Druppel digitale val (ddTRAP): aanpassing van de Telomere Herhaal versterking protocol aan druppel digitale polymerase kettingreactie

Summary

We hebben met succes omgezet de standaard Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) assay te worden gebruikt in druppel digitale polymerase chain reacties. Deze nieuwe Assay, genaamd ddTRAP, is gevoeliger en kwantitatieve, waardoor een betere opsporing en statistische analyse van telomerase activiteit binnen verschillende menselijke cellen.

Abstract

De Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) is de meest gebruikte assay om telomerase activiteit te detecteren binnen een gegeven een monster. De polymerase kettingreactie (PCR)-gebaseerde methode staat voor robuuste metingen van enzymactiviteit van de meeste cel lysaten toe. De op gel-gebaseerde val met fluorescently geëtiketteerde inleidingen beperkt steekproef productie, en de capaciteit om verschillen in steekproeven te ontdekken is beperkt tot twee vouwen of grotere veranderingen in enzymactiviteit. De druppel digitale val, ddTRAP, is een zeer gevoelige benadering die is gewijzigd van de traditionele val Assay, waardoor de gebruiker een robuuste analyse uit te voeren op 96 monsters per run en het verkrijgen van absolute kwantificering van het DNA (telomerase extension producten ) input binnen elke PCR. Daarom is de nieuw ontwikkelde ddTRAP assay overwint de beperkingen van de traditionele gel-based TRAP assay en biedt een meer efficiënte, accurate en kwantitatieve benadering van het meten van telomerase activiteit binnen laboratorium en klinische instellingen.

Introduction

Telomeren zijn dynamische DNA-eiwitcomplexen aan de uiteinden van lineaire chromosomen. Menselijke telomeren zijn samengesteld uit een array van 5 '-TTAGGG_n hexameren herhalingen die variëren in lengte tussen 12-15 kilobases (KB) bij de geboorte¹. Human telomerase, de ribonucleoproteã enzym dat de telomeren handhaaft, werd voor het eerst geïdentificeerd in HeLa cel lysaten (kanker Cell line)². Samen spelen telomeren en telomerase een belangrijke rol in een spectrum van biologische processen zoals de bescherming van het genoom, gen regulatie, en kanker cel onsterfelijkheid^3,4,5,6.

Menselijke telomerase bestaat hoofdzakelijk uit twee belangrijke componenten, namelijk telomerase reverse transcriptase en telomerase RNA (respectievelijk hTERT en hTERC). De eiwit subeenheid, hTERT, is de katalytisch actieve omgekeerde transcriptase component van het telomerase enzym. De RNA template, hTERC, biedt telomerase met de sjabloon uit te breiden en/of te handhaven telomeren. De meeste menselijke somatische weefsels hebben geen detecteerbare telomerase activiteit. Het onvermogen van de polymerase van DNA om het eind van de achtergebleven bundel van DNA samen met het gebrek aan telomerase te verlengen leidt tot het progressieve verkorten van telomeren na elke ronde van cellulaire afdeling. Deze fenomenen leiden tot Telomere verkorting in de meeste somatische cellen tot zij een kritisch verkorte lengte bereiken, waardoor de cellen een staat van replicerende senescentie ingaan. Het maximale aantal keren dat een cel kan verdelen wordt gedicteerd door zijn Telomere lengte en dit blok aan voortdurende celdeling wordt gedacht om progressie te voorkomen tot oncogenese⁷. Kankercellen zijn in staat om Telomere-geïnduceerde replicerende senescentie te overwinnen en te blijven vermenigvuldigen door gebruik te maken van telomerase om hun telomeren te handhaven. Ongeveer 90% van de kankers te activeren telomerase, waardoor telomerase activiteit kritisch belangrijk in zowel de opsporing van kanker en behandeling.

De ontwikkeling van de val assay in de jaren 1990 was instrumenteel in de identificatie van de noodzakelijke componenten van het telomerase enzym, evenals voor de meting van telomerase in een breed scala van cellen en weefsels, zowel normaal als kanker. De originele op gel-gebaseerde PCR assay gebruikte radioactief geëtiketteerde de substraten van DNA om telomerase activiteit te ontdekken. In 2006, werd de analyse aangepast in een niet-radioactieve vorm gebruikend fluorescerend geëtiketteerde substraten^8,9. Door het gebruik van fluorescerende geëtiketteerde substraten, gebruikers in staat waren om de telomerase uitbreiding producten te visualiseren als bands op een gel door het blootstellen aan de juiste excitatie golflengte. De gevoeligheid van de val assay en de mogelijkheid om telomerase activiteit op te sporen in ruwe cel lysaten heeft deze assay de meest gebruikte methode voor telomerase activiteit detectie. Echter, de val assay heeft beperkingen. De assay is gel-based, waardoor het moeilijk is om de nodige replica's uit te voeren in matige tot high-throughput studies, en dus een goede statistische analyse is zelden bereikt. Bovendien is de gel-based assay moeilijk te kwantificeren betrouwbaar te wijten aan het onvermogen van het opsporen van minder dan tweeledige verschillen in telomerase activiteit tussen de monsters. Het overwinnen van deze twee beperkingen is van cruciaal belang voor enzymatische activiteit assays zoals de val te verhuizen naar klinische of industrie-instellingen voor de opsporing van telomerase activiteit in de patiënt monsters of drug design studies.

Digitale PCR werd aanvankelijk ontwikkeld in 1999 als middel om de exponentiële en analoge aard van PCR in een lineaire en digitale analyse¹⁰om te zetten. De digitale PCR van het druppeltje (ddPCR) is de recentste innovatie van de originele digitale PCR methodologie. De digitale PCR van het druppeltje kwam over met de komst van geavanceerde microfluidics en olie-in-water emulsie chemie om stabiele en even grote druppeltjes betrouwbaar te produceren. In tegenstelling tot gel-based en zelfs kwantitatieve PCR (qPCR), ddPCR genereert absolute kwantificering van het input materiaal. De sleutel tot ddPCR is de generatie van ~ 20.000 individuele reacties door het verdelen van steekproeven in druppeltjes. Na eind-punt PCR, scant de druppel lezer elke druppel in een cytometer-als manier, het tellen, het rangschikken, en registrerend de aanwezigheid of de afwezigheid van fluorescentie in elke individuele druppel (d.w.z., afwezigheid of aanwezigheid van PCR amplicons in elke druppel). Dan, met behulp van Poisson de distributie, input moleculen worden geschat op basis van de verhouding van de positieve druppels op het totale aantal druppels. Dit aantal vertegenwoordigt een raming van het aantal input molecules in elke PCR. Bovendien wordt ddPCR uitgevoerd en geanalyseerd op een 96-well plaat die het mogelijk maakt de gebruiker om vele monsters te draaien, evenals het uitvoeren van biologische en technische repliceert voor een goede statistische analyse. Als gevolg daarvan hebben we gecombineerd de krachtige kwantificering en matige doorvoersnelheid aard van ddPCR met de val assay om de ddTRAP assay¹¹te ontwikkelen. Deze analyse is ontworpen voor gebruikers om te studeren en robuust te kwantificeren absolute telomerase activiteit van biologische monsters^11,12. De gevoeligheid van de ddTRAP maakt het mogelijk de kwantificering van telomerase activiteit van beperkte en kostbare monsters, met inbegrip van single-cell metingen. Voorts kunnen de gebruikers de gevolgen van telomerase manipulaties en/of drugs met absolute kwantificatie van minder dan dubbele veranderingen (~ 50% verschillen) ook bestuderen. De ddTRAP is de natuurlijke evolutie van de val assay in de digitale en hogere doorvoersnelheid aard van de moderne laboratoriumexperimenten en klinische instellingen.

Protocol

1. buffer voorbereiding en opslag

1. Bereid 50 mL 1x voorraad-ASE-/DNase-free NP-40 lysis buffer (10 mM tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl₂, 1 mm ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA), 1% [vol/vol] NP-40, 10% [vol/vol] glycerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoethanol, en 0,1 mm 4- benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF)). Deze buffer kan worden gepaard en opgeslagen bij-20 °C voor toekomstig gebruik. Vermijd Vries/ontdooicycli om een optimale Lysis van cellen te verkrijgen.
2. Bereid 50 mL 10x voorraad ASE-/DNase-free val extension buffer (200 mM tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl₂, 630 mm KCl, 0,5% [vol/vol] tween 20, en 10 mm ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, n ′, N′-tetraacetic zuur (EGTA)). Deze buffer kan worden gepaard in 1 mL hoeveelheid en opgeslagen bij-20 °C voor toekomstig gebruik.

2. Cell Lysis

1. Voorbereiding van de cellen
   1. Ontdooi een bevroren hoeveelheid NP-40 lysis buffer. Eenmaal ontdooid, plaats de lysis buffer op ijs. Voeg phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF proteaseremmer) toe aan de NP-40 lysis buffer om een eindconcentratie van 0,2 mM te bereiken.
      Nota: dit zou onmiddellijk voorafgaand aan Lysing de cellen moeten worden gedaan.
   2. Verwijder overtollige vloeistof uit de verzamelde cel pellets om een droge cel pellet te garanderen. Merk op dat de korrels van de cel, of vers verzameld of eerder bevroren (-80 °C of flits die in vloeibare N₂worden bevroren), geen overgebleven oplossingen van vorige centrifuges moeten bevatten aangezien deze oplossingen in stroomafwaartse procedures kunnen interfereren.
   3. Groeien, verzamelen, en bevriezen zowel telomerase-positieve en telomerase-negatieve cel lijnen (BJ fibroblasten, IMR-90 of U2OS) om ze te gebruiken als positieve en negatieve controles. Gebruik nieuwe controle lysaten elke keer dat de test wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen assay reproduceerbaarheid.
      Nota: men adviseert dat een grote cultuur van telomerase cellen vóór het bevriezen wordt gekweekt en gepaard om om het even welke weefsel-cultuur-verwante artefacten te verwijderen die tijdens de lange termijn cultuur van cel lijnen kunnen worden geïntroduceerdn helpen reproduceerbare resultaten van het negatieve controlemonster.
   4. Plaats de cel pellets op ijs. Als de cellen werden bevroren, laat ze kort ontdooien op ijs.
      Nota: de typische grootte van de korrel van de cel voor ddTRAP is tussen 500.000 en 1.000.000 cellen. Kleinere cel pellets kan ook worden gebruikt indien nodig, maar de cel nummer moet/idealiter moet worden bekend. De ddTRAP kan ook worden uitgevoerd op basis van eiwit-inbreng met behulp van een eiwit-test (de input is meestal 1 µ g).
2. Lysing van de cellen
   1. Lyse de cellen in de NP-40 lysis buffer. Handhaaf een cel gelijkwaardigheid van 25.000 cellen/µ L van buffer. Bijvoorbeeld, lyse een pellet (met 1.000.000 cellen) in 40 µ L van NP-40 lysis buffer. Voorzichtig Pipet de lysate op en neer om te breken Open de cellen. Probeer te voorkomen dat het maken van bubbels.
   2. Laat de cellen lyse op ijs voor 30 min. Zorg ervoor dat zachtjes Vortex de lysate om clusters van cel puin te voorkomen dat de vorming van. Dit kan worden gedaan om de 10 min en is bedoeld om de lysate een gehomogeniseerd mengsel te houden.
   3. Verdun de cel lysate (25.000 cellen/µ L) 1:20 in NP-40 lysis buffer, waardoor de nieuwe cel gelijkwaardigheid 1.250 cellen/µ L. Bijvoorbeeld, Verdun 5 µ L van cel lysate in 95 µ L van lysis buffer.

3. telomerase uitbreiding reactie

1. Bereid een Master Mix (tabel 1) voor de telomerase uitbreiding reactie (per reactie).
   Opmerking: het is het beste om de uitbreiding reactie Master mix voor te bereiden tijdens de cel lysis en op te slaan op ijs.
   1. Pipet 48 µ L van de meester mengeling van de uitbreiding in elke PCR buis.
   2. Voeg 2 µ L van de verdunde (1.250 cellen/µ L) lysate toe aan de uitbreidings reactie. Het totale volume zou nu 50 µ L met een definitieve cel gelijkwaardigheid van 50 cellen/µ L moeten zijn.
2. Voer de telomerase-uitbreidings reactie uit (tabel 2).
3. Bewaar de telomerase uitbreiding producten bij 4 °C voor maximaal 3 – 5 dagen; het is echter optimaal om de uitbreiding producten te gebruiken binnen de eerste 24 uur.

4. druppel digitale PCR opstelling

1. Maak een Master Mix (tabel 3) voor de ddTRAP (per reactie).
   Opmerking: zodra de reagentia bij kamertemperatuur zijn, plaats ze niet of de Master mix op ijs. Het plaatsen van de mix op ijs kan verhogen viscositeit en leiden tot een slechte druppelvorming. De polymerase van DNA in ddPCR Supermix is een hete begin en zou bij kamertemperatuur stabiel moeten zijn. De ddPCR Supermix kan worden opgeslagen bij 4 °C na een eerste dooi van-20 °C.
   1. Pipet 19,8 µ L van ddPCR meester mengeling in elke PCR buis.
   2. Voeg 2,2 µ L van de uitbreiding reactie op elke buis. Merk op dat het totale volume nu 22 µ L moet zijn.
      Nota: de totale hoeveelheid steekproef nodig voor een ddTRAP is 20 µ L (de gelijkwaardigheid van de cel van 100 cellen). Het extra volume is een voorzorgsmaatregel voor pipet fout of steekproef verlies.
2. Stel de cartridge voor de druppel generatie in.
   Nota: de patroon bevat drie verschillende kolommen van putten die worden geëtiketteerd.
   1. Lading 20 µ L van de reactie die volgens stap 4.1.2 in de steekproef goed wordt voorbereid (midden goed) in de patroon. Vermijd bubbels bij het pipetteren van het monster.
      Opmerking: als er bubbels, tik zachtjes aan de zijkant van de cartridge, zodat deze bubbels komen naar de top van de oplossing.
   2. Laad 70 µ L van druppel generatie olie in de olie goed (links goed).
      Opmerking: om verontreiniging te voorkomen, gebruik strikt een aparte set van pipetten en tips voor ddPCR druppel generatie stappen. De volgorde van het laden van de cartridge is belangrijk. Het monster moet worden geladen voorafgaand aan het laden van olie als olie is zwaarder en zal vullen de microvloeiende kamers en leiden tot een slechte druppelvorming. Het minimum aantal monsters dat kan worden uitgevoerd is acht. Alle putten van de cartridge moet worden geladen met het monster als een lege put zal leiden tot een halt toe te roepen in de druppel generatie van de druppel generator. Als er geen geschikte monsters beschikbaar zijn om alle acht putjes binnen een patroon te laden, kan 20 µ L van ddTRAP Master Mix (stap 4,1) in de resterende cartridges worden geladen.
   3. Beveilig de pakking op zijn plaats door Tethering het aan de uiteinden van de cartridge.
      Opmerking: het ontbreken of onjuiste plaatsing van de pakking zal voorkomen dat de generator van het genereren van druppels.
   4. Plaats de geladen en gemonteerde cartridge in de druppel generator.
      Nota: de patroon wordt erkend door een magneet in de generator, die de gebruiker zal informeren wanneer de patroon behoorlijk wordt geplaatst.
3. Verwijder de cartridge zodra de druppels worden gegenereerd en de cyclus is voltooid (~ 60 – 90 s).
   1. Verwijder de pakking voorzichtig uit de cartridge. Pipet de nieuw gegenereerde druppels (rechts goed), met behulp van een multichannel Pipet, in een 96-goed PCR plaat.
      Opmerking: het geschatte volume voor de nieuw gegenereerde druppel emulsie moet 40 – 43 µ L zijn.
   2. De verbinding van de hitte de plaat met de plaat verbindingen van de aluminiumfolie PCR zodra alle steekproeven in de 96-goed plaat worden geladen om verdamping tijdens de PCR stappen te verhinderen.
4. Laad de 96-well plaat in de thermocycler en voer de volgende PCR-reactie uit (tabel 4).
   Opmerking: alle ramp tarieven tussen de temperatuur stappen moeten worden ingesteld op 2,5 ° c/s om de reacties goed te verwarmen.

5. detectie van telomerase uitbreiding producten

1. Laad de 96-well plaat in de druppel lezer.
   Let op: Zorg ervoor dat de plaat goed te oriënteren, zodat de a1 monster overeenkomt met die van de houder.
   1. Open de software die is gekoppeld aan de druppel lezer. Dubbelklik op de eerste put a1 om de sample/well editor scherm te openen.
   2. Klik op experiment en selecteer ABS in de vervolgkeuzelijst.
      Nota: het experiment bepaalt het type van te gebruiken analyse (d.w.z., absolute kwantificatie of de analyse van het gen-exemplaaraantal). ABS staat voor absolute kwantificering.
   3. Selecteer QX200 DdPCR evagreen Supermix om ervoor te zorgen dat de juiste detectiemethode in dienst is van de lezer. Klik rechtsonder in het editor scherm op toepassen om de door de gebruiker gedefinieerde instellingen op te slaan in alle gemarkeerde putten.
      Nota: SUPERMIX bepaalt het type van PCR mengeling en opsporings chemie die door de lezer zal worden gelezen.
   4. Klik op target in de well editor scherm van de software om het monster te definiëren.
   5. Definieer het type monster door op de vervolgkeuzelijst doel te klikken en onbekende, verwijzingof NTC (no-template Control) te selecteren.
      Opmerking: onbekend zou verwijzen naar een experimentele monster, referentie kan een controlemonster van bekende telomerase activiteit, en een NTC is een kritische controle voor de bepaling van de test geldigheid in termen van verontreiniging en achtergrond signaal.
   6. Label alle monsters in de steekproef naam sectie en klik op toepassen om ervoor te zorgen de gemarkeerde putten worden aangepast.
2. Klik Run te lopen/lezen van de plaat. Selecteer kolommen of rijen in het scherm Opties uitvoeren wanneer u wordt gevraagd om de machine te informeren over de oriëntatie van de plaat moet worden gelezen inch

6. gegevensanalyse

1. Bepaal het aantal geaccepteerde druppels voor elk monster door te klikken op afzonderlijke putten. Dubbelklik op de afzonderlijke putten of kolom/rij-headers om de voorbeeldgegevens weer te geven en te analyseren.
   Opmerking: de belangrijkste criteria voor het al dan niet doorgaan met de analyse van een bepaald monster is het aantal "geaccepteerde druppels". Voor de ddTRAP, monsters met 10.000 of meer geaccepteerde druppels zijn geldig voor verdere analyse. Gegevens kunnen worden verstrekt aan de gebruiker in vele formaten, waaronder een CSV-tabel,. jpg afbeeldingen, histogrammen, enz. Er zijn vele middelen beschikbaar voor de diepgaande analyse van ddPCR gegevens, met inbegrip van de ddTRAP^11,13. Deze middelen bieden een gids voor het analyseren van ddTRAP gegevens, van het selecteren van drempels^11,13 tot het kiezen van monsters voor verdere analyse¹¹,¹³, het identificeren van valse positieven en negatieven¹³, en algemene problemen oplossen¹³.
2. Markeer de putten die sample repliceren en NTC monsters. Analyseer de monsters in vergelijking met NTC of negatieve regellijnen, zoals BJ-cellen (zoals hierboven beschreven in stap 2.1.2).
   1. Stel handmatig de drempel voor de monsters door te klikken op het pictogram voor het instellen van drempels op de linker benedenhoek van het scherm. Stel drempels voor elk individu goed of voor meerdere putten tegelijk (aanbevolen).
      Opmerking: als de achtergrond wordt gedetecteerd in de NTC, kan worden afgetrokken van alle andere monsters te ' normaliseren ' het signaal en ervoor te zorgen dat alleen de ware positieve signaal wordt geanalyseerd. NTC waarden zijn meestal in de 0.2-1 molecule/µ L bereik voor de NP-40 lysis buffer systeem. Andere buffersystemen en-onderdelen moeten worden getest (bijvoorbeeld CHAPs-buffers).

Representative Results

Met behulp van de ddTRAP, telomerase activiteit werd gemeten in een cel paneel bestaande uit de volgende cel lijnen (Figuur 1): niet-kleine cel longkanker (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, en H2887), kleine cel longkanker (H82 en SHP77), en telomerase-negatieve fibroblasten (BJ). 1.000.000 Cell pellets werden lysed in de NP-40 buffer, en telomerase uitbreiding reacties werden uitgevoerd in biologische Triplo. Een gemeenschappelijke en sterk aanbevolen negatieve controle is de "NTC", de No-template controle. Dit monster wordt gegenereerd door het toevoegen van NP-40 lysis buffer (2 µ L) aan de telomerase uitbreiding reactie en de procedure met de uitbreiding producten op een identieke manier om andere monsters die de werkelijke cel lysate. Met dit voorbeeld kan de gebruiker het achtergrond signaal, indien aanwezig, aftrekken om de telomerase activiteit beter te kwantificeren. Hoewel niet aangetoond in deze figuur, is het ook mogelijk om warmte inactiveren van de lysate op 95 ° C voor 5 minuten voorafgaand aan de telomerase uitbreiding reactie als een andere negatieve controle. Deze negatieve controle is de voorkeur als cel/monster overvloed is geen probleem.

Door de fluorescentie intensiteit van elke druppel in de druppel emulsie te meten was de druppel lezer in staat de concentratie van input moleculen (moleculen/microliter) te schatten met behulp van de Poisson-verdeling (Figuur 1a). In het geval van de ddTRAP, deze input moleculen waren telomerase uitbreiding producten. Het mechanisme van de ddTRAP assay was als volgt: telomerase breidde het TS substraat uit. Deze uitgebreide substraten handelden als PCR malplaatjes in ddPCR. De kwantificering van de PCR-versterkte substraten verstrekte een vertegenwoordiging van telomerase enzymatische activiteit binnen een bepaalde cel lijn. Elke druppel werd uitgezet zoals weergegeven in Figuur 1a. Het instellen van de drempel voor een ddTRAP kan subjectief zijn; echter, met de juiste negatieve controles, kan de gebruiker gemakkelijk doen. In het voorbeeld in Figuur 1ais een drempel vastgesteld voor alle drie de biologische replicaties voor SHP77, H2887 en NTC. De positieve druppeltjes hadden een fluorescentie intensiteit rond 6.000 fluorescentie omvang (FA) en vormden een duidelijke bevolking bij de bovenkant en scheiden van negatieve druppeltjes rond 1.100 FA. Daarom kan de drempel worden vastgesteld op ~ 2.000 FA in dit experiment.

Zodra de gegevens werden verzameld en uitgevoerd, was het mogelijk om de totale telomerase uitbreiding per cel equivalent tussen alle monsters (Figuur 1b) te berekenen. Het signaal van elke put was een absolute concentratie (moleculen/microliter). Door de concentratie met 20 (input volume van het monster in ddPCR patronen) te vermenigvuldigen, kan de gebruiker het totale aantal molecules verkrijgen. Dit aantal kan dan worden gedeeld door de bekende cel equivalent (in onze prestaties van de ddTRAP, gebruikten we 100 cellen). Deze uiteindelijke waarde is in de eenheden van telomerase extension producten per cel equivalent zoals aangegeven op de y-as.

Figuur 1: telomerase activiteit in een longkanker panel. (A) de 1d amplitude van de intensiteit van de druppel fluorescentie (fluorescentie amplitude) voor SHP77, H2887 en NTC. Wells voor SHP77, H2887, en NTC werden geselecteerd en een handmatige drempel werd vastgesteld op 2.000 FA. (B) telomerase activiteit werd geschat uit de gemeten concentratie van de nucleïnezuren gedetecteerd na PCR en uitgezet om telomerase activiteit in longkanker lijnen te vergelijken. FA = fluorescentie amplitude-eenheden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De meting van telomerase activiteit is essentieel voor een overvloed van onderzoek onderwerpen met inbegrip van, maar niet beperkt tot, kanker, Telomere biologie, het verouderen, regeneratieve geneeskunde, en structuur-gebaseerd drug ontwerp. Telomerase RNPs zijn laag overvloedig, zelfs in kankercellen, het maken van de opsporing en studie van dit enzym uitdagend. In deze paper, beschreven we de stap-voor-stap procedures voor de nieuw ontwikkelde ddTRAP assay om robuust te kwantificeren telomerase activiteit in de cellen. Door het combineren van de traditionele telomerase uitbreiding reactie met ddPCR, waren we in staat om kwantitatief te detecteren telomerase activiteit (telomerase-uitgebreide producten) in longkanker cellen.

De ddTRAP assay berust op dezelfde theorie als de val assay. Cell lysaten worden verkregen door Lysing cellen in een niet-Ionische detergent (NP-40) lysis buffer te handhaven enzymactiviteit en vervolgens gebruikt om een telomerase uitbreiding reactie van de "TS" substraat/primer uit te voeren. De nieuwigheid van ddTRAP vertrouwt op de vorming van druppeltjes voorafgaand aan PCR. Het verdelen van de steekproef in druppeltjes staat de analyse toe om absolute kwantificatie van telomerase activiteit per cel te verkrijgen.

Telomerase activiteit werd gemeten in longkanker cel lijnen, met behulp van de ddTRAP. Een van de belangrijkste beperkingen van de gel-based TRAP assay is het aantal monsters die kunnen worden verwerkt op een moment. De meeste gel kammen kan alleen geschikt voor maximaal 20 putten/monsters. In tegenstelling, de ddTRAP kan oplopen tot 96 monsters per keer, aanzienlijk verhogen van het aantal monsters die kunnen worden verwerkt in een keer. We testten telomerase activiteit in acht cel lijnen. Belangrijker, We renden elke telomerase uitbreiding reactie in biologische Triplo voor een totaal van 24 uitbreiding reacties. Wij konden toen elke uitbreidings reactie als drie technische replicatie voor PCR voor een totaal van 72 steekproeven op de ddPCR plaat in werking stellen. Bovendien biedt de ddTRAP assay reproduceerbare resultaten met een interday CV (variatiecoëfficiënt) van 5,1% voor 100 Cell equivalenten en een intraday CV van 8,61% voor 100 Cell equivalenten. Interday en intraday vertegenwoordigen biologische repliceert draaien op twee verschillende platen of dezelfde plaat, respectievelijk, op HeLa cel lysaten¹¹. Als 72 monsters werden verwerkt in de traditionele val of een andere gel-based Assay, zou het vereisen veel meer hands-on tijd. Dit leidt tot hogere kosten van reagentia, meer kostbare tijd nodig van medewerkers/studenten/stagiairs, een hogere gel-to-gel variabiliteit, en een gebrek aan reproduceerbaarheid tussen gebruikers en laboratoria. De capaciteit aan betrouwbaar en gemakkelijk looppas repliceert in ddTRAP is een dramatische verbetering over gel-based analyses en laat veel meer steekproeven toe om efficiënt worden verwerkt, die in de statistische analyse van de gegevens helpt.

Ten slotte, minder variabiliteit tussen de monsters in het algemeen in de ddTRAP en de mogelijkheid om de nodige replicaties uit te voeren kunnen gebruikers in acht te nemen minder dan tweeledige veranderingen tussen de monsters. De belangrijkste beperking van de meeste gel-based analyses is het gebrek aan juiste kwantificering. Hier, met behulp van de ddTRAP, kunnen we detecteren de subtiele verschillen tussen de verschillende longkanker lijnen. De subtiele verschillen kunnen kritisch zijn als het gaat om het vergelijken van drugs targeting telomerase activiteit en beslissen al dan niet vooruit te gaan met kleine molecule verbindingen van high-throughput schermen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul