Summary
Nós convertemos com sucesso o ensaio padrão do protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) a ser empregado em reações Chain digitais do polymerase da gota. Este novo ensaio, chamado ddTRAP, é mais sensível e quantitativo, permitindo uma melhor detecção e análise estatística da atividade de telomerase dentro de várias células humanas.
Abstract
O protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) é o ensaio o mais extensamente usado para detectar a atividade do telomerase dentro de um dado uma amostra. A reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseou o método permite medidas robustas da atividade de enzima da maioria de lysates da pilha. A armadilha baseada em gel com primers com rótulo fluorescente limita a taxa de transferência da amostra, e a capacidade de detectar diferenças nas amostras é restrita a duas vezes ou mais alterações na atividade enzimática. A armadilha digital da gota, ddTRAP, é uma aproximação altamente sensível que seja modificada do ensaio tradicional da armadilha, permitindo que o usuário realize uma análise robusta em 96 amostras por a execução e obtenha a quantificação absoluta do ADN (produtos da extensão do telomerase ) de entrada dentro de cada PCR. Conseqüentemente, o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP supera as limitações do ensaio tradicional gel-baseado da armadilha e fornece uma aproximação mais eficiente, exata, e quantitativa para medir a atividade do telomerase dentro do laboratório e das configurações clínicas.
Introduction
Telômeros são complexos de proteína de DNA dinâmicos nas extremidades dos cromossomas lineares. Os telômeros humanos são compostos de uma matriz de 5 '-TTAGGGn repetições hexamérica que variam de comprimento entre 12 – 15 kilobases (KB) ao nascimento1. A telomerase humana, a enzima ribonucleoproteína que mantém os telómeros, foi identificada pela primeira vez em lisados de células HeLa (linha celular cancerosa)2. Juntos, telómeros e telomerase desempenham um papel importante em um espectro de processos biológicos, como proteção do genoma, regulação gênica e imortalidade de células cancerosas3,4,5,6.
O telomerase humano é compreendido primeiramente de dois componentes chaves, a saber o transcriptase reverso do telomerase e o RNA do telomerase (hTERT e hTERC, respectivamente). O subunit da proteína, hTERT, é o componente reverso catalètica ativo do transcriptase da enzima do telomerase. O molde do RNA, hTERC, fornece o telomerase com o molde para estender e/ou manter telômeros. A maioria dos tecidos somáticos humanos não têm atividade de telomerase detectável. A incapacidade de DNA polimerase para estender o fim da costa retardada de DNA, juntamente com a falta de telomerase leva ao encurtamento progressivo de telômeros após cada rodada de divisão celular. Estes fenômenos conduzem ao encurtamento do telomere em a maioria de pilhas somáticas até que alcancem um comprimento crìtica encurtado, por meio de que as pilhas entram em um estado da senescência replicativa. O número máximo de vezes que uma célula pode dividir é ditada pelo comprimento do telômero e este bloco para a continuação da divisão celular é pensado para prevenir a progressão para a oncogênese7. As células cancerosas são capazes de superar a senescência replicativa induzida por telômeros e continuam a proliferar utilizando a telomerase para manter seus telómeros. Aproximadamente 90% dos cânceres ativam a telomerase, tornando a atividade de telomerase extremamente importante na detecção e tratamento do câncer.
O desenvolvimento do ensaio TRAP na década de 1990 foi fundamental na identificação dos componentes necessários da enzima telomerase, bem como para a mensuração da telomerase em uma ampla gama de células e tecidos, tanto normais quanto cancerosas. O ensaio de PCR baseado em gel original utilizou substratos de DNA rotulados radioativamente para detectar atividade de telomerase. Em 2006, o ensaio foi adaptado para uma forma não radioativa usando substratos fluorescenterotulados8,9. Usando substratos fluorescente etiquetados, os usuários puderam Visualizar os produtos da extensão do telomerase como as faixas em um gel expondo o ao comprimento de onda correto da excitação. A sensibilidade do ensaio TRAP e sua capacidade de detectar atividade de telomerase em lisados de células brutas fez deste ensaio o método mais utilizado para a detecção de atividade de telomerase. No entanto, o ensaio TRAP tem limitações. O ensaio é baseado em gel, dificultando a realização das repetições necessárias em estudos de moderada a alta produtividade, e assim, a análise estatística adequada raramente é alcançada. Além disso, o ensaio baseado em gel é difícil de quantificar de forma confiável devido à incapacidade de detectar menos de duas diferenças na atividade de telomerase entre as amostras. Superar essas duas limitações é fundamental para ensaios de atividade enzimática, como o TRAP, para se deslocar para as configurações clínicas ou da indústria para a detecção de atividade de telomerase em amostras de pacientes ou estudos de projeto de drogas.
O PCR de Digitas foi desenvolvido inicialmente no 1999 como meios converter a natureza exponencial e análoga do PCR em um ensaio linear e digital10. O PCR digital do droplet (ddPCR) é a inovação a mais recente da metodologia digital original do PCR. O PCR digital da gota veio aproximadamente com o advento do microfluídica avançado e da química da emulsão do óleo-em-água para gerar confiantemente gotas estáveis e ingualmente feitas medida. Ao contrário do PCR gel-based e mesmo quantitativo (qPCR), ddPCR gera a quantificação absoluta do material da entrada. A chave para ddPCR é a geração de ~ 20.000 reações individuais por particionamento de amostras em gotas. Após o PCR do ponto final, o leitor da gota examina cada gota em um fluxo-cytometer-como a forma, contando, dimensionando, e registrando a presença ou a ausência de fluorescência em cada gota individual (isto é, ausência ou presença de amplicons do PCR em cada gota). Em seguida, usando a distribuição de Poisson, as moléculas de entrada são estimadas com base na proporção de gotas positivas para o número total de gotículas. Este número representa uma estimativa do número de moléculas de entrada em cada PCR. Além disso, o ddPCR é executado e analisado em uma placa do 96-well que permita que o usuário execute muitas amostras, assim como executa réplicas biológicas e técnicas para a análise estatística apropriada. Em conseqüência, nós combinamos a natureza poderosa da quantificação e da moderado-taxa de ddPCR com o ensaio da armadilha para desenvolver o ensaio de ddTRAP11. Este ensaio é projetado para que os usuários estudem e quantifiquem de forma robusta a atividade de telomerase absoluta a partir de amostras biológicas11,12. A sensibilidade do ddTRAP permite a quantificação da atividade de telomerase de amostras limitadas e preciosas, incluindo medições de células únicas. Além disso, os usuários também podem estudar os efeitos de manipulações de telomerase e/ou drogas com quantificação absoluta de menos de duas alterações (~ 50% de diferenças). O ddTRAP é a evolução natural do ensaio TRAP na natureza digital e de maior rendimento de experimentos laboratoriais modernos e ambientes clínicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparação e armazenamento do tampão
- Prepare 50 ml de 1x estoque RNase-/DNase-Free NP-40 lysis buffer (10 mm Tris-HCl [pH 8,0], 1 mm MgCl1,2mm etilenodiaminotetracético ácido (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-Mercaptoetanol e 0,1 mm 4- cloridrato de fluoreto de benzenesulfonilo (AEBSF)). Este tampão pode ser aliquotado e armazenado em-20 ° c para o uso futuro. Evite ciclos de congelamento/descongelação para obter uma lise ideal das células.
- Prepare 50 mL de 10x estoque RNase-/DNase-free buffer de extensão de armadilha (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm kcl, 0,5% [VOL/VOL] Tween 20, e 10 mm etileno glicol-bis (β-aminoetil éter)-N, N, n ′, n′-Tetraacetic ácido (EGTA)). Esta memória intermédia pode ser aliquotada em alíquotas de 1 mL e armazenada a-20 ° c para utilização futura.
2. lise celular
-
Preparação das células
- Descongelar uma alíquota congelada de tampão de Lise NP-40. Uma vez descongelado, coloque o tampão de Lise no gelo. Adicionar fluoreto de fenilmetilsulfonila (inibidor da protease de PMSF) ao tampão de Lise NP-40 para atingir uma concentração final de 0,2 mM.
Observação: isso deve ser feito imediatamente antes de lisar as células. - Retire qualquer excesso de líquido das pelotas de células coletadas para garantir um pellet de células secas. Note-se que as pelotas de células, se recém-coletadas ou previamente congeladas (-80 ° c ou flash congelado em líquido N2), não devem conter quaisquer soluções remanescentes de centrifugações anteriores, pois estas soluções podem interferir com os procedimentos a jusante.
- Cresça, colete e congele as linhas celulares telomerase-positivas e telomerase-negativas (fibroblastos BJ, IMR-90 ou U2OS) para utilizá-los como controles positivos e negativos. Utilize novos lysates de controlo sempre que o ensaio for efectuado para garantir a reprodutibilidade do ensaio.
Nota: recomenda-se que uma grande cultura de células telomerase-negativas é cultivada e aliquotada antes do congelamento para remover quaisquer artefatos relacionados à cultura do tecido que podem ser introduzidos durante a cultura de longo prazo das linhas celulares para ajudar a garantir resultados reprodutíveis de a amostra de controle negativo. - Coloque as pelotas de células no gelo. Se as células estivessem congeladas, deixe-as descongelar brevemente no gelo.
Nota: os tamanhos típicos da pelota da pilha para o ddTRAP estão entre 500.000 e 1 milhão pilhas. As pelotas menores da pilha podem igualmente ser usadas se necessário, mas o número da pilha deve/idealmente deve ser sabido. O ddTRAP pode igualmente ser executado baseado na entrada da proteína usando um ensaio da proteína de BCA (a entrada é geralmente 1 μg).
- Descongelar uma alíquota congelada de tampão de Lise NP-40. Uma vez descongelado, coloque o tampão de Lise no gelo. Adicionar fluoreto de fenilmetilsulfonila (inibidor da protease de PMSF) ao tampão de Lise NP-40 para atingir uma concentração final de 0,2 mM.
-
Lysing das pilhas
- Lyse as células no tampão de Lise NP-40. Manter uma equivalência celular de 25.000 células/μL de buffer. Por exemplo, lyse um pellet (contendo 1 milhão células) em 40 μL de tampão de Lise NP-40. Gentilmente pipeta o lisado para cima e para baixo, a fim de quebrar as células abertas. Tente evitar fazer bolhas.
- Permitir que as células a lyse no gelo por 30 min. Certifique-se de vórtice suavemente o lisado para evitar clusters de restos de células de formação. Isso pode ser feito a cada 10 min e destina-se a manter o lisado uma mistura homogeneizada.
- Diluir o lisado celular (25.000 células/μL) 1:20 no tampão de Lise NP-40, tornando a nova célula equivalência 1.250 células/μL. Por exemplo, diluir 5 μL de lisado celular em 95 μL de tampão de Lise.
3. reação da extensão de telomerase
- Prepare uma mistura mestra (tabela 1) para a reação de extensão de telomerase (por reação).
Nota: é melhor preparar a mistura mestra de reação de extensão durante a lise da célula e armazená-la no gelo.- Pipet 48 μL da mistura mestra da extensão em cada tubo do PCR.
- Adicionar 2 μL do lisado diluído (1.250 células/μL) à reacção de extensão. O volume total deve agora ser 50 μL com uma equivalência celular final de 50 células/μL.
- Realize a reação de extensão da telomerase (tabela 2).
- Armazene os produtos da extensão do telomerase em 4 ° c por até 3 – 5 dias; no entanto, é ideal para usar os produtos de extensão dentro do primeiro 24 h.
4. configuração digital do PCR da gota
- Prepare uma mistura mestra (tabela 3) para o ddtrap (por reação).
Nota: uma vez que os reagentes estão à temperatura ambiente, não os coloc ou a mistura mestra no gelo. Colocando a mistura no gelo pode aumentar a viscosidade e levar à formação de gotas pobres. O polymerase do ADN no Supermix de ddPCR é um começo quente e deve ser estável na temperatura ambiente. A supermistura ddPCR pode ser armazenada a 4 ° c após um descongelamento inicial de-20 ° c.- Pipet 19,8 μL da mistura mestra de ddPCR em cada tubo do PCR.
- Adicionar 2,2 μL da reacção de extensão a cada tubo. Note que o volume total deve ser agora de 22 μL.
Nota: a quantidade total de amostra necessária para um ddTRAP é de 20 μL (equivalência celular de células 100). O volume extra é uma precaução para o erro do pipeta ou a perda da amostra.
- Configure o cartucho de geração de gotas.
Nota: o cartucho contém três colunas diferentes de poços rotulados.- Carregar 20 μL da reacção preparada de acordo com o passo 4.1.2 para o poço da amostra (poço médio) no cartucho. Evite bolhas ao Pipetar a amostra.
Nota: se existirem bolhas, toque suavemente no lado do cartucho de modo a que estas bolhas venham para o topo da solução. - Carregar 70 μL de óleo de geração de gotas no poço de óleo (poço esquerdo).
Nota: a fim evitar a contaminação, use estritamente um jogo separado das pipetas e das pontas para etapas da geração da gota do ddPCR. A ordem de carregamento do cartucho é importante. A amostra deve ser carregada antes de carregar o óleo como o óleo é mais pesado e vai encher as câmaras microfluídicos e levar a formação de gotas pobres. O número mínimo de exemplos que podem ser executados é oito. Todos os poços do cartucho devem ser carregados com a amostra, pois qualquer poço vazio levará a uma parada na geração de gotas a partir do gerador de gotículas. Se não estiverem disponíveis amostras adequadas para carregar todos os oito poços dentro de um cartucho, 20 μL de mistura mestra ddTRAP (passo 4,1) podem ser carregados nos cartuchos restantes. - Fixe a junta no lugar, amarrando-o até as extremidades do cartucho.
Nota: a falta ou colocação inadequada da junta impedirá o gerador de gerar gotículas. - Coloque o cartucho carregado e montado no gerador de gotas.
Nota: o cartucho é reconhecido por um ímã no gerador, que informará o usuário quando o cartucho é coloc corretamente.
- Carregar 20 μL da reacção preparada de acordo com o passo 4.1.2 para o poço da amostra (poço médio) no cartucho. Evite bolhas ao Pipetar a amostra.
- Retire o cartucho uma vez que as gotas são geradas e o ciclo está completo (~ 60 – 90 s).
- Retire suavemente a junta do cartucho. Pipet as gotas recentemente geradas (direita bem), usando uma pipeta multicanal, em uma placa do PCR do 96-poço.
Nota: o volume aproximado para a emulsão de gota recém-gerada deve ser de 40 – 43 μL. - Aqueça a placa com selos da placa do PCR da folha de alumínio uma vez que todas as amostras são carregadas na placa do 96-well a fim impedir a evaporação durante as etapas do PCR.
- Retire suavemente a junta do cartucho. Pipet as gotas recentemente geradas (direita bem), usando uma pipeta multicanal, em uma placa do PCR do 96-poço.
- Coloque a placa de 96-poços no termocicreador e realize a seguinte reação de PCR (tabela 4).
Nota: todas as taxas de rampa entre as etapas da temperatura devem ser ajustadas a 2,5 ° c/s a fim aquecer corretamente as reações.
5. deteção de produtos da extensão do telomerase
- Coloque a placa de 96-poços no leitor de gotas.
Nota: Certifique-se de que orienta correctamente a placa de modo a que a amostra a1 corresponda com a do suporte.- Abra o software associado ao leitor de gotas. Clique duas vezes no primeiro bem a1 para abrir a tela de editor de amostra/poço.
- Clique em experimento e selecione ABS no menu suspenso.
Nota: o experimento define o tipo de ensaio a ser utilizado (i.e., quantificação absoluta ou ensaio de número de cópia gênica). ABS significa quantificação absoluta. - Selecione QX200 ddPCR Evagreen Supermix para garantir que o método de detecção correto seja empregado pelo leitor. Clique em aplicar no lado direito inferior da tela do editor de poços para salvar as configurações definidas pelo usuário em todos os poços destacados.
Nota: Supermix define o tipo de mistura de PCR e química de detecção que será lido pelo leitor. - Estale sobre o alvo na tela do editor do poço do software a fim definir a amostra.
- Defina o tipo de exemplo clicando no menu suspenso de destino e selecionando desconhecido, referênciaou NTC (controle no-template).
Nota: desconhecido se referiria a uma amostra experimental, a referência poderia ser uma amostra de controle da atividade telomerase conhecida, e um NTC é um controle crítico para a determinação da validade do ensaio em termos de contaminação e sinal de fundo. - Identifique todas as amostras na seção nome da amostra e clique em aplicar para garantir que os poços destacados sejam editados apropriadamente.
- Clique em executar para executar/ler a placa. Selecione colunas ou linhas na tela Opções de execução quando solicitado a informar a máquina sobre a orientação na qual a placa deve ser lida.
6. análise dos dados
- Determine o número de gotas aceitas para cada amostra clicando em poços individuais. Clique duas vezes os poços individuais ou cabeçalhos de coluna/linha para exibir e analisar os dados de exemplo.
Nota: os critérios mais importantes para se proceder ou não à análise de uma amostra específica é o número de "gotas aceites". Para o ddTRAP, amostras com 10.000 ou mais gotas aceitas são válidas para análise posterior. Os dados podem ser fornecidos ao usuário em muitos formatos, incluindo uma tabela. csv, imagens. jpg, histogramas, etc. Há muitos recursos disponíveis para a análise aprofundada de dados ddpcr, incluindo o ddtrap11,12. Esses recursos oferecem um guia para analisar os dados do ddtrap, desde a seleção dos limiares11,12 até a escolha das amostras para posterior análise11,12, identificando falsos positivos e negativos13, e solução de problemas geral13. - Realce os poços que representam as réplicas de amostra e amostras de NTC. Analise as amostras em comparação com NTC ou linhas de controle negativas, como as células BJ (conforme listado acima na etapa 2.1.2).
- Defina manualmente o limite para as amostras clicando no ícone para definir limiares no canto inferior esquerdo da tela. Definir limiares para cada poço individual ou para vários poços de cada vez (recomendado).
Nota: se o fundo for detectado no NTC, pode ser subtraído de todas as outras amostras para ' normalizar ' o sinal e garantir que apenas o sinal positivo verdadeiro é analisado. Os valores de NTC são tipicamente na escala da molécula 0.2-1/μL para o sistema de amortecedor NP-40 da lise. Outros sistemas e componentes de buffer precisam ser testados (por exemplo, buffers de CHAPS).
- Defina manualmente o limite para as amostras clicando no ícone para definir limiares no canto inferior esquerdo da tela. Definir limiares para cada poço individual ou para vários poços de cada vez (recomendado).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando o ddtrap, a atividade da telomerase foi medida em um painel da pilha que consiste nas seguintes linhas de pilha (Figura 1): cancro de pulmão da pilha CPNPC (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, e H2887), cancro de pulmão pequeno da pilha (H82 e SHP77), e telomerase-negativo fibroblastos (BJ). 1 milhão pelotas de células foram lisadas em tampão NP-40, e as reações de extensão de telomerase foram realizadas em triplicatos biológicos. Um controle negativo comum e altamente recomendado é o "NTC", o controle sem modelo. Esta amostra é gerada adicionando o tampão NP-40 da lise (2 μL) à reação da extensão do telomerase e prosseguindo com os produtos da extensão em uma maneira idêntica a outras amostras que contêm o lysate real da pilha. Este exemplo permite ao usuário subtrair o sinal de fundo, se houver, para melhor quantificar a atividade de telomerase. Embora não seja mostrada nesta figura, é igualmente possível aquecer desativar o lisado em 95 ° C por 5 minutos antes da reação da extensão do telomerase como um outro controle negativo. Este controle negativo é preferível se a abundância de célula/amostra não é um problema.
Medindo-se a intensidade de fluorescência de cada gota na emulsão de gotas, o leitor de gotas foi capaz de estimar a concentração de moléculas de entrada (moléculas/microlitro) utilizando a distribuição de Poisson (Figura 1a). No caso do ddTRAP, essas moléculas de entrada eram produtos de extensão de telomerase. O mecanismo do ensaio ddTRAP foi o seguinte: telomerase estendeu o substrato TS. Estes substratos estendidos actuaram como os moldes do PCR no ddPCR. A quantificação dos substratos PCR-amplificados forneceu uma representação da atividade enzimática da telomerase dentro de uma determinada linha celular. Cada gota foi plotada como mostrado na Figura 1a. Definir o limite para um ddTRAP pode ser subjetivo; no entanto, com os controles negativos adequados, o usuário pode facilmente fazê-lo. No exemplo mostrado na Figura 1a, um limiar foi definido para todas as três repetições biológicas para SHP77, H2887 e NTC. As gotas positivas tiveram uma intensidade da fluorescência em torno da amplitude da fluorescência do 6.000 (FA) e formaram uma população desobstruída na parte superior e separaram das gotas negativas em torno de 1.100 FA. Portanto, o limite pode ser definido em ~ 2.000 FA neste experimento.
Uma vez que os dados foram coletados e exportados, foi possível calcular o total de produtos de extensão de telomerase por célula equivalente entre todas as amostras (Figura 1b). O sinal de cada poço era uma concentração absoluta (moléculas/microlitro). Multiplicando a concentração por 20 (volume de entrada da amostra em cartuchos ddPCR), o usuário pode obter o número total de moléculas. Este número pode então ser dividido pelo equivalente da pilha conhecida (em nosso desempenho do ddTRAP, nós usamos 100 pilhas). Este valor final está nas unidades de produtos de extensão de telomerase por célula equivalente, como mostrado no eixo y.
Figura 1: atividade de telomerase em um painel de câncer de pulmão. (A) a amplitude 1D da intensidade da fluorescência da gota (amplitude da fluorescência) para SHP77, H2887, e NTC. Os poços para SHP77, H2887 e NTC foram selecionados e um limiar manual foi fixado em 2.000 FA. (B) a atividade de telomerase foi estimada a partir da concentração medida dos ácidos nucleicos detectados após PCR e plotados para comparar a atividade de telomerase em linhas de câncer de pulmão. FA = unidades de amplitude de fluorescência. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A medida da atividade da telomerase é crítica a uma pletora de tópicos da pesquisa que incluem, mas não limitado a, cancro, biologia do telomere, envelhecimento, medicina regenerativa, e projeto estrutura-baseado da droga. Telomerase RNPs são de baixa abundância, mesmo em células cancerosas, fazendo a detecção e estudo desta enzima desafiador. Neste artigo, nós descrevemos os procedimentos passo a passo para o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP para quantificar robustamente a atividade do telomerase nas pilhas. Combinando a reação de extensão tradicional do telomerase com ddpcr, nós pudemos detectar quantitativamente a atividade do telomerase (telomerase-produtos estendidos) em pilhas de cancro do pulmão.
O ensaio ddTRAP baseia-se na mesma teoria que o ensaio TRAP. Os lisados da pilha são obtidos por lisar pilhas em um amortecedor do lysis do detergente nonionic (NP-40) para manter a atividade de enzima e usado então para executar uma reação da extensão do telomerase do "TS" substrato/primer. A novidade do ddTRAP baseia-se na formação de gotas antes da PCR. O particionamento da amostra em gotas permite que o ensaio obtenha quantificação absoluta da atividade de telomerase por célula.
A atividade da telomerase foi medida em linhagens celulares de câncer de pulmão, utilizando o ddTRAP. Uma das principais limitações do ensaio TRAP baseado em gel é o número de amostras que podem ser processadas de cada vez. A maioria dos pentes de gel só pode acomodar até 20 poços/amostras. Por outro lado, o ddTRAP pode executar até 96 amostras de cada vez, aumentando significativamente o número de amostras que podem ser processadas de uma só vez. Nós ensaiamos a atividade de telomerase em oito linhas celulares. O mais importante, nós executamos cada reação da extensão do telomerase em triplicatas biológicos para um total de 24 reações da extensão. Nós pudemos então executar cada reação da extensão como três réplicas técnicas para o PCR para um total de 72 amostras na placa do ddPCR. Além disso, o ensaio de ddtrap fornece resultados reprodutíveis com um CV interdia (coeficiente de variação) de 5,1% para 100 equivalentes da pilha e um CV intraday de 8,61% para 100 equivalentes da pilha. Interday e intraday representam repetições biológicas executadas em duas placas diferentes ou a mesma placa, respectivamente, em lysates da pilha de HeLa11. Se 72 amostras foram processadas na armadilha tradicional ou qualquer outro ensaio baseado em gel, que exigiria muito mais hands-on tempo. Isso leva a custos mais elevados de reagentes, tempo mais valioso necessário de funcionários/alunos/estagiários, uma maior variabilidade gel-gel, e uma falta de reprodutibilidade entre usuários e laboratórios. A capacidade de executar réplicas de forma confiável e fácil no ddTRAP é uma melhoria dramática em relação aos ensaios baseados em gel e permite que muitas outras amostras sejam processadas eficientemente, o que auxilia na análise estatística dos dados.
Por fim, menos variabilidade entre as amostras em geral no ddTRAP e a possibilidade de realizar as repetições necessárias permite que os usuários observem menos de duas alterações entre as amostras. A maior limitação da maioria dos ensaios baseados em gel é a falta de quantificação adequada. Aqui, usando o ddTRAP, podemos detectar as diferenças sutis entre as várias linhas de câncer de pulmão. As diferenças sutis podem ser críticas quando se trata de comparar drogas visando a atividade de telomerase e decidir se deve ou não avançar com compostos de moléculas pequenas de telas de alta taxa de transferência.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer fontes de financiamento dos institutos nacionais de saúde (NIH) (NCI-r00-CA197672-01A1). As linhas de câncer de pulmão de pequenas células (SHP77 e H82) foram um presente generoso dos Drs. John Minna e Adi Gazdar do UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
