Summary
我々は正常に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応に採用される標準的なテロメア反復増幅プロトコル (TRAP) アッセイを変換しました。DdTRAP と呼ばれるこの新しいアッセイは、より高感度で定量的であり、様々なヒト細胞内のテロメラーゼ活性のより良い検出および統計分析を可能にします。
Abstract
テロメア反復増幅プロトコル (TRAP) は、所与のサンプル内のテロメラーゼ活性を検出するために最も広く使用されているアッセイです。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法は、ほとんどの細胞溶解物からの酵素活性のロバストな測定を可能にします。蛍光標識されたプライマーを用いたゲルベースのトラップはサンプルのスループットを制限し、サンプルの差を検出する能力は酵素活性の2倍以上の変化に制限される。液滴のデジタルトラップ、ddTRAP は従来のトラップの試金から変更された非常に敏感なアプローチであり、ユーザーが実行ごとの96サンプルの強い分析を行い、DNA の絶対定量化を得ることを可能にする (テロメラーゼの延長プロダクト) は、各 PCR 内で入力します。従って、新しく開発された ddTRAP の試金は従来のゲルベースのトラップの試金の限界を克服し、実験室および臨床設定内のテロメラーゼの活動を測定するためにより有効で、正確な、量的なアプローチを提供する。
Introduction
テロメアは、線状染色体の末端にある動的な DNA-タンパク質複合体です。ヒトテロメアは、出生1で 12-15 キロベース (kb) の長さが異なる 5 '-TTAGGGn hexameric の繰り返しの配列で構成されています。ヒトテロメラーゼは、テロメアを維持する ribonucleoprotein 酵素を、HeLa 細胞溶解物 (癌細胞株)2で最初に同定した。共に、テロメアとテロメラーゼは、ゲノム保護、遺伝子調節、および癌細胞不滅性3、4、5、6などの生物学的プロセスのスペクトルにおいて主要な役割を果たしています。
ヒトテロメラーゼは主に、テロメラーゼ逆転写酵素とテロメラーゼ RNA (hTERT および hTERC) の2つの主要成分から構成されています。タンパク質サブユニットは、hTERT、テロメラーゼ酵素の触媒活性逆転写酵素成分である。RNA テンプレート、hTERC は、テロメアを拡張および/または維持するためのテンプレートをテロメラーゼに提供する。ほとんどのヒト体細胞組織は、検出可能なテロメラーゼ活性を有しない。DNA ポリメラーゼが不足している DNA の末端を広げることができないことは、テロメラーゼの欠如とともに、細胞分裂の毎ラウンド後のテロメアの漸進的短縮につながります。これらの現象は、ほとんどの体細胞において、非常に短い長さに達するまでテロメア短縮をもたらし、それによって細胞は複製老化の状態に入る。細胞が分裂できる最大回数はそのテロメア長によって決まり、このブロックはもとづき7への進行を防ぐと考えられています。がん細胞はテロメア誘発複製の老化を克服することができ、テロメラーゼを利用してテロメアを維持することによって増殖を続けています。癌の約 90% がテロメラーゼを活性化し、癌の検出と治療の両方においてテロメラーゼ活性を極めて重要なものにします。
1990年代の TRAP アッセイの開発は、テロメラーゼ酵素の必要な成分の同定、ならびに正常および癌性の両方の細胞および組織の広い範囲におけるテロメラーゼの測定に役立った。元のゲルベース PCR アッセイは、テロメラーゼの活性を検出するために放射能標識された DNA 基質を使用しました。2006では、アッセイは、蛍光標識された基材8、9を用いて非放射性形態に適応した。蛍光標識された基質を使用することにより、ユーザーは正しい励起波長に曝露することによってテロメラーゼ伸長製品をゲル上のバンドとして可視化することができました。トラップアッセイの感度と、粗細胞溶解物中のテロメラーゼ活性を検出する能力は、このアッセイをテロメラーゼ活性検出に最も広く使用されている方法にしました。しかし、TRAP アッセイには限界があります。このアッセイはゲルベースであるため、適度な高スループットの試験では必要とされる反復を行うことが困難であり、適切な統計分析はほとんど達成されません。さらに、ゲルベースのアッセイは、サンプル間のテロメラーゼ活性の2倍未満の差を検出できないため、確実に定量化することが困難である。これら2つの制限を克服することは、患者のサンプルまたは薬物設計研究におけるテロメラーゼの活性を検出するための臨床または業界の設定に移動するトラップなどの酵素活性アッセイにとって重要である。
デジタル PCR は、PCR の指数的およびアナログ的性質を線形およびデジタルアッセイ10に変換する手段として、1999年に最初に開発されました。液滴デジタル PCR (ddPCR) は、元のデジタル PCR の方法論の最新の技術革新です。液滴デジタル PCR は確実に安定した、同じ大きさの液滴を生成するために、高度なマイクロ流体と水中油エマルジョン化学の出現によって来ました。ゲルベースであっても定量 PCR (qPCR) とは異なり、ddPCR は入力材料の絶対定量を生成します。DdPCR の鍵は、サンプルを液滴に分割することによって、〜2万の個々の反応を生成することです。エンドポイント PCR に続いて、液滴読み取り装置は、フローサイトメーターのような方法で各液滴をスキャンし、カウント、サイジング、および個々の液滴における蛍光の有無 (すなわち、各液滴における PCR アンプリコンの存在または不在) を記録する。次いで、ポアソン分布を用いて、液滴の総数に対する正の液滴の比率に基づいて入力分子が推定される。この数値は、各 PCR における入力分子数の推定値を表します。さらに、ddPCR は、ユーザーが多くのサンプルを実行することを可能にし、適切な統計分析のために生物学的および技術的な複製を行うことができる96ウェルプレート上で実行され、分析します。その結果、ddPCR の強力な定量と中程度のスループットの性質をトラップアッセイと組み合わせて、ddTRAP アッセイ11を開発しました。このアッセイは、生物学的試料11,12からの絶対的なテロメラーゼ活性を研究し、確実に定量化するためにユーザが設計されています。DdTRAP の感受性は単一細胞の測定を含む限られた、貴重なサンプルからのテロメラーゼの活動の定量化を可能にする。さらに, ユーザーは、2倍未満の変化 (〜 50% の差) の絶対定量とテロメラーゼの操作および/または薬物の効果を研究することができます。DdTRAP は現代実験室の実験および臨床設定のデジタルおよびより高い効率の性質にトラップの試金の自然な進化である。
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Protocol
1. バッファの準備と保存
- 50の1x ストック RNase-/DNase-free NP-40 溶解バッファー (10 mM トリス-HCl [pH 8.0]、1 mM MgCl2、1 mm ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)、1% [vol/VOL] NP-40、10%(vol/vol] グリセロール、150 mm NaCl、5 mm β-メルカプトエタノール、および 0.1 mm 4-benzenesulfonyl 塩酸塩 (AEBSF))。このバッファは、将来の使用のために-20 ° c で等分および保存することができます。細胞の最適な溶解を得るために、凍結/解凍サイクルを避けてください。
- 10倍のストック RNase-/DNase-free トラップ拡張バッファー (200 mm MgCl-HCl [pH 8.0]、15 mm アミノエチルシステイン2、630 mM KCl、0.5% [vol/vol] トゥイーン20、および 10 mM エチレングリコール-ビス (β-エーテル)-n、n、n ′、N′-tetraacetic 酸 (EGTA)) を50準備します。この緩衝液を 1 mL アリコートに等分し、将来の使用のために-20 ° c で保存することができます。
2. 細胞溶解
-
細胞の調製
- 40溶解バッファーの冷凍アリコートを解凍します。解凍したら、溶解バッファーを氷上に置きます。40溶解バッファーに phenylmethylsulfonyl フッ化物 (PMSF プロテアーゼ阻害剤) を添加し、0.2 mM の最終濃度に達します。
注: これは、セルを溶解するする直前に行う必要があります。 - 収集した細胞ペレットから余分な液体を除去して、乾燥細胞ペレットを確保します。これらの溶液が下流の手順に干渉する可能性があるため、新たに採取された、または以前に凍結していた (-80 ° c または液体 N2のフラッシュ冷凍の) 細胞ペレットは、以前の centrifugations からの残留溶液を含まないようにしてください。
- それらをポジティブおよびネガティブコントロールとして使用するために、テロメラーゼ陽性およびテロメラーゼ陰性細胞株 (BJ 線維芽細胞、IMR-90 または U2OS) の両方を成長、収集、凍結します。アッセイの再現性を確保するために毎回新しい制御溶解液を使用します。
注意: テロメラーゼ陰性細胞の大規模な培養は、細胞株の長期培養中に導入されるかもしれない組織培養関連のアーティファクトを除去するために凍結する前に増殖させ、等分することをお勧めします。陰性対照サンプル。 - 細胞ペレットを氷上に置く。細胞が凍結していた場合は、氷の上で簡単に解凍することができます。
注: ddTRAP の典型的な細胞ペレットサイズは、50万と100万細胞の間にあります。より小さい細胞ペレットは、必要に応じて使用することもできるが、細胞数は、理想的には既知でなければならない。DdTRAP は、BCA タンパク質アッセイ (入力は通常1μ g) を使用してタンパク質入力に基づいて行うこともできます。
- 40溶解バッファーの冷凍アリコートを解凍します。解凍したら、溶解バッファーを氷上に置きます。40溶解バッファーに phenylmethylsulfonyl フッ化物 (PMSF プロテアーゼ阻害剤) を添加し、0.2 mM の最終濃度に達します。
-
細胞の溶解する
- 40溶解バッファー内のセルを溶解します。25000細胞/μ l のバッファーの細胞等価性を維持してください。例えば、溶解は40μ l の NP-40 溶解バッファーにペレット (100万細胞を含む) を含有する。セルを開くために、溶解液をそっと pipet ます。泡を作ることを避けるようにしてください。
- 細胞を氷上で30分溶解ことができるようにします。細胞デブリのクラスターが形成されないように、溶解液を優しく渦巻きしてください。これは、10分ごとに行うことができ、溶解液を均質化した混合物を維持することを意味します。
- 細胞溶解液 (25000 細胞/μ l) 1:20 を NP-40 溶解バッファーに希釈し、新しい細胞等価性1250細胞/μ l を作ります。例えば、5μ l の細胞溶解液を95μ l の溶解バッファーに希釈します。
3. テロメラーゼ伸長反応
- テロメラーゼ伸長反応 (反応ごと) のためのマスターミックス (表 1) を準備します。
注: 細胞溶解中に伸長反応マスターミックスを準備し、それを氷上に保管することをお勧めします。- Pipet 48 μ l の拡張マスターミックスを各 PCR チューブに混合します。
- 希釈した (1250 細胞/μ l) ライセートの2μ l を伸長反応に加える。総容積は今50細胞/μ l の最終的な細胞の等量の50μ l であるべきである。
- テロメラーゼ伸長反応を行う (表 2)。
- テロメラーゼ延長製品を4° c で 3 ~ 5 日間保管してください。ただし、最初の24時間以内に拡張製品を使用することが最適です。
4. 液滴デジタル PCR セットアップ
- DdTRAP (反応ごと) のマスターミックス (表 3) を準備します。
注: 試薬が室温になったら、それらまたはマスターミックスを氷上に置かないでください。氷の上にミックスを配置すると、粘度が上昇し、液滴の形成につながる可能性があります。DdPCR スーパーミックスの DNA ポリメラーゼはホットスタートであり、室温で安定している必要があります。DdPCR スーパーミックスは、初期解凍後-20 ° c で4° c で保存することができます。- Pipet 19.8 μ l の ddPCR マスターミックスを各 PCR チューブに挿入します。
- 各チューブに2.2 μ l の伸長反応を加えます。合計体積が22μ l であることに注意してください。
注: ddTRAP に必要なサンプルの総量は、20μ l (100 細胞の細胞当量) です。余分なボリュームは、pipet エラーまたはサンプルの損失のための予防措置です。
- 液滴生成カートリッジをセットアップします。
注: カートリッジには、ラベル付けされたウェルの3つの異なる列が含まれています。- ステップ4.1.2 に従って調製した反応の20μ l をカートリッジ内の試料ウェル (中段ウェル) にロードする。サンプルをピペッティングするときは、泡を避けてください。
注: 気泡がある場合は、カートリッジの側面を軽くタップして、これらの泡が溶液の上部に来るようにします。 - オイルウェルに70μ l の液滴発生油を負荷する (左よく)。
注: 汚染を避けるために、厳密に ddPCR 液滴生成ステップのためのピペットおよび先端の別のセットを使用してください。カートリッジのロード順序は重要です。油が重くなるにつれて試料を装填しなければならず、マイクロ流体チャンバを満たし、低液滴形成につながる。実行できるサンプルの最小数は8です。任意の空の井戸は、液滴発生器からの液滴発生で停止につながるように、カートリッジのすべてのウェルは、サンプルと一緒にロードする必要があります。カートリッジ内に8個のウェルをすべてロードするのに十分なサンプルがない場合は、ddTRAP マスター・ミックスの20μ l (ステップ 4.1) を残りのカートリッジにロードすることができます。 - ガスケットをカートリッジの端に固定して、取り付けます。
注: ガスケットの欠如または不適切な配置は、発電機が液滴を発生させるのを防ぎます。 - ロードされ、組み立てられたカートリッジをドロップレット・ジェネレーターに入れます。
注: カートリッジは発電機の磁石によって認識され、カートリッジが適切に配置されたときにユーザーに通知されます。
- ステップ4.1.2 に従って調製した反応の20μ l をカートリッジ内の試料ウェル (中段ウェル) にロードする。サンプルをピペッティングするときは、泡を避けてください。
- 液滴が生成され、サイクルが完了したら、カートリッジを取り外します (~ 60 ~ 90 秒)。
- カートリッジからガスケットをそっと取り外します。Pipet は、新たに生成された液滴 (右井戸) をマルチチャンネルピペットを使用して、96ウェル PCR プレートに挿入します。
注: 新たに生成された液滴エマルジョンのおおよその体積は、40〜43μ l でなければなりません。 - プレートをアルミ箔 PCR プレートシールで熱シールすると、PCR ステップ中の蒸発を防ぐために、すべてのサンプルが96プレートにロードされます。
- カートリッジからガスケットをそっと取り外します。Pipet は、新たに生成された液滴 (右井戸) をマルチチャンネルピペットを使用して、96ウェル PCR プレートに挿入します。
- 96-ウェルプレートを thermocycler にロードし、次の PCR 反応を行います (表 4)。
注: 適切に反応を加熱するためには、温度ステップ間のすべてのランプレートを2.5 ° c/s に設定する必要があります。
5. テロメラーゼ拡張製品の検出
- 96-ウェルプレートを液滴読み取り装置にロードします。
注: A1サンプルがホルダと一致するように、プレートの向きを正しくしてください。- ドロップレットリーダーに関連付けられているソフトウェアを開きます。最初のウェルA1をダブルクリックして、サンプル/ウェルエディタ画面を開きます。
- [実験] をクリックし、ドロップダウンメニューから [ ABS ] を選択します。
注:実験は、使用するアッセイの種類 (すなわち、絶対定量または遺伝子コピー数アッセイ) を定義します。ABSは絶対定量の略です。 - QX200 DdPCR Evagreen スーパーミックスを選択して、正しい検出方法がリーダーによって使用されていることを確認します。[ウェルエディタ] 画面の右下にある [適用] をクリックして、強調表示されているすべての井戸にユーザー定義の設定を保存します。
注:スーパーミックスは、読者が読み取る PCR ミックスと検出化学のタイプを定義します。 - サンプルを定義するために、ソフトウェアのウェルエディタ画面でターゲットをクリックしてください。
- [ターゲット] ドロップダウンメニューをクリックし、[不明]、[参照]、または [ NTC ] (テンプレートなしのコントロール) のいずれかを選択して、サンプルのタイプを定義します。
注: Unknownは、実験的サンプルを参照し、参照は既知のテロメラーゼ活性の対照サンプルであり得る、およびNTCは、汚染という点でアッセイの妥当性を決定するための重要な制御であり、バックグラウンドシグナル。 - [サンプル名] セクションのすべてのサンプルにラベルを付け、[適用] をクリックして、ハイライト表示されたウェルを適切に編集します。
- プレートを実行/読み込みするには、[実行] をクリックします。プレートの読み取り方向を機械に通知するよう求められたら、[実行オプション] 画面で列または行のいずれかを選択します。
6. データ分析
- 個々の井戸をクリックして、各サンプルの受け入れられた液滴の数を決定します。個々のウェルまたは列/行ヘッダーをダブルクリックして、サンプルデータを表示および分析します。
注: 特定のサンプルの分析を進めるかどうかに関する最も重要な基準は、「受け入れられた液滴」の数です。DdTRAP の場合、1万以上の受け入れられた液滴を有するサンプルは、さらなる分析のために有効である。データは、.csv テーブル、.jpg イメージ、ヒストグラムなど、さまざまな形式でユーザーに提供できます。DdTRAP11、13などの ddPCR データの詳細な分析に使用できる多くのリソースがあります。これらのリソースは、閾値11,13の選択から、さらなる分析のためのサンプルの選択までの ddTRAP データを分析するためのガイド11,13, 偽陽性とネガ13を識別し、一般的なトラブルシューティング13. - サンプルの反復および NTC サンプルを表すウェルをハイライトします。BJ 細胞などの NTC コントロールラインまたはネガティブ制御線と比較してサンプルを分析します (ステップ2.1.2 の上に示しました)。
- 画面の左下にあるしきい値を設定するアイコンをクリックして、サンプルのしきい値を手動で設定します。個々のウェルまたは複数のウェルのしきい値を一度に設定します (推奨)。
注: 「NTC」でバックグラウンドが検出された場合は、他のすべてのサンプルから減算してシグナルを「正規化」し、真陽性シグナルのみが分析されるようにすることができます。NTC 値は、通常、NP-40 溶解バッファーシステムの 0.2-1 分子/μ l の範囲にあります。他のバッファー・システムおよびコンポーネントをテストする必要があります (例えば、バッファー)。
- 画面の左下にあるしきい値を設定するアイコンをクリックして、サンプルのしきい値を手動で設定します。個々のウェルまたは複数のウェルのしきい値を一度に設定します (推奨)。
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Representative Results
DdTRAP を用いて、テロメラーゼの活性を、以下の細胞株からなる細胞パネルで測定した (図 1): nonsmall 細胞肺癌 (H2882、H1299、Calu6、H920、A549、および H2887)、小細胞肺癌 (H82 および SHP77)、およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞 (BJ)。100万細胞ペレットを NP −40バッファーで溶解し、テロメラーゼ伸長反応を生物学的 triplicates で行った。一般的で強く推奨されるネガティブコントロールは「NTC」であり、テンプレートなしのコントロールです。このサンプルは、テロメラーゼ伸長反応に NP-40 溶解バッファー (2 μ l) を添加し、実際の細胞溶解物を含む他のサンプルと同一の方法で伸長産物を進行させることによって生成されます。このサンプルでは、ユーザーは、テロメラーゼの活動をより良く定量化するために、もしあれば、バックグラウンドシグナルを減算することができます。なお、この図には示されていないが、別の陰性対照としてテロメラーゼ伸長反応の前に5分間95° C で溶解物を失活させることもできる。このネガティブコントロールは、セル/サンプルの量が問題にならない場合に適しています。
液滴エマルション中のすべての単一液滴の蛍光強度を測定することによって、液滴リーダーは、ポアソン分布を用いて入力分子 (分子/マイクロリットル) の濃度を推定することができた (図 1a)。DdTRAP の場合、これらの入力分子はテロメラーゼ拡張製品であった。DdTRAP アッセイのメカニズムは次のようになりました: テロメラーゼは TS 基質を拡張しました。これらの拡張基板は、ddPCR の PCR テンプレートとして作用しました。PCR 増幅基質の定量化は、所与の細胞株内でのテロメラーゼ酵素活性の表現を提供した。すべての液滴は図 1aに示すようにプロットされた。DdTRAP のしきい値の設定は主観的な場合があります。ただし、適切なネガティブコントロールを使用すると、ユーザーは簡単にその操作を行うことができます。図 1aに示された例では、SHP77、H2887、および NTC に対する3つの生物学的反復すべてに対して閾値が設定された。陽性液滴は6000の蛍光振幅 (FA) の周りに蛍光強度を有し、上部に明確な母集団を形成し、1100 FA 付近の負の液滴から分離した。したがって、この閾値は、この実験において〜 2000 FA に設定され得る。
一旦データを収集してエクスポートした後、全てのサンプル間で同等の細胞当たりの総テロメラーゼ伸長産物を計算することができた (図 1b)。すべてのウェルからの信号は絶対濃度 (分子/マイクロリットル) であった。濃度を 20 (サンプルの入力体積を ddPCR カートリッジ) に掛けることによって、ユーザは、分子の総数を得ることができる。この数は、その後、既知のセル等価 (我々の ddTRAP のパフォーマンスでは、我々は100セルを使用) で割ることができます。この最終値は、 y軸に示すようにセル当量のテロメラーゼ伸長産物の単位である。
図 1: 肺がんパネルにおけるテロメラーゼの活動(A) SHP77、H2887、および NTC に対する液滴蛍光強度 (蛍光振幅) の1d 振幅。SHP77、H2887、NTC 用の井戸を選定し、2000 FA にマニュアル閾値を設定した。(B) テロメラーゼの活性は、以下の PCR を検出した核酸の測定濃度から推定し、肺癌ラインのテロメラーゼ活性を比較するためにプロットした。FA = 蛍光振幅単位。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
テロメラーゼの活動の測定は、癌、テロメア生物学、老化、再生医療、および構造ベースの薬物設計を含むが、これらに限定されない研究テーマの茄多に重要です。テロメラーゼ RNPs は、がん細胞であっても、豊富に不足しているため、この酵素の検出と研究は困難です。本論文では、新たに開発した ddTRAP アッセイについて、細胞内のテロメラーゼ活性を確実に定量化するためのステップバイステップの手順について説明しました。DdPCR との伝統的なテロメラーゼ伸長反応を組み合わせることにより、肺癌細胞におけるテロメラーゼ活性 (テロメラーゼ拡張産物) を定量的に検出することができました。
DdTRAP アッセイは、トラップアッセイと同じ理論に依存しています。細胞溶解物は、溶解する細胞によって得られ、非イオン性洗剤 (NP − 40) 溶解緩衝液中で酵素活性を維持し、次いで、「TS」基質/プライマーのテロメラーゼ伸長反応を実行するために使用される。DdTRAP の新規性は、PCR の前に液滴の形成に依存しています。サンプルを液滴に分割することにより、アッセイでは細胞ごとのテロメラーゼ活性を絶対的に定量することができます。
テロメラーゼの活性は、ddTRAP を用いて肺癌細胞株で測定した。ゲルベーストラップアッセイの重要な制限の1つは、一度に処理できるサンプルの数です。ほとんどのゲルの櫛は20までの井戸/サンプルを収容できる。対照的に、ddTRAP は一度に最大96のサンプルを実行することができ、一度に処理できるサンプルの数が大幅に増加します。我々は8つの細胞株においてテロメラーゼの活性をアッセイした。最も重要なのは、生物学的 triplicates で各テロメラーゼ拡張反応を実行し、合計24の伸長反応を行ったことです。次に、ddPCR プレート上の合計72サンプルの PCR のための3つのテクニカルレプリケートとして、各拡張反応を実行することができました。なお、ddTRAP の試金は100の細胞の等量のための 5.1% の interday の CV (変動係数) および100の細胞等価物のための 8.61% の日 CV で再生可能な結果を提供する。Interday および日中はそれぞれ、2つの異なるプレートまたは同一プレート上で実行される生物学的複製を表す、HeLa 細胞溶解液11上。72サンプルは、従来のトラップまたは任意の他のゲルベースのアッセイで処理された場合、それははるかに多くのハンズオン時間を必要とします。これは、試薬の高いコスト、従業員/学生/研修生から必要なより貴重な時間、より高いゲルからゲルの変動性、およびユーザーと研究所間の再現性の欠如につながります。DdTRAP で確実かつ容易に反復を実行できることは、ゲルベースのアッセイに比べて劇的に改善され、より多くのサンプルを効率的に処理できるため、データの統計分析に役立ちます。
最後に、ddTRAP におけるサンプル間のばらつきが少なく、必要な反復を行う可能性があるため、ユーザーはサンプル間の2倍以下の変化を観察することができます。ほとんどのゲルベースアッセイの主な制限は、適切な定量が欠如していることです。ここでは、ddTRAP を用いて、種々の肺癌ライン間の微妙な違いを検出することができる。このわずかな違いは、テロメラーゼ活性を標的とする薬剤を比較し、高スループットスクリーンから低分子化合物を前進させるかどうかを決定する際に重要となる可能性があります。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
著者は、国立衛生研究所 (NIH) (R00 ・ CA197672 ・ 01A1) からの資金調達源を確認したいと考えています。小細胞肺癌線 (SHP77 と H82) は、ジョン・みんなと Adi Gazdar ・メディカル・センターから贈られた、寛大な贈り物でした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
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