Summary
Formålet med denne artikel er at beskrive en protokol til ekstraktion af vandige metabolitter fra kultiverede vedlige celler til metabolomic analyse, især, kapillar elektroforese-massespektrometri.
Abstract
Metabolomic analyse er en lovende omik tilgang til ikke kun at forstå den specifikke metaboliske regulering i kræftceller sammenlignet med normale celler, men også at identificere biomarkører for tidlig fase kræft påvisning og forudsigelse af kemoterapi respons i Kræftpatienter. Fremstilling af ensartede prøver til metabolomic analyse er et kritisk spørgsmål, der mangler at blive behandlet. Her præsenterer vi en nem og pålidelig protokol til udvinding af vandige metabolitter fra kultiverede vedhæng ende celler til metabolomic analyse ved hjælp af kapillar elektroforese-massespektrometri (CE-MS). Vandige metabolitter fra kultiverede celler analyseres ved dyrkning og vask af celler, behandling af celler med methanol, udvinding af metabolitter og fjernelse af proteiner og makromolekyler med spin kolonner til CE-MS-analyse. Repræsentative resultater ved hjælp af lungecancer cellelinjer behandlet med diamid, et oxidativt reagens, illustrerer den tydeligt observerbare metaboliske forskydning af celler under oxidativ stress. Denne artikel vil være særligt værdifuld for studerende og efterforskere, der er involveret i metabolomik forskning, som er nye til høst metabolitter fra cellelinjer til analyse af CE-MS.
Introduction
Otto Warburg bemærkede, at kræftceller får den usædvanlige evne til at optage glucose og gæske det til at producere lactat i tilstedeværelse af tilstrækkelig ilt — et fænomen, der betegnes som Warburg-effekt eller aerob glycolyse1,2. Mitokondriel respiration defekter er spekuleret som det underliggende grundlag for aerob glykolyse i kræftceller3. Faktisk, Warburg effekt er grundlaget for tumor billeddannelse ved fluordeoxyglucose (FDG)-Positron emission tomografi (PET), som er meget udbredt i klinisk praksis4,5. En høj hastighed af aerob glykolyse betragtes som et centralt element i kræft og er for nylig blevet vedtaget som en af de velkendte "kendetegn for kræft," som beskrevet af D. Hanahan og B. Weinberg6. Somatiske mutationer i onkogener og tumor suppressor gener — såsom HRAS/KRAS/NTM, EGFR, BRAF, MYC, TP53, isocitrat dehydrogenase (Idh) og fumarat hydratase (FH ) — har været forbundet med specifikke metaboliske ændringer i kræftceller, menes at være et resultat af Warburg effekt7.
Metabolomic analyse er en lovende tilgang ikke kun at forstå metaboliske regulering i kræftceller, men også at identificere tidlige stadier af kræft biomarkører og kemoterapi respons forudsigelse. Efter behandling af følsomme eller resistente kræftceller med anticancer forbindelser, sporing af deres metaboliske respons letter identifikation af metaboliske biomarkører at forudsige effekten af specifikke anticancer behandlinger hos cancerpatienter8 ,9,10,11. I denne artikel blev kræft cellelinjer afledt af et lunge adenokarcinom med en EGFR -mutation behandlet med diamid – som forårsager oxidativ stress – brugt som modeller for metabolomic analyse. Fordelen ved denne analysemetode med kapillar elektroforese-massespektrometri (CE-MS) er dens omfattende måling af ladede metabolitter med masse området m/z 50-100012,13. Formålet med denne artikel er at give nybegyndere en detaljeret trinvis visuel protokol til fremstilling af vandige metabolitter fra dyrkede cancerceller og efterfølgende metabolomic analyse, især af CE-MS.
Protocol
1. cellekultur på dag 1
Bemærk: hver prøve til metabolitten ekstraktion skal fremstilles af en enkelt 100 mm vævskultur skål, der er moderat, men ikke fuldt konflydende (indeholdende ca. 2-5 millioner celler). Beregn antallet af retter, der er nødvendige for analysen og forberede dem i overensstemmelse hermed.
- Kultur HCC827 og PC-9 celler i 5% CO2 ved 37 °C i rpmi-1640 medium suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS).
- Aspirer cellekultur mediet fra de 100 mm kultur retter.
- Vask cellerne på hver skål med 2 mL fosfatbufferopløsning (PBS) uden calcium og magnesium. VIP forsigtigt hver skål, så PBS-opløsningen helt dækker overfladen af skålen.
- Aspirer vaskebufferen fra kultur retterne.
- Varm 0,25% trypsin-EDTA-opløsning til 37 °C, og tilsæt 2 mL trypsin-EDTA-opløsning med en 5 mL serologisk pipette. VIP forsigtigt hver skål, så trypsin helt dækker overfladen af skålen.
- Kultur retterne inkurueres ved 37 °C i ca. 5 minutter.
- Der tilsættes 4 mL foropvarmet komplet vækstmedium pr. fad. Resuspender cellerne i medium ved forsigtigt at pipette flere gange.
- Hver cellesuspension overføres til et separat 15 mL konisk rør, og der centrifugeres ved 800 × g i 5 min.
- Opslæmmet hver celle pellet i 2 mL foropvarmet komplet vækstmedium.
- Bestem det totale antal og den procentvise levedygtighed af cellerne ved hjælp af den automatiserede celle tæller og 0,4% trypan blå opløsning.
- Der blandes 10 μL cellesuspension og 10 μL 0,4% trypan blå opløsning.
- 10 μL af prøven indlæses i celle optællings kammerets slide gennem kapillar handling.
- Indsæt kammeret glide ind i den automatiserede celle tæller. Det transmitterede lys lyser automatisk, og instrumentet fokuserer automatisk på cellen.
- Tryk på Capture -knappen for at tage billedet og få vist resultaterne.
- Hvis det er nødvendigt, tilsættes yderligere vækstmedium for at opnå den ønskede celle koncentration.
- Frø ca. 1 – 2,5 millioner celler pr. 100 mm cellekultur skål.
Bemærk: metabolit koncentrationer, der bestemmes af CE-MS-analyse, vil blive normaliseret baseret på antallet af levedygtige celler. Med henblik på celletælling er det nødvendigt at forberede mindst én ekstra seedet kultur skål for hver gruppe. - Du inkuerer kultur retterne i 5% CO2 ved 37 °c i 18 timer.
2. klargøring af reagenser
- Fortynde en kommerciel intern standardopløsning, herunder L-methionin-sulfon og d-camphor-10-sulfonsyre 1000-fold i ultrarent vand.
Bemærk: for færre end 80 prøver skal man blot blande 50 μl af den interne standard opløsning 1 og 45 ml ultrarent vand i en 50 ml målekolbe og derefter bringe opløsningen op på 50 ml med ultrarent vand. - Der tilberedes en 0,05 g/ml mannitol opløsning i ultrarent vand som vaskebuffer.
Bemærk: for færre end 30 prøver opløses blot 25 g mannitol i 500 ml ultrarent vand. Der kræves ca. 15 mL vaskebuffer pr. 100 mm dyrknings skål, så Forbered en tilstrækkelig mængde vaskebuffer i henhold til antallet af prøver.
3. forvask af centrifugal filterenheder
- Der afpipetteres 250 μl ultrarent vand i filter skålen for hver centrifugal filterenhed (Se tabellen over materialer).
Bemærk: der kræves to filterenheder pr. prøve. - Filter enhederne skruenmes stramt og centrifugeres ved 9.100 × g ved 4 °c i 5 min.
- Kontroller volumenet af hvert filtrat — hvis der er akkumuleret et signifikant filtrat i løbet af det første kort spin, kan filterenheden være defekt. I dette tilfælde skal du kassere filterenheden og i stedet bruge en ny filterenhed.
- Filter enhederne lukkes stramt og centrifugeres igen ved 9.100 × g ved 4 °c i 30 min.
- Sørg for, at der ikke forbliver ultrarent vand i nogen af filter Kopperne. fjerne det filtrerede ultrarent vand i hvert opsamlings rør med en pipette og kasseres.
Bemærk: forsøg ikke at fjerne restvand i et filter bæger med en pipette, da det kan beskadige filteret. - Udskift filter bægre i deres opsamlings glas.
Bemærk: Brug centrifugal filter enhederne inden for en time, da filtrene kan blive beskadigede ved tørring.
4. cellekultur på dag 2
-
Tag de 100 mm kultur retter ud af inkubatoren.
Bemærk: den anbefalede celle kulturs varighed er 18 timer. - Aspirer cellekultur mediet fra hver 100 mm kultur skål.
- Tilsæt 10 mL cellekulturmedium, der omfatter de relevante koncentrationer af forbindelser eller stoffer til hver skål, idet man sørger for ikke at forstyrre cellelaget.
Bemærk: til demonstrationsformål tilføjede vi 10 μL 250 mM diamid opløst i PBS (slutkoncentration på 250 μM) i dette eksperiment. - Kultur retterne inkurueres ved 37 °C i 30 minutter ved tilstedeværelse af diamid eller PBS som kontrol.
- Aspirer cellekultur mediet fra hver 100 mm kultur skål.
- Vask cellerne ved forsigtigt at tilsætte 2 mL 5% mannitol opløsning til kanten af hver skål, idet man sørger for ikke at forstyrre cellelaget og derefter let vippe skålen.
Bemærk: PBS eller saltvandsopløsning forstyrrer CE-MS-baseret metabolomic analyse og påvirker måle resultaterne negativt og bør derfor ikke anvendes som vaskebuffer. - Aspirér vaskebufferen fra hver dyrknings skål, og vask derefter cellerne igen ved forsigtigt at tilsætte 10 mL vaskebuffer pr. fad og let vippe skålen.
- Udsug vaskebufferen helt fra kanten af hver kultur skål.
Bemærk: Aspirer så meget vask buffer som muligt, mens opmærksom på ikke aspirere cellerne. Resterende mannitol kan interferere med CE-MS-analyse. aspiration af celler vil mindske antallet af celler og dermed blive en kilde til fejl i datanormalisering.
5. udvinding af metabolitter fra kultiverede celler
- Der tilsættes 800 μL 99,7% methanol pr. dyrknings skål. Rock forsigtigt hver kultur skål frem og tilbage for at dække hele dens overflade. Efterlad retterne ved stuetemperatur i 30 s.
- Tilsæt langsomt 550 μL af den fortyndede interne standardopløsning pr. fad ved at neddyppe spidsen af pipetten i methanol og forsigtigt pipettere op og ned flere gange.
- Rock forsigtigt hver kultur skål frem og tilbage for at dække hele dens overflade.
- Efterlad retterne ved stuetemperatur i 30 s.
6. ultrafiltrering af celleekstrakter
- Den ekstraherede opløsning overføres fra hver dyrknings skål til et separat 1,5 mL mikrocentrifugerør.
- Centrifuge rørene ved 2.300 × g ved 4 °c i 5 min.
- Der overføres 350 μL af hver supernatanten til to centrifugal filterenheder pr. prøve.
Bemærk: fra hver dyrknings skål overføres i alt 700 μL af den ekstraherede opløsning til to filterrør (350 μL/tube). - Filter rørene centrifugeres ved 9.100 × g ved 4 °c i ca. 2 timer, indtil der ikke er væske tilbage i filter bægre.
- Fjern filter bægre og luk låget på opsamlings rørene tæt.
7. prøve fordampning
- Forbered en centrifugal fordamper-typisk, dette består af en fordamper, en kold fælde, og en vakuumpumpe.
- Anbring opsamlings rørene i centrifugal fordamper.
Bemærk: Lad låget på rørene være åbne. - De udtagne prøveopløsninger inddampes under vakuum forhold ved stuetemperatur.
Bemærk: typiske konfigurationer for antallet af rotationer og tryk er henholdsvis 1.500 rpm og 1.000 PA, og det tager normalt ca. 3 timer at fordampe prøverne helt. - Bekræft, at der ikke er væske tilbage i nogen af opsamlings rørene, og luk låsene på rørene tæt.
- Opsamlings rørene opbevares i en dyb fryser (− 80 °C), indtil metabolomic analyse.
8. metabolomic analyse af CE-MS
- Filtratet resuspenderes i 50 μl ultrarent vand umiddelbart før CE-MS-analysen.
- Udføre CE-MS-analyse efter metoder beskrevet tidligere12,13 ved hjælp af kapillar elektroforese system og Time-of-Flight massespektrometer system udstyret med en isokratisk pumpe, en CE-MS adapter, og en CE-ESI-MS sprøjte.
Bemærk: begge systemer kan styres af software af systemleverandører og er forbundet med en smeltet silica kapillar (50 μm indvendig diameter × 80 cm samlet længde).- Konfigurer instrumenter og prøve hætteglas, Forbered kapillar med en kapillar kassette, Genfyld hylster og passende elektroforese buffere afhængigt af anion eller kation analyse tilstand, og derefter anvende spændinger.
Bemærk: instrumenterings-og analysebetingelser er beskrevet i detaljer andetsteds12,13. - Åbn softwaren, og Forbered en arbejdsliste, der indeholder data anskaffelsesmetoder og eksempel oplysninger.
- Start en testkørsel og kontrollere data såsom signalintensitet og Peak form af interne standarder og Peak opløsning af andre standardforbindelser.
- Finjuster Analysebetingelserne, hvis det er nødvendigt.
- Prøveopløsningerne indsprøjtes ved 50 mbar i 3 s og en spænding på 30 kV.
Bemærk: CE-MS blev udført enten i positiv eller negativ ion-tilstand. Indstil spektrometer til at scanne masse området m/z 50 – 1000. Kapillar spændingen blev sat til 4 kV; strømningshastigheden af nitrogen gas (varmelegeme temperatur 300 °C). For positiv tilstand blev fragmentoren, skimmeren og OCT RFV spænding fastsat til henholdsvis 75, 50 og 125 V. For negativ ion-tilstand blev fragmentoren, skimmeren og OCT RFV-spændingen indstillet til henholdsvis 100, 50 og 200 V.
- Konfigurer instrumenter og prøve hætteglas, Forbered kapillar med en kapillar kassette, Genfyld hylster og passende elektroforese buffere afhængigt af anion eller kation analyse tilstand, og derefter anvende spændinger.
- Analysér spektrum data.
- Udtræk toppe fra massespektrale data ved hjælp af automatisk integrations software for at opnå spids oplysninger, herunder m/z, spids areal og overførselstid (MT).
Bemærk: metoden er beskrevet i detaljer andre steder14. - Udelad signal toppe svarende til isotoper, adduct ioner og andre produkt ioner af kendte metabolitter.
- Anmærke resterende toppe med oplysninger fra HMT metabolit database i henhold til m/z værdier og MTs.
- Normaliserer områder af de kommenterede toppe til interne standardniveauer og antal celler pr. prøve.
- Evaluer koncentrationen af hver metabolit i de dyrkede celler (pmol/106 celler) ved hjælp af standard kurver, der er udarbejdet for hver metabolit.
- Brug de kvantificerede metabolit koncentrationer til efterfølgende statistiske analyser og biologiske fortolkninger14.
- Udtræk toppe fra massespektrale data ved hjælp af automatisk integrations software for at opnå spids oplysninger, herunder m/z, spids areal og overførselstid (MT).
Representative Results
Da metabolitterne i cancerceller (pmol/106 celler) normaliseret til antallet af levedygtige celler, bør der fastsættes forsøgsbetingelser med forsigtighed for at minimere variationen i antallet af levedygtige celler mellem betingelserne. For eksempel var diamidbehandling i en relativt høj koncentration (250 μm), men for en kort tid at give alle cellerne til at vokse så ligeligt som muligt, og dermed udligne antallet af levedygtige celler analyseres. Under disse eksperimentelle betingelser, HCC827 og PC-9 celler voksede ligeligt for 3 h (figur 1). CE-MS-analyse af diamidbehandlede celler sammenlignet med PBS-behandlede (kontrol) celler afslørede 175 og 150 differentialmetabolitter i henholdsvis HCC827 og PC-9 celler. Blandt disse var flere mellemprodukter i pentophosphatpathway (PPP) og i øvre glykolyse signifikant højere i de diamidbehandlede tilstande i begge cellelinjer, hvorimod nogle få tricarboxylsyrer (TCA)-cyklus mellemprodukter var lavere i de behandlede betingelser (figur 2 og figur 3).
OPP genererer reduktions ækvivalenter i form af reduceret nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (NADPH), som anvendes til redox homøostase vedligeholdelse og fedtsyre biosyntese15. Efter diamidbehandling steg niveauet af gluconinsyre — et oxideret glucose — 12 gange i HCC827 celler og 10 gange i PC-9-celler; tilsvarende, efter behandling med diamid, steg niveauet af glucose-6-fosfat (G6P) — en phosphoryleret glucose og det første hexokinase-katalyserede glykolyse-produkt — også 6,3-og 3,5-fold i henholdsvis HCC827-og PC-9-celler (figur 4). Efter diamidbehandling var niveauerne af 6-phosphogluconat (6PG) – det første mellemprodukt i PPP – desuden dramatisk forøget 89-fold i HCC827 celler og 231-fold i PC-9-celler sammenlignet med niveauerne set i PBS-kontrollerne (figur 4). I modsætning hertil ændrede niveauerne af andre glykolytiske mellemprodukter, såsom fructose 6-fosfat (F6P) og fruktose 1,6-bisphosphat (F1, 6P), ikke i den eksperimentelle tilstand af diamid (figur 4). Det totale niveau af nicotinamid-adenin-dinucleotidfosfat (NADP+) var næsten ækvivalent mellem DIAMIDBEHANDLINGEN og PBS-kontrolbetingelserne (figur 4), hvilket tyder på, at glucose hovedsagelig blev KATABOLISERET via PPP.
Figur 1. Uændret celleantal ved diamidbehandling. Cellevækst responser på 250 μm af diamid blev målt ved hjælp af trypan blå farvning. Celle numrene på (a) HCC827 og (B) PC-9-celler, der er behandlet med PBS (blå) eller diamid (rød; 250 μm) i 1 eller 3 timer, vises. Data vises som middel ± SD (n = 6). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative MS-toppe af metabolitter. Elektro ferogrammer kommenteret som (a) gluconinsyre, (b) glucose 6-phosphat (G6P), (C) 6-phosphogluconat (6pg), og (D) nicotinamid ADENIN dinucleotid fosfat (NADP+) opnået ved CE-MS-analyse. Hver linje angiver celle linjen (fast, HCC827; punkteret, PC-9) og behandling (blå, PBS; rød, diamid), der anvendes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Metabolome profiler af intracellulære metabolitter. Gange ændringer af metabolitter i (a) HCC827 og (B) PC-9-celler, der behandles med diamid, vises som log2(diamid/PBS). I alt 175 og 150 metabolitter blev kommenteret i henholdsvis HCC827 og PC-9 celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Opregulering af PPP ved diamidbehandling. Intracellulære koncentrationer (pmol/106 celler) af vigtige metabolitter, der er involveret i glykolyse og pentophosphatpathway (PPP) efter behandling med diamid, vises. Metabolitter blev udvundet fra HCC827 og PC-9 celler behandlet med PBS (blå) eller diamid (rød, 250 μm) i 30 min. repræsentative metabolitter såsom gluconinsyre, glucose 6-fosfat (G6P), fructose 6-fosfat (F6P), 6 -phosphogluconat (6Pg) og nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADP+) vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her beskriver vi en alment tilgængelig metode til at forberede metabolitter fra dyrkede kræftceller til CE-MS-baseret metabolomic analyse. Et af de mest kritiske punkter i denne protokol er den korrekte forberedelse af kræftceller, fordi målte metabolit koncentrationer er normaliseret til antallet af levedygtige celler. For nøjagtig vurdering af celletallet er det nødvendigt at forberede mindst én yderligere kultur skål pr. forsøgsgruppe for at tælle antallet af levedygtige celler parallelt med ekstraktion af metabolitter til metabolomic analyse. Desuden bør det samme antal celler seedede i hver skål for replikater og i skålen til optælling; i fremtiden vil dette blive hjulpet af en hurtig og stressor-fri (f. eks. trypsin-fri) celle optællings protokol, der gør det muligt at anvende samme ret til både optælling af levedygtige celler og udvinding af metabolitter. Der skal udvises forsigtighed under vask, så cellerne ikke løsnes fra overfladen af retterne. Svære cytotoksiske tests og andre eksperimenter, der reducerer celle adhæsion, kan være uegnede til denne ekstraktions protokol på grund af potentielt tab af celler under vaskeproceduren.
Det er vigtigt at bruge en 5% mannitol opløsning som vaskebuffer til udvinding af metabolitter fra dyrkede celler til CE-MS-baseret metabolomic analyse, fordi salt-baserede buffere, såsom PBS, interfererer med metabolomic analyse og påvirker målingen negativt.
To eller tre retter kan kombineres som en enkelt prøve ved individuelt at udtrække metabolitter fra hver skål og derefter samleprøver; Kombinationen af flere retter øger dog ofte residualmannitol i den ekstraherede metabolit-opløsning. Dette kan også interferere med metabolomic analyse af CE-MS. Derfor anbefales det ikke at bruge flere retter eller brønde som en enkelt prøve.
Denne metabolomic analysemetode ved hjælp af CE-MS er blevet udviklet til omfattende måling af ladede molekyler med molekylvægte mellem 50 og 1000 da; Derfor er denne protokol optimeret til ekstraktion af vandige, lavmolekylære forbindelser. Derfor er denne protokol ikke egnet til udvinding af hydrofobe metabolitter såsom lipider eller makromolekyler såsom proteiner og nukleinsyrer. Da der er en stigende efterspørgsel efter omfattende lipid-analyser eller lipidomics af dyrkede celleprøver, er det nødvendigt at udvikle en let og effektiv protokol til samtidig ekstraktion af både hydrofile og hydrofobiske metabolitter.
Det første trin af metaboliseringsekstraktionen — aspirerende medium og vaske celler med mannitol — bør udføres så hurtigt som muligt for at minimere ændringer i cellernes metaboliske profil. Behandling af celler med methanol efter vask med mannitol antages at denaturere proteiner og derved forhindre enzymer i at katalysere yderligere metaboliske reaktioner. Men selv efter methanolbehandling kan ikke-enzymatiske kemiske reaktioner — såsom redox-reaktioner, nogle decarboxyleringprocesser og thiol-forbindelser — finde sted. Som sådan bør enhver koncentration af metabolitter, der er involveret i disse reaktioner målt ved denne protokol, fortolkes med forsigtighed. I modsætning til genomet eller transkriptomet består metabolomet af molekyler med en lang række kemiske egenskaber; Derfor kan ingen enkelt protokol udtrække alle metabolitter uden tab eller forstyrrelse. For mere nøjagtige målinger af sådanne meget reaktive metabolitter bør en protokol, der specifikt er konstrueret til at udtrække visse grupper af metabolitter, og som kræver fraktioneringer og derivatiseringer, konsulteres. Den protokol, der præsenteres her, beskriver imidlertid en enkel og hurtig ekstraktion af vandige metabolitter fra kultiverede celleprøver til metabolomic analyse af CE-MS. I dette dokument kunne vi ikke beskrive, hvordan man opretter CE-MS i detaljer, fordi fokus i det nuværende manuskript er anderledes, men beskriver detaljerede skridt til at oprette CE-MS kan kræve en særskilt dedikeret artikel.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af Shonai regional industri Promotion Center for deres hjælp. Dette arbejde blev delvist støttet af forskningsmidler fra Yamagata Prefecture og Tsuruoka City, af National Cancer Center forsknings-og Udviklingsfond [Grant nummer 28-A-9], og af Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) KAKENHI [Grant nummer 17K07189] til HM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
| Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
| CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
| CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
| CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
| Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
| Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
| Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
| Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
| Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
| Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
| D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
| Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
| Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
| Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
| HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
| Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
| Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
| Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
| Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
| Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
| PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
| Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ·cm pure water |
| Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |
References
- Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).
- Soga, T. Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming. Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and Cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Fukuda, H., et al. Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection. European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).
- Miles, K. A., Williams, R. E. Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism. Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes. Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).
- Makinoshima, H., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).
- Makinoshima, H., et al. Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).
- Makinoshima, H., et al. Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma. Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).
- Sato, Y., et al. Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1129 (2018).
- Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).
- Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Patra, K. C., Hay, N. The pentose phosphate pathway and cancer. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).
