlängning reaktion med ddpcr, kunde vi kvantitativt identifiera telomeras aktivitet (telomeras-utökade produkter) i lung cancer celler.
DdTRAP-analysen förlitar sig på samma teori som TRAP-analysen. Celllysater erhålls genom att lyseringslösning celler i en Nonjonaktivt rengörings medel (NP-40) lysis buffert för att bibehålla enzym aktivitet och sedan används för att utföra en telomeras förlängning reaktion av "TS" substrat/primer. Det nya i ddTRAP förlitar sig på bildandet av droppar före PCR. Uppdelningen av provet i droppar gör det möjligt för analysen att uppnå absolut kvantifiering av telomerasaktiviteten per cell.
Telomerasaktiviteten mättes i lung cancer cellinjer, med hjälp av ddTRAP. En av de viktigaste begränsningarna i den gelbaserade TRAP-analysen är antalet prover som kan bearbetas åt gången. De flesta gel kammar kan endast rymma upp till 20 brunnar/prover. Däremot kan ddTRAP köra upp till 96 prover i taget, vilket avsevärt ökar antalet prover som kan bearbetas på en gång. Vi analyseras telomeras aktivitet i åtta cellinjer. Viktigast av allt, vi körde varje telomeras förlängning reaktion i biologiska tre exemplar för totalt 24 förlängning reaktioner. Vi kunde sedan köra varje Förlängnings reaktion som tre tekniska replikat för PCR för totalt 72 prover på ddPCR plattan. Dessutom ger ddtrap-analysen reproducerbara resultat med en utskick CV (variationskoefficient) på 5,1% för 100 cell ekvivalenter och en Intradagskredit på 8,61% för 100 cell ekvivalenter. Interday och intradagskredit representerar biologiska replikat som körs på två olika plattor eller samma platta, respektive, på hela cell cellysater11. Om 72 prover behandlades i den traditionella TRAP eller någon annan gel-baserad analys, skulle det kräva mycket mer hands-on tid. Detta leder till högre kostnader för reagenser, mer värdefull tid som behövs från anställda/studenter/praktikanter, en högre gel-till-gel variation, och en brist på reproducerbarhet mellan användare och laboratorier. Förmågan att tillförlitligt och enkelt köra replikat i ddTRAP är en dramatisk förbättring jämfört med gel-baserade analyser och tillåter många fler prover som skall bearbetas effektivt, vilket stöd i den statistiska analysen av data.
Slutligen, mindre variation mellan proverna i allmänhet i ddTRAP och möjligheten att utföra de nödvändiga replikaten gör det möjligt för användare att iaktta mindre än två ändringar mellan proverna. Den största begränsningen av de flesta gel-baserade analyser är bristen på ordentlig kvantifiering. Här, med hjälp av ddTRAP, vi kan upptäcka de subtila skillnaderna mellan de olika lung cancer linjer. De subtila skillnaderna kan vara avgörande när det gäller att jämföra läkemedel inriktade telomeras aktivitet och besluta om att gå vidare med små molekyl föreningar från hög genom strömning skärmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja erkänna finansiering källor från de nationella instituten för hälsa (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Små cell lung cancer linjer (SHP77 och H82) var en generös gåva från DRS. John Minna och ADI Gazdar från UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
