Summary
Vi klarte å konvertere standard telomere gjenta forsterkning protokollen (TRAP) analysen skal benyttes i dråpe Digital polymerase kjedereaksjoner. Denne ny analysen, alarmert ddTRAP, er flere følsom og kvantitativ, tillater for bedre oppdagelsen og statistisk analyse av telomerase aktivitet innen forskjellige Human celler.
Abstract
Den telomere gjenta forsterkning protokollen (TRAP) er den mest brukte analysen for å oppdage telomerase aktivitet innenfor en gitt en prøve. Den polymerase kjedere reaksjonen (PCR)-baserte metoden gjør det mulig for robuste målinger av enzym aktivitet fra de fleste celle lysater. Den gel-baserte TRAP med fluorescensmerkete merket primere begrenser sample gjennomstrømning, og evnen til å oppdage forskjeller i prøvene er begrenset til to fold eller større endringer i enzym aktivitet. Dråpe Digital TRAP, ddTRAP, er en svært følsom tilnærming som har blitt modifisert fra den tradisjonelle TRAP analysen, slik at brukeren kan utføre en robust analyse på 96 prøver per kjøre og få absolutt kvantifisering av DNA (telomerase forlengelse produkter ) inn data i hver PCR. Den nyutviklede ddTRAP-analysen overvinner derfor begrensningene til den tradisjonelle gel-baserte TRAP-analysen og gir en mer effektiv, nøyaktig og kvantitativ tilnærming til måling av telomerase aktivitet innenfor laboratorie-og kliniske miljøer.
Introduction
Telomerer er dynamiske DNA-protein komplekser i endene av lineære kromosomer. Human telomerer er sammensatt av et utvalg av 5 '-TTAGGGn hexameric repetisjoner som varierer i lengde mellom 12-15 kilobases (KB) ved fødselen1. Human telomerase, den ribonucleoprotein enzym som opprettholder telomerer, ble først identifisert i HeLa celle lysater (kreftcelle linje)2. Sammen telomerer og telomerase spille en viktig rolle i et spekter av biologiske prosesser som Genova beskyttelse, gen regulering, og kreftcelle udødelighet3,4,5,6.
Human telomerase består hovedsakelig av to viktige komponenter, nemlig telomerase Reverse transkriptase og telomerase RNA (hTERT og hTERC, henholdsvis). Proteinet delenhet, hTERT, er katalytisk aktiv revers transkriptase komponent av telomerase enzymet. RNA-malen, hTERC, gir telomerase med malen for å utvide og/eller vedlikeholde telomerer. De fleste menneskelige somatiske vev har ingen synlig telomerase aktivitet. Manglende evne til DNA polymerase å forlenge slutten av henger strand av DNA sammen med mangelen på telomerase fører til progressiv forkortelse av telomerer etter hver runde av cellulære divisjon. Disse fenomener føre til telomere forkortelse i de fleste somatiske celler til de når en kritisk forkortet lengde, der cellene inn i en tilstand av replicative senescence. Maksimalt antall ganger en celle kan dele er diktert av sin telomere lengde og denne blokken til fortsatt celledeling antas å hindre progresjon til oncogenesis7. Kreftceller er i stand til å overvinne telomere-indusert replicative senescence og fortsette å spre ved å utnytte telomerase å opprettholde sin telomerer. Ca 90% av kreft aktivere telomerase, noe som gjør telomerase aktivitet kritisk viktig i både kreft deteksjon og behandling.
Utviklingen av TRAP-analysen på 1990-tallet var medvirkende til identifisering av de nødvendige komponentene av telomerase enzym, så vel som for måling av telomerase i et bredt spekter av celler og vev, både normal og kreft. Den opprinnelige gel-baserte PCR-analysen brukte radioaktivt merket DNA-underlag for å oppdage telomerase aktivitet. I 2006 ble analysen tilpasset en radioaktivt form ved hjelp av fluorescensmerkete merket underlag8,9. Ved å bruke fluorescensmerkete merket underlag, brukerne var i stand til å visualisere telomerase forlengelse produkter som band på en gel ved å utsette det til riktig eksitasjon bølgelengde. Følsomheten av TRAP analysen og dens evne til å oppdage telomerase aktivitet i råolje celle lysater har gjort denne analysen den mest brukte metoden for telomerase aktivitet deteksjon. Imidlertid har TRAP-analysen begrensninger. Analysen er gel-basert, noe som gjør det vanskelig å utføre de nødvendige replikerer i moderat til høy gjennomstrømming studier, og dermed riktig statistisk analyse er sjelden oppnådd. Videre er gel-basert analysen vanskelig å kvantifisere pålitelig på grunn av manglende evne til å oppdage mindre enn todelt forskjeller i telomerase aktivitet mellom prøvene. Overvinne disse to begrensningene er avgjørende for enzymatisk aktivitet analyser som TRAP å flytte til kliniske eller industri innstillinger for påvisning av telomerase aktivitet i pasientprøver eller narkotika design studier.
Digital PCR ble opprinnelig utviklet i 1999 som et middel til å konvertere den eksplosive og analoge karakteren til PCR til en lineær og digital analyse10. Dråpe Digital PCR (ddPCR) er den nyeste innovasjonen av den opprinnelige digitale PCR-metodikken. Dråpe Digital PCR kom med bruk av avansert materialer og olje-i-vann emulsjon kjemi for å pålitelig generere stabile og like store dråper. I motsetning til gel-basert og selv kvantitativ PCR (qPCR), ddPCR genererer absolutt kvantifisering av input materiale. Nøkkelen til ddPCR er generering av ~ 20 000 individuelle reaksjoner ved å partisjonere prøvene i dråper. Etter ende punkts PCR, skanner dråpe leseren hver dråpe i en Flow-flowcytometer mote, telling, dimensjonering, og registrerer tilstedeværelsen eller fraværet av fluorescens i hvert enkelt dråpe (dvs. fravær eller tilstedeværelsen av PCR-amplicons i hver dråpe). Deretter, ved hjelp av Poisson-fordelingen, anslås inn data molekyler basert på forholdet mellom positive dråper og totalt antall dråper. Dette tallet representerer et anslag over antall inn data molekyler i hver PCR. Videre er ddPCR utført og analysert på en 96-brønn plate som gjør det mulig for brukeren å kjøre mange prøver, samt utføre biologiske og tekniske replikerer for riktig statistisk analyse. Som et resultat, har vi kombinert den kraftige kvantifisering og moderat gjennomstrømming natur ddPCR med TRAP analysen å utvikle ddTRAP analysen11. Denne analysen er utformet for brukere å studere og robust kvantifisere absolutt telomerase aktivitet fra biologiske prøver11,12. Følsomheten til ddTRAP tillater kvantifisering av telomerase aktivitet fra begrensede og dyrebare prøver, inkludert enkelt celle målinger. Videre, brukernes kanne likeledes studere effektene av telomerase manipulasjoner og/eller medikamenter med absolutt kvantifisering av mindre enn todelt endre (~ 50% forskjellene). Den ddTRAP er den naturlige utviklingen av TRAP analysen i den digitale og høyere gjennomstrømming natur moderne laboratorieeksperimenter og kliniske innstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. buffer klargjøring og lagring
- Forbered 50 mL av 1x lager RNase-/DNase-free NP-40 lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1% [Vol/Vol] NP-40, 10% [Vol/Vol] glyserol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoethanol, og 0,1 mm 4- benzenesulfonyl fluor hydrochloride (AEBSF)). Denne bufferen kan aliquoted og oppbevares ved-20 ° c for fremtidig bruk. Unngå fryse/tine sykluser for å oppnå en optimal lyse celler.
- Forbered 50 mL 10x lager RNase-/DNase-free FELLE forlengelse buffer (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm KCl, 0,5% [Vol/Vol] mellom 20, og 10 mm etylen glykol-BIS (β-aminoethyl Eter)-N, N, n ', N′-Tetraacetic acid (EGTA)). Denne bufferen kan aliquoted i 1 mL alikvoter og oppbevares ved-20 ° c for fremtidig bruk.
2. cellelyse
-
Utarbeidelse av cellene
- Tine en frossen alikvot av NP-40 lyseringsbuffer. Når tint, plasser lyseringsbufferen på isen. Tilsett phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF protease inhibitor) til NP-40 lyseringsbuffer for å nå en endelig konsentrasjon på 0,2 mM.
Merk: Dette bør gjøres umiddelbart før lysering cellene. - Fjern eventuell overflødig væske fra de innsamlede celle pellets for å sikre en tørr celle pellet. Vær oppmerksom på at celle pellets, enten den er fersk innsamlet eller tidligere frosset (-80 ° c eller blits frosset i flytende N2), ikke må inneholde rester av løsninger fra tidligere centrifugations da disse løsningene kan forstyrre nedstrøms prosedyrer.
- Vokse, samle og fryse både telomerase-positive og telomerase cellelinjer (BJ fibroblaster, HAVFORSKNINGSINSTITUTTET-90 eller U2OS) for å bruke dem som positive og negative kontroller. Bruk ny kontroll lysater hver gang analysen er utført for å sikre analysen reproduserbarhet.
Merk: det anbefales at en stor kultur av telomerase celler dyrkes og aliquoted før frysing for å fjerne eventuelle vev-kultur-relaterte gjenstander som kan innføres under den langsiktige kulturen i cellelinjer for å sikre reproduserbar resultater av prøven for negativ kontroll. - Plasser celle pellets på isen. Hvis cellene var frosset, la dem tine kort på isen.
Merk: typiske celle pellet størrelser for ddTRAP er mellom 500 000 og 1 000 000 celler. Mindre celle pellets kan også brukes om nødvendig, men celle nummeret må/ideelt sett bør være kjent. Den ddTRAP kan også utføres basert på protein innspill ved hjelp av en BCA protein analysen (input er vanligvis 1 μg).
- Tine en frossen alikvot av NP-40 lyseringsbuffer. Når tint, plasser lyseringsbufferen på isen. Tilsett phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF protease inhibitor) til NP-40 lyseringsbuffer for å nå en endelig konsentrasjon på 0,2 mM.
-
Lysering av cellene
- Lyse cellene i den NP-40 lyseringsbufferen. Oppretthold en celle likhet med 25 000 celler/μL av buffer. For eksempel, lyse en pellet (inneholdende 1 000 000 celler) i 40 μL av NP-40 lyseringsbuffer. Pipet forsiktig lysat opp og ned for å bryte åpne cellene. Prøv å unngå å lage bobler.
- La cellene lyse på isen i 30 minutter. Sørg for å forsiktig Vortex lysat for å hindre at klynger av celle rusk dannes. Dette kan gjøres hver 10 min og er ment å holde lysat en homogenisert blanding.
- Fortynne celle lysat (25 000 celler/μL) 1:20 i NP-40 lyseringsbuffer, noe som gjør den nye cellen likeverdig 1 250 celler/μL. For eksempel fortynne 5 μL av celle lysat til 95 μL av lyseringsbuffer.
3. Telomerase forlengelse reaksjon
- Forbered en Master mix (tabell 1) for telomerase forlengelse reaksjon (per reaksjon).
Merk: det er best å klargjøre Master blandingen av forlengelses reaksjonen under cellelyse og lagre den på is.- Pipet 48 μL av forlengelses Master mix i hvert PCR-rør.
- Tilsett 2 μL av fortynnet (1 250 celler/μL) lysat til forlengelses reaksjonen. Det totale volumet skal nå være 50 μL med en endelig celle likhet med 50 celler/μL.
- Utfør telomerase forlengelses reaksjon (tabell 2).
- Oppbevar telomerase forlengelses produkter ved 4 ° c i inntil 3 – 5 dager; Det er imidlertid optimalt å bruke forlengelses produkter innen de første 24 h.
4. dråpe Digital PCR oppsett
- Forbered en Master mix (tabell 3) for ddTRAP (per reaksjon).
Merk: Når reagensene er i romtemperatur, ikke plasser dem eller Master Mix på isen. Plassering av Mix på isen kan øke viskositet og føre til dårlig dråpe dannelse. DNA-polymerase i ddPCR-Supermix er en Varmstart og bør være stabil ved romtemperatur. DdPCR-Supermix kan oppbevares ved 4 ° c etter en første tine fra-20 ° c.- Pipet 19,8 μL av ddPCR Master mix i hvert PCR-rør.
- Tilsett 2,2 μL av forlengelses reaksjonen på hvert rør. Merk at det totale volumet skal nå være 22 μL.
Merk: den totale mengden av prøven som trengs for en ddTRAP er 20 μL (celle likhet i 100 celler). Det ekstra volumet er en forholdsregel for Pipet feil eller tap av prøver.
- Sett opp kassetten for dråpe generering.
Merk: patronen inneholder tre forskjellige kolonner av brønner som er merket.- Last 20 μL av reaksjonen fremstilt i henhold til trinn 4.1.2 i prøve brønnen (midtre brønn) i kassetten. Unngå bobler når prøven pipettering.
Merk: Hvis det er bobler, trykk forsiktig på siden av kassetten slik at disse boblene kommer til toppen av løsningen. - Legg 70 μL av dråpe olje i olje brønnen (venstre brønn).
Merk: for å unngå kontaminering må du strengt bruke et separat sett med Pipetter og spisser for generering av ddPCR dråpe trinn. Rekkefølgen på lasting av kassetten er viktig. Prøven må være lastet før lasting olje som olje er tyngre og vil fylle mikrovæskebasert kamre og føre til dårlig dråpe dannelse. Det minste antallet prøver som kan kjøres, er åtte. Alle brønner av kassetten må være lastet med prøven som en tom brønn vil føre til en stans i dråpe generering fra dråpe generatoren. Hvis tilstrekkelige prøver ikke er tilgjengelige for å laste alle åtte brønner i en patron, kan 20 μL av ddTRAP Master mix (trinn 4,1) lastes inn i de resterende patronene. - Fest pakningen på plass ved å tethering den til endene av kassetten.
Merk: mangelen eller uriktig plassering av pakningen vil hindre generatoren fra å generere dråper. - Sett den lastede og monterte kassetten inn i dråpe generatoren.
Merk: patronen gjenkjennes av en magnet i generatoren, som vil informere brukeren når patronen er plassert riktig.
- Last 20 μL av reaksjonen fremstilt i henhold til trinn 4.1.2 i prøve brønnen (midtre brønn) i kassetten. Unngå bobler når prøven pipettering.
- Fjern patronen når dråpene er generert og syklusen er fullført (~ 60-90 s).
- Fjern forsiktig pakningen fra patronen. Pipet den nylig genererte dråper (riktig brønn), ved hjelp av en flerkanals pipette, i en 96-brønn PCR-plate.
Merk: omtrentlig volum for den nylig genererte dråpe emulsjon skal være 40 – 43 μL. - Heat forsegle platen med aluminiumsfolie PCR plate sel når alle prøvene er lagt i 96-brønn plate for å hindre fordampning under PCR trinn.
- Fjern forsiktig pakningen fra patronen. Pipet den nylig genererte dråper (riktig brønn), ved hjelp av en flerkanals pipette, i en 96-brønn PCR-plate.
- Legg 96 brønn platen inn i thermocycler og utfør følgende PCR-reaksjon (Tabell 4).
Merk: alle rampe hastigheter mellom temperatur trinnene må stilles inn til 2,5 ° c/s for å varme opp reaksjonene.
5. påvisning av telomerase forlengelse produkter
- Legg i 96 brønn platen i dråpe leseren.
Merk: Sørg for å orientere platen riktig slik at a1 -prøven samsvarer med holderen.- Åpne programvaren som er knyttet til dråpe leseren. Dobbeltklikk på den første brønnen a1 for å åpne prøve-og brønn redigeringsskjermen.
- Klikk på eksperimenter , og velg ABS fra rullegardinmenyen.
Merk: eksperiment definerer typen analysen som skal brukes (dvs. absolutt kvantifisering eller gen kopi nummer analysen). ABS står for absolutt kvantifisering. - Velg QX200 DdPCR Evagreen Supermix for å sikre at den korrekte gjenkjennings metoden er ansatt av leseren. Klikk Påfør i nedre høyre side av brønn Editor skjermen for å lagre de brukerdefinerte innstillingene til alle de markerte brønnene.
Merk: SUPERMIX DEFINERER typen PCR mix og deteksjon kjemi som vil bli lest av leseren. - Klikk på mål i brønnen redaktør skjermen av programvaren for å definere prøven.
- Definer typen prøve ved å klikke på rullegardinmenyen mål og velge enten Ukjent, Referanseeller NTC (ingen mal kontroll).
Merk: Ukjent ville referere til en eksperimentell prøve, Referanse kan være en kontroll prøve av kjente telomerase aktivitet, og en NTC er en kritisk kontroll for fastsettelse av analysen gyldighet i form av forurensning og bakgrunns signal. - Merk alle eksemplene i eksempel navn -delen, og klikk på Bruk for å sikre at de uthevede brønnene redigeres på riktig måte.
- Klikk på Kjør for å kjøre/lese platen. Velg enten kolonner eller rader i skjermbildet for kjøre alternativer når du blir bedt om å informere maskinen om retningen platen skal leses i.
6. data analyse
- Bestem antall godkjente dråper for hvert utvalg ved å klikke på de enkelte brønnene. Dobbeltklikk de enkelte brønnene eller Kol onne-eller radoverskriftene for å vise og analysere eksempeldataene.
Merk: de viktigste kriteriene på om ikke å fortsette med analysen av en bestemt prøve er antall "akseptert dråper". For ddTRAP er prøver med 10 000 eller flere godtatte dråper gyldige for videre analyse. Data kan gis til brukeren i mange formater, inkludert en CSV-tabell, jpg-bilder, histogrammer osv. Det finnes mange tilgjengelige ressurser for den detaljerte analysen av ddPCR data, inkludert ddTRAP11,13. Disse ressursene tilbyr en guide til å analysere ddTRAP data, fra å velge terskler11,13 for å velge prøver for videre analyse11,13, identifisere falske positiver og negativer13, og generell feilsøking13. - Fremhev brønnene som representerer eksempel replikerer og NTC-prøver. Analyser prøvene i forhold til enten NTC eller negative kontroll linjer, for eksempel BJ-celler (som nevnt ovenfor i trinn 2.1.2).
- Angi terskelverdien for prøvene manuelt ved å klikke på ikonet for å angi terskler nederst til venstre på skjermen. Angi terskler for hver enkelt brønn eller for flere brønner om gangen (anbefales).
Merk: Hvis bakgrunnen er oppdaget i NTC, kan det trekkes fra alle de andre prøvene å "normalisere" signalet og sikre at bare det sanne positive signalet analyseres. NTC 40-verdiene er vanligvis i området 0,2 – 1 molekyl/μL for Andre buffer systemer og-komponenter må testes (for eksempel "KARER"-buffere).
- Angi terskelverdien for prøvene manuelt ved å klikke på ikonet for å angi terskler nederst til venstre på skjermen. Angi terskler for hver enkelt brønn eller for flere brønner om gangen (anbefales).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av ddTRAP ble telomerase aktivitet målt i et celle panel bestående av følgende cellelinjer (figur 1): nonsmall celle lungekreft (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 og H2887), liten celle lungekreft (H82 og SHP77), og telomerase-negativ fibroblaster (BJ). 1 000 000 celle pellets ble lysert i NP-40 buffer, og telomerase forlengelses reaksjoner ble utført i biologiske triplicates. En vanlig og sterkt anbefalt negativ kontroll er "NTC", den no-mal kontroll. Denne prøven genereres ved å tilsette NP-40 lyseringsbuffer (2 μL) til telomerase forlengelses reaksjon og fortsette med forlengelses produktene på samme måte som andre prøver som inneholder faktiske celle lysat. Dette eksemplet gjør det mulig for brukeren å trekke fra bakgrunns signalet, hvis det finnes, for å bedre kvantifisere den telomerase aktiviteten. Selv om det ikke vises i dette tallet, er det også mulig å varme deaktivere lysat ved 95 ° C i 5 min før telomerase forlengelsen reaksjonen som en annen negativ kontroll. Denne negative kontrollen foretrekkes hvis cellen/prøve overflod ikke er et problem.
Ved å måle den fluorescens intensiteten til hver eneste dråpe i dråpe emulsjon, var dråpe leseren i stand til å anslå konsentrasjonen av inn data molekyler (molekyler/mikroliter) ved hjelp av Poisson-fordelingen (figur 1a). I tilfelle av ddTRAP, disse input molekyler var telomerase forlengelse produkter. Mekanismen for ddTRAP analysen var som følger: telomerase utvidet TS substrat. Disse utvidede underlag fungerte som PCR-malene i ddPCR. Kvantifisering av PCR-forsterket underlag gitt en representasjon av telomerase enzymatisk aktivitet innenfor en gitt cellelinje. Hver dråpe ble plottet som vist i figur 1a. Innstilling av terskelen for en ddTRAP kan være subjektiv; men med de riktige negative kontrollene, kan brukeren enkelt gjøre det. I eksempelet vist i figur 1a, ble det satt en terskel for alle tre biologiske REPLIKERER for SHP77, H2887 og NTC. Positive dråper hadde en fluorescens intensitet rundt 6 000 fluorescens amplitude (FA) og dannet en klar befolkning på toppen og atskilt fra negative dråper rundt 1 100 FA. Terskelen kan derfor settes til ~ 2 000 FA i dette eksperimentet.
Når dataene ble samlet inn og eksportert, var det mulig å beregne de totale telomerase forlengelses produkter per celle ekvivalent mellom alle prøvene (figur 1B). Signalet fra hver brønn var en absolutt konsentrasjon (molekyler/mikroliter). Ved å multiplisere konsentrasjonen med 20 (input volum av prøven i ddPCR patroner), kan brukeren få det totale antall molekyler. Dette nummeret kan deretter deles av den kjente celle ekvivalent (i vår utførelse av ddTRAP, brukte vi 100 celler). Denne endelige verdien er i enheter av telomerase forlengelses produkter per celle ekvivalent som vist på y-aksen.
Figur 1: Telomerase aktivitet i et lungekreft panel. (A) den 1d amplitude av dråpe fluorescens intensitet (fluorescens amplitude) for SHP77, H2887, og NTC. Brønner for SHP77, H2887 og NTC ble valgt og en manuell terskel ble satt til 2 000 FA. (B) Telomerase aktivitet ble estimert fra den målte konsentrasjonen av nukleinsyre syrer detektert etter PCR og plottet for å sammenligne Telomerase aktivitet i lungekreft linjer. FA = fluorescens amplitude enheter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målingen av telomerase aktivitet er avgjørende for en mengde forsknings temaer, inkludert, men ikke begrenset til, kreft, telomere biologi, aldring, regenererende medisin og struktur BAS ert legemiddel design. Telomerase RNPs er lave rikelig, selv i kreftceller, noe som gjør oppdagelsen og studiet av dette enzymet utfordrende. I denne utredningen, beskrev vi trinn-for-trinn prosedyrer for den nyutviklede ddTRAP analysen til robust kvantifisere telomerase aktivitet i cellene. Ved å kombinere den tradisjonelle telomerase forlengelse reaksjon med ddPCR, kunne vi kvantitativt oppdage telomerase aktivitet (telomerase-Extended produkter) i lungekreftceller.
Den ddTRAP analysen er avhengig av samme teori som TRAP analysen. Cell lysater oppnås ved lysering celler i en ioniske vaskemiddel (NP-40) lyseringsbuffer for å opprettholde enzym aktivitet og deretter brukes til å utføre en telomerase forlengelse reaksjon av "TS" substrat/primer. Nyheten av ddTRAP er avhengig av dannelsen av dråper før PCR. Den partisjonering av prøven i dråper gjør at analysen for å oppnå absolutt kvantifisering av telomerase aktivitet per celle.
Telomerase aktivitet ble målt i lungekreft cellelinjer, ved hjelp av ddTRAP. En av de viktigste begrensningene i gel-baserte TRAP analysen er antall prøver som kan behandles om gangen. De fleste gel kammer kan bare romme opp til 20 brønner/prøver. I kontrast, ddTRAP kan kjøre opp til 96 prøver om gangen, betydelig øke antall prøver som kan behandles på en gang. Vi analyseres telomerase aktivitet i åtte cellelinjer. Viktigst, vi kjørte hver telomerase forlengelse reaksjon i biologiske triplicates for totalt 24 forlengelse reaksjoner. Deretter kunne vi kjøre hver Utvidelses reaksjon som tre tekniske replikerer for PCR for totalt 72 prøver på ddPCR-platen. Videre, den ddTRAP analysen gir reproduserbar resultater med en interday CV (koeffisient av variasjon) på 5,1% for 100 celle ekvivalenter og en intradag CV på 8,61% for 100 celle ekvivalenter. Interday og intradag representerer biologiske replikerer kjøres på to forskjellige plater eller samme plate, henholdsvis på HeLa celle lysater11. Hvis 72 prøvene ble behandlet i den tradisjonelle TRAP eller andre gel-baserte analysen, ville det kreve mye mer hands-on tid. Dette fører til høyere kostnader for reagenser, mer verdifull tid fra ansatte/studenter/lærlinger, en høyere gel-til-gel-variasjon og mangel på reproduserbarhet mellom brukere og laboratorier. Evnen til pålitelig og enkelt å kjøre replikerer i ddTRAP er en dramatisk forbedring over gel-baserte analyser og gjør at mange flere prøver å bli behandlet effektivt, noe som hjelpemidler i statistisk analyse av dataene.
Til slutt, mindre variasjon mellom prøvene generelt i ddTRAP og muligheten til å utføre de nødvendige replikerer tillater brukere å observere mindre enn todelt endringer mellom prøvene. Den store begrensningen av de fleste gel-baserte analyser er mangelen på skikkelig kvantifisering. Her, ved hjelp av ddTRAP, kan vi oppdage de subtile forskjellene mellom de ulike lungekreft linjer. De subtile forskjellene kan være avgjørende når det gjelder å sammenligne narkotika målretting telomerase aktivitet og avgjøre om ikke å gå videre med små molekyl forbindelser fra høy gjennomstrømming skjermer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne erkjenne finansieringskilder fra National Institutes of Health (NIH) (NCI-r00-CA197672-01A1). Små celle lungekreft linjer (SHP77 og H82) var en generøs gave fra DRS. John Minna og Adi Gazdar fra UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
