我々は正常に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応に採用される標準的なテロメア反復増幅プロトコル (TRAP) アッセイを変換しました。DdTRAP と呼ばれるこの新しいアッセイは、より高感度で定量的であり、様々なヒト細胞内のテロメラーゼ活性のより良い検出および統計分析を可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
テロメア反復増幅プロトコル (TRAP) は、所与のサンプル内のテロメラーゼ活性を検出するために最も広く使用されているアッセイです。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法は、ほとんどの細胞溶解物からの酵素活性のロバストな測定を可能にします。蛍光標識されたプライマーを用いたゲルベースのトラップはサンプルのスループットを制限し、サンプルの差を検出する能力は酵素活性の2倍以上の変化に制限される。液滴のデジタルトラップ、ddTRAP は従来のトラップの試金から変更された非常に敏感なアプローチであり、ユーザーが実行ごとの96サンプルの強い分析を行い、DNA の絶対定量化を得ることを可能にする (テロメラーゼの延長プロダクト) は、各 PCR 内で入力します。従って、新しく開発された ddTRAP の試金は従来のゲルベースのトラップの試金の限界を克服し、実験室および臨床設定内のテロメラーゼの活動を測定するためにより有効で、正確な、量的なアプローチを提供する。
概要
テロメアは、線状染色体の末端にある動的な DNA-タンパク質複合体です。ヒトテロメアは、出生1で 12-15 キロベース (kb) の長さが異なる 5 '-TTAGGGn hexameric の繰り返しの配列で構成されています。ヒトテロメラーゼは、テロメアを維持する ribonucleoprotein 酵素を、HeLa 細胞溶解物 (癌細胞株)2で最初に同定した。共に、テロメアとテロメラーゼは、ゲノム保護、遺伝子調節、および癌細胞不滅性3、4、5、6などの生物学的プロセスのスペクトルにおいて主要な役割を果たしています。
ヒトテロメラーゼは主に、テロメラーゼ逆転写酵素とテロメラーゼ RNA (hTERT および hTERC) の2つの主要成分から構成されています。タンパク質サブユニットは、hTERT、テロメラーゼ酵素の触媒活性逆転写酵素成分である。RNA テンプレート、hTERC は、テロメアを拡張および/または維持するためのテンプレートをテロメラーゼに提供する。ほとんどのヒト体細胞組織は、検出可能なテロメラ....
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プロトコル
1. バッファの準備と保存
- 50の1x ストック RNase-/DNase-free NP-40 溶解バッファー (10 mM トリス-HCl [pH 8.0]、1 mM MgCl2、1 mm ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)、1% [vol/VOL] NP-40、10%(vol/vol] グリセロール、150 mm NaCl、5 mm β-メルカプトエタノール、および 0.1 mm 4-benzenesulfonyl 塩酸塩 (AEBSF))。このバッファは、将来の使用のために-20 ° c で等分および保存することができます。細胞の最適な溶解を得るために、凍結/解凍サイクルを避けてください。
- 10倍のストック RNase-/DNase-free トラップ拡張バッファー (200 mm MgCl-HCl [pH 8.0]、15 mm アミノエチルシステイン2、630 mM KCl、0.5% [vol/vol] トゥイーン20、および 10 mM エチレングリコール-ビス (β-エーテル)-n、n、n ′、N′-tetraacetic 酸 (EGTA)) を50準備します。この緩衝液を 1 mL アリコートに等分し、将来の使用のために-20 ° c で保存することができます。
2. 細胞溶解
- 細胞の調製
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結果
DdTRAP を用いて、テロメラーゼの活性を、以下の細胞株からなる細胞パネルで測定した (図 1): nonsmall 細胞肺癌 (H2882、H1299、Calu6、H920、A549、および H2887)、小細胞肺癌 (H82 および SHP77)、およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞 (BJ)。100万細胞ペレットを NP −40バッファーで溶解し、テロメラーゼ伸長反応を生物学的 triplicates で行った。一般的で強く推奨されるネガティブコントロールは「NTC」であり、テンプレートなしのコントロールです。このサンプルは、テロメラーゼ伸長反応に NP-40 溶解バッファー (2 μ l) を添加し、実際の細胞溶解物を含む他のサンプルと同一の方法で伸長産物を進行させることによって生成されます。このサンプルでは、ユーザーは、テロメラーゼの活動をより良く定量化するために、もしあれば、バックグラウンドシグナルを減算することができます。なお、この図には示されていないが、別の陰性対照としてテロメラーゼ伸長反応の前に5.......
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ディスカッション
テロメラーゼの活動の測定は、癌、テロメア生物学、老化、再生医療、および構造ベースの薬物設計を含むが、これらに限定されない研究テーマの茄多に重要です。テロメラーゼ RNPs は、がん細胞であっても、豊富に不足しているため、この酵素の検出と研究は困難です。本論文では、新たに開発した ddTRAP アッセイについて、細胞内のテロメラーゼ活性を確実に定量化するためのステップバイステップの手順について説明しました。DdPCR との伝統的なテロメラーゼ伸長反応を組み合わせることにより、肺癌細胞におけるテロメラーゼ活性 (テロメラーゼ拡張産物) を定量的に検出することができました。
DdTRAP アッセイは、トラップアッセイと同じ理論に依存しています。細胞溶解物は、溶解する細胞によって得られ、非イオン性洗剤 (NP − 40) 溶解緩衝液中で酵素活性を維持し、次いで、「TS」基質/プライマーのテロメラーゼ伸長反応を実行するために使用される。DdTRAP の新規性は、PCR の前に液滴の形成に依存しています。サンプルを液滴に分割することにより、アッセイでは細胞ごとのテロメラーゼ活性を絶対的に定量す.......
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開示事項
作者は何も開示することはありません。
謝辞
著者は、国立衛生研究所 (NIH) (R00 ・ CA197672 ・ 01A1) からの資金調達源を確認したいと考えています。小細胞肺癌線 (SHP77 と H82) は、ジョン・みんなと Adi Gazdar ・メディカル・センターから贈られた、寛大な贈り物でした。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse フリー |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse フリー |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse フリー |
| サーファクタアンプ NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse フリー |
| フッ化フェニルメチルスルホニル | Thermo Scientific | 36978 | 粉末 |
| 2-メルカプトエタノール | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| ヌクレアーゼフリー H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 各dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各2.5 mM |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAseフリー |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX |
| (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| 薄肉(250 ul)PCRグレードのチューブ | USA Scientific | 1402-2900 | ストリップ、プレート、チューブなど |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable ホイルヒートシール | Bio Rad | 1814040 | |
| 液滴発生器カートリッジ (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| 液滴発生器オイル | Bio Rad | 1863005 | |
| 液滴発生器ガスケット | バイオ・ラッド | 1863009 | |
| 96 ウェル サーモサイクラー T100 | バイオ・ラッド | 1861096 | |
| PX1 PCR プレートシーラー | バイオ・ラッド | 1814000 | |
| QX200 ドロップレットリーダーおよびクアンタソフトソフトウェア | バイオ・ラッド | 1864001 および 1864003 | |
| ddPCR ドロップレットリーダー オイル | バイオ・ラッド | 1863004 | |
| ヌクレアーゼフリー フィルター付きピペットチップ | サーモサイエンティフィック | 10 ul、20 ul 、200 ul、1000 ul |
参考文献
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B.
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