Summary
הצלחנו להמיר בהצלחה את התקן טלומר חוזר פרוטוקול (מלכודת) האפשרות להיות מועסק בתגובות שרשרת droplet דיגיטלית פולימראז. שיטת הפעולה החדשה, הנקראת ddtrap, רגישה יותר וכמותית, ומאפשרת זיהוי טוב יותר וניתוח סטטיסטי של פעילות טלומראז בתוך תאים אנושיים שונים.
Abstract
הפרוטוקול של הגברה חוזרת של טלומר (TRAP) הוא הדבר הנפוץ ביותר לזיהוי פעילות טלומר בתוך מדגם נתון. השיטה המבוססת על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מאפשרת מדידות איתנות של פעילות אנזימים ממרבית תאי התאים. המלכודת המבוססת על ג'ל עם התווית התחל מגבילה את התפוקה לדוגמה, והיכולת לזהות הבדלים בדגימות מוגבלת לשני שינויים מתקפל או גדולים יותר בפעילות האנזים. המלכודת ה-droplet הדיגיטלית, ddTRAP, היא גישה רגישה מאוד ששונתה מתוך מבנה המלכודת המסורתי, מה שמאפשר למשתמש לבצע ניתוח מעמיק על 96 דגימות לכל הפעלה ולהשיג קוונפיקציה מוחלטת של ה-DNA (telomerase מוצרים הרחבה ) בתוך כל ה-PCR. לכן, שיטת ddtrap שפותחה לאחרונה גוברת על המגבלות של שיטת ההשמנה המסורתית ג'ל מבוססת ומספקת גישה יעילה יותר, מדויקת וכמותית למדידת פעילות טלומראז בתוך המעבדה והגדרות קליניות.
Introduction
טלומרים הם מתחמי DNA-פרוטאין דינמיים בקצות כרומוזומים ליניאריים. טלומרים אנושיים מורכבים ממערך של 5 '-TTAGGGn hexameric חוזר אשר משתנה באורך בין 12 – 15 קילו (kb) בלידה1. מחיקת האדם, האנזים הריבונאופלפרוטאין השומר על הטלומרים, זוהה לראשונה ב-"הלה תאי" (קו תאי סרטן)2. יחד, טלומרים ו טלומרים לשחק תפקיד מרכזי בספקטרום של תהליכים ביולוגיים כגון הגנת הגנום, תקנות גנים, סרטן תאים אלמוות3,4,5,6.
האדם טלומראז מורכב בעיקר של שני מרכיבים מרכזיים, כלומר טלומראז הפוכה הטרנסקריפטאז ו טלומראז RNA (htert ו htert, בהתאמה). החלבון התחתי, htert, הוא מרכיב הפוכה פעיל היפוך הטרנססקריפט של האנזים טלומראז. תבנית RNA, hterc, מספקת טלומראז עם התבנית כדי להרחיב ו/או לשמור טלומראז. לרוב הרקמות הגופניות האנושיות אין פעילות מוחקת. חוסר היכולת של דנ א פולימראז להאריך את סופו של בפיגור של ה-dna יחד עם חוסר של טלומראז מוביל את הקיצור המתקדם של טלומראז לאחר כל סיבוב של החטיבה התאית. תופעות אלו מובילות לקיצור ברוב התאים הסומטיים עד שהם מגיעים לאורך מקוצר ביקורתי, לפיו תאים נכנסים למצב של הזדקנות מחודשת. המספר המקסימלי של פעמים תא יכול לחלק מוכתב על ידי האורך שלה טלומר ובלוק זה להמשך החטיבה התא הוא חשב למנוע התקדמות אונגנזה7. תאים סרטניים מסוגלים להתגבר על הזדקנות המושרה telomere ולהמשיך להתרבות על ידי ניצול telomere כדי לשמור על telomere שלהם. כ 90% של סרטן להפעיל טלומראז, מה שהופך פעילות טלומראז חשוב באופן ביקורתי בזיהוי וטיפול בסרטן.
ההתפתחות של שיטת המלכודת בשנות ה-90 הייתה אינסטרומנטלית בזיהוי המרכיבים הנחוצים של האנזים הטלומראז, כמו גם למדידת היקף התאים והרקמות, הן נורמליות והן סרטניים. שיטת ה-PCR המקורית המבוססת על ג'ל השתמשה ברדיוגנטית מתייגת מצעים DNA כדי לזהות פעילות טלומראז. בשנת 2006, העיבוד הותאם לצורה לא רדיואקטיבית באמצעות fluorescently אופן התווית מצעים8,9. באמצעות fluorescently אופן התווית מצעים, המשתמשים הצליחו להמחיש את מוצרי ההרחבה טלומראז כמו להקות על ג'ל על ידי חשיפת אותו גל עירור הנכון. הרגישות של שיטת המלכודת ויכולתה לזהות פעילות טלומראז ב-lysates תא גולמי הפכה את השיטה הנפוצה ביותר לשימוש הנפוץ ביותר עבור זיהוי פעילות טלומראז. עם זאת, לשיטת ההשמנה יש מגבלות. הטיפול הינו מבוסס ג'ל, ומקשה על ביצוע השכפל הדרוש בינוני ועד תפוקה גבוהה, ולכן מושגת לעתים רחוקות ניתוח סטטיסטי מתאים. יתרה מזאת, היכולת המבוססת על ג'ל קשה לכמת באופן אמין עקב חוסר מזהה פחות מאשר כפולה הבדלים בפעילות טלומראז בין דגימות. התגברות על שתי מגבלות אלה היא קריטית לטיפול בפעילות אנזימטית כגון המלכודת לעבור להגדרות הקליניות או התעשייה לאיתור פעילות טלומראז בדגימות מטופלים או בלימודי עיצוב סמים.
ה-PCR הדיגיטלי פותח בתחילה ב-1999 כאמצעי להמרת האופי האקספוננציאלי והאנלוגי של הPCR לתוך שיטת ליניארי ודיגיטלית מסוג10. ה-PCR הדיגיטלי (ddPCR) הוא החדשנות העדכנית ביותר של מתודולוגיית ה-PCR הדיגיטלית המקורית. ה-PCR הדיגיטלי של Droplet הגיע עם הופעתו של מיקרופלואידיקה מתקדם מיקרופלואידיקה וכימיה אמולסיה שמן במים כדי ליצור באופן אמין טיפות בגודל יציב ובמידה שווה. בניגוד ל-PCR המבוסס על ג'ל ואפילו כמותי, ddPCR יוצר קוונפיקציה מוחלטת של חומר הקלט. המפתח ddPCR הוא הדור של ~ 20,000 תגובות בודדות על ידי מחיצות דגימות לתוך טיפות. בעקבות ה-PCR של נקודת הסיום, הקורא droplet סורק כל droplet בצורה של זרימה-cytometer לספור, לגודל, ולהקליט את הנוכחות או העדר של הזריחה בכל droplet בודדת (כלומר, היעדרות או נוכחות של הגברה PCR ב-droplet). לאחר מכן, באמצעות התפלגות פואסון, מולקולות קלט מוערכות בהתאם ליחס של טיפות חיוביות למספר הכולל של טיפות. מספר זה מייצג הערכה של מספר מולקולות הקלט ב-PCR. יתר על כן, ddPCR מבוצע ומנותח על צלחת 96-באר אשר מאפשר למשתמש להפעיל דגימות רבות, כמו גם לבצע משכפל ביולוגי וטכני לניתוח סטטיסטי תקין. כתוצאה מכך, אנו שילבו את הקוונפיקציה עוצמה והתפוקה הבינונית של הטבע ddPCR עם בדיקת המלכודת כדי לפתח את השיטת Ddpcr11. שיטת העבודה מיועדת למשתמשים ללמוד ולכמת את הפעילות המוחלטת של טלומראז מדגימות ביולוגיות11,12. רגישות ה-ddtrap מאפשרת את כימות הפעילות של טלומראז מדגימות מוגבלות ויקרות, כולל מדידות תא יחיד. יתר על כן, משתמשים יכולים גם ללמוד את ההשפעות של מניפולציות טלומראז ו/או תרופות עם כימות מוחלטת של פחות מאשר שינויים כפולה (~ 50% הבדלים). ה-ddTRAP הוא האבולוציה הטבעית של הגדרת המלכודת לטבע הדיגיטלי והתפוקה הגבוהה יותר של ניסויי מעבדה מודרניים והגדרות קליניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה ואחסון של מאגר
- להכין 50 mL של 1x מניות RNase-/Dnaset-free NP-40 לליזה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl [pH 8.0], 1 מ"מ MgCl2, 1 מילימטר החומצה (edta), 1% [vol/VOL] NP-40, 10% [vol/vol] גליצרול, 150 מ"מ הנאל, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 mM 4- הידרואנסולולוניל פלווריד (AEBSF)). ניתן לצטט מאגר זה ולאחסנו ב-20 ° c לשימוש עתידי. הימנע הקפאת/הפשרת מחזורי על מנת לקבל לפירוק מיטבי של תאים.
- הכינו 50 מ ל של 10x מניות RNase-/Dnaset-free מאגר הרחבה של השמנה (200 mM טריס-HCl [pH 8.0], 15 מ"מ MgCl2, 630 Mm kcl, 0.5% [vol/Vol] רצף 20, ו 10 מ"מ אתילן גליקול-bis (β-עמינח האתר)-N, N, n ′, n′-הטטראצטט חומצה (egta)). מאגר זה יכול להיות מצוטט לתוך 1 mL המאחסן ומאוחסן ב-20 ° c לשימוש עתידי.
2. הפירוק התא
-
הכנת התאים
- הפשרת הנורית הקפואה של מאגר הליליזה של NP-40. לאחר הפשפה, הנח את מאגר הליזה על הקרח. הוסף פנילתילסולולוניל פלואוריד (מעכב פרוטאז PMSF) למאגר הליזה NP-40 כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.2 מ"מ.
הערה: יש לעשות זאת מייד לפני שתשיר את התאים. - הסר את כל הנוזלים העודפים מן כדורי התא שנאספו כדי להבטיח גלולה תא יבש. שים לב כי כדורי תא, אם נאסף טרי או קפוא בעבר (-80 ° צ' או הבזק קפוא ב-N הנוזלי), אסור לכלול פתרונות שאריות מcentrifugations הקודם כמו פתרונות אלה עלולים להפריע להליכי הזרם.
- לגדול, לאסוף, ולהקפיא גם telomerase-חיובי ו-telomerase וחק קווי תא (BJ פיברותקיעות, IMR-90 או U2OS) על מנת להשתמש בהם כפקדים חיוביים ושליליים. השתמש בבקרת שליטה חדשה בכל פעם שהוא מבוצע כדי להבטיח את האפשרות לשמירה על המצב.
הערה: מומלץ שתרבות גדולה של תאים טלומראז-שליליים תגדל ומצוטט לפני הקפאה כדי להסיר את כל החפצים הקשורים לרקמות הקשורות שניתן להציג במהלך התרבות הארוכת טווח של קווי התאים כדי להבטיח תוצאות מסוימות של דגימת הבקרה השלילית. - . הניחו את כדורי התא על הקרח אם התאים קפאו, אפשר להם להפשיר בקצרה על קרח.
הערה: גדלי כדוריות התאים האופייניות ל-ddTRAP הם בין 500,000 לבין 1,000,000 תאים. כדורי תא קטנים יותר עשויים לשמש גם במקרה הצורך, אך יש להכיר את מספר התאים/באופן אידיאלי. ניתן גם לבצע את ddTRAP בהתבסס על קלט חלבון באמצעות שיטת החלבון BCA (הקלט בדרך כלל הוא 1 μg).
- הפשרת הנורית הקפואה של מאגר הליליזה של NP-40. לאחר הפשפה, הנח את מאגר הליזה על הקרח. הוסף פנילתילסולולוניל פלואוריד (מעכב פרוטאז PMSF) למאגר הליזה NP-40 כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.2 מ"מ.
-
ליסינג של התאים
- Lyse את התאים במאגר הליזה NP-40. שמור על תא שקילות של 25,000 תאים/μL של מאגר. לדוגמה, lyse גלולה (המכילה 1,000,000 תאים) ב 40 μL של מאגר הליזה NP-40. בעדינות ללטף את הליפוסט למעלה ולמטה על מנת לשבור את התאים. לנסות להימנע ביצוע בועות.
- הניחו לתאים להיות בקרח במשך 30 דקות. הקפד בעדינות מערבולת הליפוסט כדי למנוע אשכולות של פסולת תאים מיוצרים. זה יכול להיעשות כל 10 דקות והוא נועד לשמור על הליפוסט תערובת הומוגניים.
- לדלל את התא ליפוסט (25,000 תאים/μL) 1:20 ב NP-40 מאגר הליזה, ביצוע שקילות התא החדש 1,250 תאים/μL. לדוגמה, לדלל 5 μL של תא ליפוסט לתוך 95 μL של מאגר הליזה.
3. מחיקת הארכה של טלומראז
- הכינו תמהיל ראשי (טבלה 1) לתגובת ההרחבה של טלומראז (לכל תגובה).
הערה: מומלץ להכין את תגובת השלוחה מאסטר לערבב במהלך הפירוק התא ולאחסן אותו על הקרח.- Pipet 48 μL של בסיס הרחבה מיקס לתוך כל צינור PCR.
- הוסף 2 μL של מדולל (1,250 תאים/μL) לאחר תגובת ההרחבה. הנפח הכולל צריך כעת להיות 50 μL עם שקילות התא הסופי של 50 תאים/μL.
- בצע את תגובת ההרחבה של טלומראז (שולחן 2).
- אחסן את מוצרי ההרחבה של טלומראז ב-4 ° צ' עד 3 – 5 ימים; עם זאת, מיטבי להשתמש במוצרי ההרחבה בתוך 24 ה-h הראשון.
4. התקנת ה-PCR הדיגיטלי של Droplet
- הכינו תמהיל ראשי (שולחן 3) עבור ה-ddtrap (לכל תגובה).
הערה: ברגע שהריאגנטים נמצאים בטמפרטורת החדר, אל תמקם אותם או את התערובת הראשית על הקרח. הצבת התערובת על הקרח עשויה להגביר את הצמיגות ולהוביל ליצירת droplet ירודה. הדי-אן-איי פולימראז ב-ddPCR הוא התחלה חמה וצריך להיות יציב בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן את שילוב ddPCR ב-4 ° c לאחר ההפשרה הראשונית מ-20 ° c.- Pipet 19.8 μL של המיקס הראשי של ddPCR לתוך כל צינור PCR.
- הוסף 2.2 μL של תגובת ההרחבה לכל צינורית. שים לב שאמצעי האחסון הכולל צריך להיות כעת 22 μL.
הערה: הסכום הכולל של המדגם הדרוש עבור ddTRAP הוא 20 μL (שקילות תא של 100 תאים). נפח נוסף הוא אמצעי זהירות עבור שגיאה pipet או אובדן לדוגמה.
- הגדר את מחסנית הדור droplet.
הערה: המחסנית מכילה שלוש עמודות שונות של בארות המסומנות בתווית.- טען 20 μL של התגובה שהוכנו על פי שלב 4.1.2 לתוך המדגם היטב (באמצע) במחסנית. להימנע בועות בעת ליטוף את המדגם.
הערה: אם יש בועות, הקש בעדינות על צד המחסנית כך שבועות אלה יגיעו לראש הפתרון. - טען 70 μL של שמן הדור droplet לתוך הבאר שמן (שמאל טוב).
הערה: כדי למנוע זיהום, השתמש בקפדנות בערכה נפרדת של פיפטות וטיפים לצעדי הדור של ה-ddPCR. הסדר של טעינת המחסנית חשוב. המדגם חייב להיות טעון לפני טעינת שמן כמו שמן הוא כבד יותר ימלא את התאים microfluidic ולהוביל מערך droplet עני. המספר המינימלי של דגימות שניתן להפעיל הוא שמונה. כל הבארות של מחסנית חייב להיות טעון עם המדגם כמו כל הטוב הריק יוביל לעצירה בדור droplet ממחולל ה-droplet. אם דגימות מתאימות אינן זמינות לטעינת כל שמונה הבארות בתוך מחסנית, 20 μL של ערבוב מאסטר ddTRAP (שלב 4.1) ניתן לטעון לתוך מחסניות הנותרות. - אבטח את האטם במקומו על-ידי הטבאתו לקצות המחסנית.
הערה: חוסר או מיקום לא תקין של האטם ימנע את הגנרטור מיצירת טיפות. - הצב את המחסנית שנטענה והורכבה במחולל ה-droplet.
הערה: המחסנית מזוהה על-ידי מגנט במחולל, אשר יודיע למשתמש כאשר המחסנית ממוקמת כהלכה.
- טען 20 μL של התגובה שהוכנו על פי שלב 4.1.2 לתוך המדגם היטב (באמצע) במחסנית. להימנע בועות בעת ליטוף את המדגם.
- הסר את מיכל הדיו לאחר שהטיפות נוצרות והמחזור יושלם (~ 60-90 s).
- הסר את האטם בעדינות ממיכל הדיו. Pipet טיפות החדש שנוצר (טוב מאוד), באמצעות הצנרת רב-ערוצי, לצלחת 96-הטוב PCR.
הערה: הנפח המשוער לתחליב ה-droplet החדש שנוצר צריך להיות 40 – 43 μL. - החום חותם את הצלחת עם רדיד אלומיניום PCR הלוח החותמות פעם כל הדגימות נטענות בצלחת 96-באר כדי למנוע אידוי במהלך שלבי ה-PCR.
- הסר את האטם בעדינות ממיכל הדיו. Pipet טיפות החדש שנוצר (טוב מאוד), באמצעות הצנרת רב-ערוצי, לצלחת 96-הטוב PCR.
- לטעון את הצלחת 96-היטב לתוך הציקלוניר ולבצע את תגובת ה-PCR הבאה (שולחן 4).
הערה: כל שיעורי השיפוע בין שלבי הטמפרטורה חייבים להיות מוגדרים ל-2.5 ° צ'/s כדי לחמם כראוי את התגובות.
5. זיהוי מוצרי ההרחבה של טלומראז
- טען את הצלחת 96-באר בקורא ה-droplet.
הערה: הקפד לכוון את הצלחת כראוי כך שמדגם A1 תואם את זה של המחזיק.- פתח את התוכנה המשויכת לקורא ה-droplet. לחץ פעמיים על הראשון בבאר A1 כדי לפתוח את מדגם/מסך עורך גם.
- לחץ על ניסוי ובחר באפשרות ABS מהתפריט הנפתח.
הערה : הניסוי מגדיר את סוג הסדר בו יש להשתמש (כלומר, כימות מוחלטות או שיטת העתקת מספרים גנטית). ABS מייצג כימות מוחלטות. - בחר באפשרות QX200 ddPCR ev, בכדי להבטיח ששיטת הזיהוי הנכונה מעובדת על-ידי הקורא. לחץ על החל בצד הימני התחתון של מסך העורך היטב כדי לשמור את ההגדרות המוגדרות על-ידי המשתמש לכל הבארות המסומנות.
הערה: Supermix מגדיר את סוג שילוב ה-PCR וכימיית הזיהוי שייקרא על-ידי הקורא. - לחץ על היעד במסך עורך היטב של התוכנה כדי להגדיר את המדגם.
- הגדר את סוג המדגם על-ידי לחיצה על התפריט הנפתח TARGET ובחירה באפשרות לא ידועה, הפניה או ntc (ללא תבנית בקרה).
הערה: לא ידוע מתייחס למדגם ניסיוני , הפניה יכולה להיות דגימת שליטה של פעילות טלומראז ידועה, ו- ntc הוא שליטה קריטית לקביעת חוקיות האימות במונחים של זיהום ו . אות רקע - סמן את כל הדגימות במקטע שם לדוגמה ולחץ על החל כדי לוודא שהבארות המסומנות מסומנות כראוי.
- לחץ על הפעל כדי להפעיל/לקרוא את הלוח. בחר בעמודות או בשורות במסך אפשרויות הפעלה כאשר תתבקש ליידע את המחשב אודות הכיוון שבו יש לקרוא את הלוח.
6. ניתוח נתונים
- קבע את מספר הטיפות המקובלות עבור כל מדגם על-ידי לחיצה על בארות נפרדות. לחץ פעמיים על כותרות הבארות או העמודות הבודדות כדי להציג ולנתח את הנתונים לדוגמה.
הערה: הקריטריונים החשובים ביותר בשאלה האם להמשיך בניתוח של מדגם מסוים הוא מספר "טיפות מקובלות". עבור מלכודת ddTRAP, דגימות עם 10,000 או טיפות מקובלים יותר תקפים לניתוח נוסף. ניתן לספק נתונים למשתמש בפורמטים רבים, כולל טבלת. csv, תמונות jpg, היסטולגרמות, וכו '. ישנם משאבים רבים זמינים לניתוח מעמיק של נתוני ddpcr, כולל מלכודת ddpcr,13. משאבים אלה מציעים מדריך לניתוח נתוני ddtrap, מבחירת ספי11,13 לבחירת דוגמאות לניתוח נוסף11,13, זיהוי תוצאות חיוביות שגויות ושליליות13, ו כללי פתרון בעיות13. - סמן את הבארות המייצגים משכפל לדוגמה ודגימות NTC. נתח את הדגימות בהשוואה ל-NTC או לקווי בקרה שליליים, כגון תאי BJ (כמפורט לעיל בשלב 2.1.2).
- קבע באופן ידני את הסף עבור הדגימות על-ידי לחיצה על הסמל להגדרת ספי הקצה בצד השמאלי התחתון של המסך. הגדר סף עבור כל היטב אדם או עבור בארות מרובות בכל פעם (מומלץ).
הערה: אם הרקע מזוהה ב-NTC, ניתן לחיסור מכל הדגימות האחרות כדי ' לנרמל ' את האות ולהבטיח שרק האות החיובי האמיתי ינותח. ערכי NTC הם בדרך כלל בטווח של 0.2 – 1 מולקולה/μL עבור מערכת מאגר הליזה NP-40. יש לבדוק מערכות מאגר אחרות ורכיבים אחרים (לדוגמה, מאגרי בחורים).
- קבע באופן ידני את הסף עבור הדגימות על-ידי לחיצה על הסמל להגדרת ספי הקצה בצד השמאלי התחתון של המסך. הגדר סף עבור כל היטב אדם או עבור בארות מרובות בכל פעם (מומלץ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות מלכודת ddomמחק נמדד בלוח התא המורכב של קווי התא הבאים (איור 1): סרטן ריאות תא קטן (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, ו H2887), סרטן ריאות תא קטן (H82 ו-SHP77), ו-טלומראז-שלילי פיברותקיעות (BJ). 1,000,000 כדורי תא היתה לאחר מאגר NP-40, ו-טלומראז תגובות הארכה בוצעו בטריליטים ביולוגיים. פקד שלילי נפוץ ומומלץ מאוד הוא "NTC", הפקד ללא תבנית. מדגם זה נוצר על ידי הוספת NP-40 לפירוק מאגר (2 μl) לתגובת ההרחבה טלומראז והמשך עם מוצרי ההרחבה באופן זהה לדגימות אחרות המכילות תא בפועל ליפוסט. דוגמה זו מאפשרת למשתמש להפחית את אות הרקע, אם בכלל, כדי לכמת טוב יותר את פעילות ה-טלומראז. למרות שאינו מוצג באיור זה, ניתן גם לחמם את ההפעלה של הפוך ב-95 ° C עבור 5 דקות לפני תגובת הסיומת טלומראז כמו שליטה שלילית אחרת. שליטה שלילית זו מועדפת אם השפע של תא/דגימה אינו בעיה.
על ידי מדידת העוצמה הפלואורסצנטית של כל droplet אחת ב-droplet, קורא ה-droplet הצליח לאמוד את ריכוז מולקולות הקלט (מולקולות/מיקרוליטר) באמצעות התפלגות פואסון (איור 1a). במקרה של ddtrap, מולקולות קלט אלה היו טלומראז מוצרי הרחבה. המנגנון של הסדר ddtrap היה כדלקמן: טלומראז הרחיב את המצע TS. הסטרדיטים המורחבים האלה פעלו כתבניות ה-PCR ב-ddPCR. הקוונפיקציה של מצעים PCR מוגבר סיפק ייצוג של הפעילות האנזימטית של הטלמראז בתוך קו תא נתון. כל droplet הותווה כמוצג באיור 1A. הגדרת הסף עבור מלכודת ddTRAP להיות סובייקטיבית; עם זאת, עם הפקדים השליליים המתאימים, המשתמש יכול לעשות זאת בקלות. בדוגמה המוצגת באיור 1A, הוגדרה סף עבור כל שלושת השכפל הביולוגי עבור SHP77, H2887 ו-ntc. טיפות חיוביות היה בעוצמה פלואורסצנטית סביב 6,000 משרעת הזריחה (FA) ויצרו אוכלוסייה ברורה בחלק העליון ונפרד מטיפות שליליות סביב 1,100 הפא. לפיכך, הסף עשוי להיות מוגדר ב ~ 2,000 הפא בניסוי זה.
לאחר שהנתונים נאספו ויוצאו, ניתן היה לחשב את סה כ מוצרי ההרחבה טלומראז לכל תא שווה ערך בין כל הדגימות (איור 1b). האות מכל באר היה ריכוז מוחלט (מולקולות/מיקרוליטר). על-ידי הכפלת הריכוז ב-20 (נפח קלט של המדגם לתוך מחסניות ddPCR), המשתמש עשוי לקבל את המספר הכולל של מולקולות. מספר זה יכול להיות מחולק על ידי המקבילה התא הידוע (בביצועים שלנו של ddTRAP, השתמשנו 100 תאים). ערך סופי זה נמצא ביחידות של מוצרי הרחבה של טלומראז לכל תא המקביל למוצג בציר ה- y.
איור 1: Telomerase פעילות בלוח סרטן ריאות. (א) משרעת ה-1d של עוצמת הזריחה של Droplet (משרעת הזריחה) עבור SHP77, H2887 ו-ntc. בארות בSHP77, H2887 ו-NTC נבחרו והסף הידני נקבע ב-2,000 הפא. (ב) טלומראז פעילות הוערך מן הריכוז הנמדד של חומצות גרעין שאותרו בעקבות ה-PCR והתווה כדי להשוות פעילות טלומראז בקווים סרטן ריאות. הפא = משרעת הקרינה הפלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המדידה של פעילות טלומראז היא קריטית לשפע של נושאי מחקר כולל, אבל לא מוגבל, סרטן, טלומראז ביולוגיה, הזדקנות, רפואה רגנרטיבית, ועיצוב מבנה מבוסס סמים. Telomerase RNPs נמוכים בשפע, גם בתאים סרטניים, מה שהופך את האיתור והמחקר של האנזים הזה מאתגר. במאמר זה, תיארנו את ההליכים צעד אחר צעד עבור הצורך החדש שפותחו ddtrap לכמת את הפעילות טלומראז בתאים. על ידי שילוב התגובה המסורתית טלומראז עם ddpcr, היינו מסוגלים לזהות את הפעילות טלומראז וחק (טלומראז-מורחב מוצרים) בתאי סרטן ריאות.
הסדר ddTRAP מסתמך על אותה תאוריה של שיטת המלכודת. ליסיטים תא מתקבלים על ידי ליסינג תאים בחומר ניקוי nonionic (NP-40) מאגר הליזה לשמור על פעילות האנזים ולאחר מכן משמש לביצוע תגובת הארכה טלומראז של "TS" המצע/פריימר. החידוש של ddTRAP מסתמך על היווצרות של טיפות לפני ה-PCR. החלוקה למחיצות של המדגם לתוך טיפות מאפשרת את היכולת להשיג קוונפיקציה מוחלטת של פעילות טלומראז לכל תא.
פעילות telomerase נמדדות של סרטן הריאות, באמצעות ddTRAP. אחת ממגבלות המפתח של שיטת ההשמנה המבוססת על ג'ל היא מספר הדגימות שניתן לעבד בכל פעם. רוב ג'ל מסרקים יכול רק להכיל עד 20 בארות/דגימות. לעומת זאת, ה-ddTRAP יכול להפעיל עד 96 דגימות בכל פעם, ומגדיל באופן משמעותי את מספר הדגימות שניתן לעבד בבת אחת. אנחנו מוחקים פעילות. בשמונה קווי תאים והכי חשוב, הרצנו כל תגובת הארכה של שלישיה בטרילקטים ביולוגיים בסך הכל 24 תגובות הארכה. לאחר מכן הצלחנו להריץ כל תגובת הרחבה כשלוש משכפל טכני ל-PCR עבור סך של 72 דגימות על הלוחית ddPCR. יתר על כן, התשובה ddTRAP מספק תוצאות להתרבות עם קורות חיים interday (מקדם של וריאציה) של 5.1% עבור 100 תאים המקבילים ויום קורות חיים של 8.61% עבור 100 שווי תאים. Interday ו-יום הפנים מייצגים משכפל ביולוגי לרוץ על שתי צלחות שונות או אותה צלחת, בהתאמה, על התאים של הלה ליסביטים11. אם 72 דגימות עובדו במלכודת המסורתית או בכל מעבד אחר המבוסס על ג'ל, זה ידרוש הרבה יותר ידיים בזמן. הדבר מוביל לעלויות גבוהות יותר של ריאגנטים, זמן יקר יותר הדרוש מעובדים/סטודנטים/מתלמדים, השתנות ג'ל לג'ל גבוהה יותר, וחוסר ביכולת התחלויות בין משתמשים ומעבדות. היכולת להפעיל שכפול באופן אמין ובקלות ב-ddTRAP היא שיפור דרמטי על ידי ג'ל מבוסס-על, ומאפשר הרבה דוגמאות נוספות לעיבוד יעיל, אשר מסייע בניתוח הסטטיסטי של הנתונים.
לבסוף, פחות שינויים בין הדגימות באופן כללי ב-ddTRAP והאפשרות לבצע את השכפל הדרוש מאפשר למשתמשים להתבונן פחות מכפול בין הדגימות. המגבלה העיקרית של רוב מבוסס ג'ל מוסר היא חוסר כימות נאות. כאן, באמצעות מלכודת ddTRAP, אנחנו יכולים לזהות את ההבדלים עדינים בין שונים סרטן הריאות הקווים. ההבדלים עדינים יכול להיות קריטי כשמדובר בהשוואת סמים המיקוד הפעילות טלומראז ולהחליט אם להתקדם עם תרכובות מולקולה קטנה ממסכים תפוקה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים לאשר את מקורות המימון של מכוני הבריאות הלאומיים (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). תאים קטנים לסרטן הריאות (SHP77 ו H82) היו מתנה נדיבה של ד ר. ג'ון מינין ועדי גזדאר מהמרכז הרפואי UT דרום-מערב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
