Summary
Formålet med denne artikkelen er å beskrive en protokoll for ekstraksjon av vandige metabolitter fra kultivert tilhenger celler for metabolomic analyse, spesielt, kapillær elektroforese-masse massespektrometri.
Abstract
Metabolomic analyse er en lovende omics tilnærming til ikke bare å forstå den spesifikke metabolske regulering i kreftceller i forhold til normale celler, men også å identifisere biomarkører for tidlig stadium kreft deteksjon og prediksjon av kjemoterapi respons i kreftpasienter. Utarbeidelse av ensartede prøver for metabolomic analyse er et kritisk problem som gjenstår å bli behandlet. Her presenterer vi en enkel og pålitelig protokoll for å utvinne vandige metabolitter fra kultivert tilhenger celler for metabolomic analyse ved hjelp av kapillær elektroforese-Mass massespektrometri (CE-MS). Vandige metabolitter fra kulturperler analyseres av dyrking og vaske celler, behandling av celler med metanol, utpakking av metabolitter og fjerning av proteiner og makromolekyler med spin-kolonner for CE-MS-analyse. Representative resultater ved bruk av lungekreft cellelinjer behandlet med diamide, en oksidativt reagens, illustrerer tydelig synlig metabolske forskyvning av cellene under oksidativt stress. Denne artikkelen vil være spesielt verdifullt for studenter og etterforskere involvert i Plantemetabolomikk forskning, som er nye til høsting metabolitter fra cellelinjer for analyse av CE-MS.
Introduction
Otto Warburg observerte at kreftceller erverve uvanlig evne til å ta opp glukose og gjære det å produsere melkesyre i nærvær av tilstrekkelig oksygen-et fenomen betegnes som Warburg effekt eller aerobic Glykolysen1,2. Mitokondrie åndedrett defekter er spekulert som det underliggende grunnlaget for aerob Glykolysen i kreftceller3. Faktisk er Warburg effekten grunnlaget for tumor Imaging av fluorodeoxyglucose (FDG)-positron utslipp tomografi (pet), som er mye brukt i klinisk praksis4,5. En høy grad av aerobic Glykolysen regnes som en viktig funksjon av kreft og har nylig blitt vedtatt som en av de velkjente "kjennetegn av kreft," som beskrevet av D. Hanahan og B. Weinberg6. Somatiske mutasjoner i oncogenes og tumor Suppressor gener-som HRAS/KRAS/NRAS, EGFR, BRAF, myC, TP53, isocitrate dehydrogenase (IDH), og fumarat hydratase (FH )-har vært knyttet til bestemte metabolske endringer i kreftceller, antas å være et resultat av Warburg effekt7.
Metabolomic analyse er en lovende tilnærming ikke bare å forstå metabolsk regulering i kreftceller, men også å identifisere tidlig stadium kreft biomarkører og kjemoterapi respons prediksjon. Etter behandling av følsomme eller resistente kreftceller med anticancer forbindelser, sporing av deres metabolske responser forenkler identifisering av metabolske biomarkører å forutsi effekten av spesifikke anticancer behandling hos kreftpasienter8 ,9,10,11. I denne artikkelen, kreftcelle linjer avledet fra en lunge adenokarsinom med en EGFR mutasjon behandlet med diamide-som forårsaker oksidativt stress-ble brukt som modeller for metabolomic analyse. Fordelen med denne analytiske metoden ved hjelp av kapillær elektroforese-Mass massespektrometri (CE-MS) er dens omfattende måling av belastes metabolitter med masse området m/z 50-100012,13. Hensikten med denne artikkelen er å gi nybegynnere en detaljert trinnvis visuell protokoll for utarbeidelse av vandige metabolitter fra kultivert kreftceller og påfølgende metabolomic analyse, spesielt av CE-MS.
Protocol
1. cellekultur på dag 1
Merk: hver prøve for metabolitten ekstraksjon bør tilberedes fra en enkelt 100 mm vev kultur rett som er moderat, men ikke fullt confluent (inneholder ca 2-5 millioner celler). Beregn antall retter som trengs for analysen og forberede dem deretter.
- Kultur HCC827 og PC-9 celler i 5% CO2 ved 37 ° c i RPMI-1640 medium supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS).
- Aspirer cellen kultur medier fra 100 mm kultur retter.
- Vask celler på hver rett med 2 mL fosfat bufret saltvann (PBS) løsning uten kalsium og magnesium. Forsiktig rock hver tallerken slik at PBS løsningen helt dekker overflaten av fatet.
- Aspirer vaske bufferen fra kultur rettene.
- Varm 0,25% Trypsin-EDTA-løsning til 37 ° c og tilsett 2 mL Trypsin-EDTA-løsning med en 5 mL serologisk pipette. Forsiktig rock hver rett slik at Trypsin helt dekker overflaten av fatet.
- Ruge kultur rettene ved 37 ° c i ca. 5 min.
- Tilsett 4 mL pre-varmet komplett vekstmedium per tallerken. Resuspend cellene i medium ved forsiktig pipettering flere ganger.
- Overfør hver celle suspensjon til en separat 15 mL konisk rør og sentrifuger på 800 × g i 5 min.
- Resuspend hver celle pellet i 2 mL pre-varmet komplett vekstmedium.
- Bestem totalt antall og prosent levedyktighet av cellene ved hjelp av automatiserte celle telleren og 0,4% trypan blå løsning.
- Bland 10 μL av celle fjæring og 10 μL av 0,4% trypan blå oppløsning.
- Legg 10 μL av prøven i celle tellings kammeret ved hjelp av kapillær virkningen.
- Sett kammer lysbildet inn i den automatiserte celle telleren. Det overførte lyset tennes automatisk og instrumentet automatisk fokuserer på cellen.
- Trykk på opptaks knappen for å ta bildet og vise resultatene.
- Om nødvendig, Legg ytterligere vekstmedium for å oppnå ønsket celle konsentrasjon.
- Seed ca 1-2,5 millioner celler per 100 mm cellekultur parabolen.
Merk: metabolitten konsentrasjoner bestemmes av CE-MS analyse vil bli normalisert basert på antall levedyktige celler. For det formål å celle telling, er det nødvendig å utarbeide minst en ekstra seeded kultur rett for hver gruppe. - Ruge kulturen retter i 5% CO2 ved 37 ° c for 18 h.
2. tilberedning av reagenser
- Fortynne en kommersiell intern standard løsning inkludert L-metionin sulfonstrømmen og d-kamfer-10-sulfonsyrer acid 1000-fold i ultrarent vann.
Merk: for færre enn 80 prøver, bare bland 50 μL av den interne standard løsningen 1 og 45 mL ultrarent vann i en 50 mL volum kolbe, og ta løsningen opp til 50 mL med ultrarent vann. - Forbered en 0,05 g/mL mannitol løsning i ultrarent vann som vaskebuffer.
Merk: for færre enn 30 prøver, bare løs opp 25 g mannitol i 500 mL ultrarent vann. Omtrent 15 mL vaskebuffer kreves per 100 mm kultur rett, så Forbered et tilstrekkelig volum av vaskebuffer i henhold til antall prøver.
3. pre-vasking sentrifugal filter enheter
- Pipetter 250 μL av ultrarent vann inn i filter koppen på hver sentrifugal Filterenhet (se tabell over materialer).
Merk: det kreves to filter enheter per prøve. - Cap filter enhetene tett og sentrifuge ved 9 100 × g ved 4 ° c i 5 min.
- Kontroller volumet for hver Filtrer — hvis betydelige Filtrer har akkumulert i løpet av det første korte spinn, kan filterenheten være defekt. I dette tilfellet forkaster du filterenheten og bruker en ny Filterenhet i stedet.
- Lukk lokk på filter enhetene tett og sentrifuger igjen ved 9 100 × g ved 4 ° c i 30 min.
- Sørg for at ingen ultrarent vann forblir i noen av filter koppene; fjerne filtrert ultrarent vann i hver samling rør med en pipette og kast.
Merk: ikke prøv å fjerne rester av vann i en filter kopp med en pipette, da dette kan skade filteret. - Sett filter koppene inn i oppsamlings rørene.
Merk: Bruk sentrifugal filter enhetene innen en time siden filtrene kan bli skadet ved tørking.
4. cellekultur på dag 2
-
Ta ut 100 mm kultur retter fra inkubator.
Merk: anbefalt cellekultur varighet er 18 timer. - Aspirer celle kulturen medium fra hver 100 mm kultur parabolen.
- Tilsett 10 mL cellekultur medium som inkluderer de riktige konsentrasjonene av forbindelser eller medikamenter til hver tallerken, ta vare å ikke forstyrre celle laget.
Merk: for demonstrasjonsformål har vi lagt til 10 μL av 250 mM diamide oppløst i PBS (endelig konsentrasjon på 250 μM) i dette eksperimentet. - Ruge kultur rettene ved 37 ° c i 30 min i nærvær av diamide eller PBS som en kontroll.
- Aspirer celle kulturen medium fra hver 100 mm kultur parabolen.
- Vask celler ved å forsiktig legge til 2 mL 5% mannitol løsning på kanten av hver tallerken, ta vare å ikke forstyrre celle laget, deretter litt vippe parabolen.
Merk: PBS eller saltløsning forstyrrer CE-MS-baserte metabolomic analyse og påvirker måle resultatene negativt, og bør derfor ikke brukes som vaskebuffer. - Aspirer vaskebuffer fra hver kultur parabol, deretter vaske celler igjen ved å forsiktig legge 10 mL vaskebuffer per tallerken og litt vippe parabolen.
- Fullstendig aspirer vaskebuffer fra kanten av hver kultur parabolen.
Merk: aspirer så mye vaskebuffer som mulig, mens du betaler oppmerksomhet til ikke aspirer cellene. Resterende mannitol kan forstyrre CE-MS analyse; aspirasjon av celler vil redusere antall celler og dermed bli en kilde til feil i data normalisering.
5. ekstraksjon av metabolitter fra kultivert celler
- Tilsett 800 μL av 99,7% metanol per kultur rett. Forsiktig rock hver kultur parabolen frem og tilbake for å dekke hele overflaten. La rettene ligge i romtemperatur i 30 s.
- Tilsett langsomt 550 μL av den fortynnede interne standardoppløsningen per tallerken ved å senke tuppen av pipette inn i metanol og pipettering forsiktig opp og ned flere ganger.
- Forsiktig rock hver kultur parabolen frem og tilbake for å dekke hele overflaten.
- La rettene ligge i romtemperatur i 30 s.
6. ultrafiltrering av celle ekstrakter
- Overfør den utpakkede løsningen fra hver kultur rett til en separat 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
- Sentrifuger rørene ved 2 300 × g ved 4 ° c i 5 min.
- Overfør 350 μL av hver supernatanten i to sentrifugal filter enheter per prøve.
Merk: fra hver kultur tallerken overføres totalt 700 μL av den utpakkede oppløsningen til to filter rør (350 μL/slange). - Sentrifuger filter rørene ved 9 100 × g ved 4 ° c i ca. 2 timer til det ikke er væske igjen i filter koppene.
- Fjern filter koppene og tett lukke lokkene på oppsamlings rørene.
7. prøve fordampning
- Forbered en sentrifugal fordamper-vanligvis består dette av en fordamper, en kald felle, og en vakuumpumpe.
- Plasser oppsamlings rørene i sentrifugal fordamperen.
Merk: La lokkene på rørene stå åpne. - Fordamper de utpakkede prøve løsningene under vakuum forholdene ved romtemperatur.
Merk: typiske konfigurasjoner for antall rotasjoner og trykk er 1 500 RPM og 1 000 pa, henholdsvis, og det tar vanligvis ca 3 t til helt fordampe prøvene. - Bekreft at ingen væske forblir i noen av samle rørene og Lukk lokkene på rørene tett.
- Oppbevar Prøvetakings rørene i en ultra-lav temperatur (− 80 ° c) fryser til metabolomic analyse.
8. Metabolomic analyse av CE-MS
- Resuspend Filtrer i 50 til ultrarent vann rett før CE-MS analyse.
- Utfør CE-MS analyse av metodene som er beskrevet tidligere12,13 ved hjelp av kapillær elektroforese system og time-of-Flight Mass spektrometer system utstyrt med en isocratic pumpe, en CE-MS adapter, og en CE-ESI-MS sprayer.
Merk: begge systemene kan styres av programvaren til systemet leverandører og er forbundet med en smeltet silica kapillær (50 μm indre diameter × 80 cm total lengde).- Sett opp instrumenter og prøve hetteglass, Forbered kapillær med en kapillær kassett, etterfylle skjede væsker og passende elektroforese buffere avhengig av anion eller modus analyse, og deretter bruke spenninger.
Merk: instrumentering og analytiske forhold er beskrevet i detalj andre steder12,13. - Åpne programvaren og klargjør en arbeidsliste som inneholder metoder for innhenting av data og eksempel informasjon.
- Start en testkjøring og sjekk dataene som signal intensiteten og toppformen til interne standarder og topp oppløsningen til andre standard forbindelser.
- Finjuster de analytiske forholdene ved behov.
- Injiser prøve løsningene på 50 mbar for 3 s og en spenning på 30 kV.
Merk: CE-MS ble utført enten i positiv eller negativ ion-modus. Angi spektrometer for å skanne masse området m/z 50 – 1000. Kapillær spenningen ble satt til 4 kV; strømningshastigheten av nitrogen gass (varmeapparatet temperatur 300 ° c). For positiv modus, fragmentor, skimmer og OCT RFV spenning ble satt på 75, 50 og 125 V, henholdsvis. For negativ ion modus, fragmentor, skimmer, og OCT RFV spenning ble satt på 100, 50, og 200 V, henholdsvis.
- Sett opp instrumenter og prøve hetteglass, Forbered kapillær med en kapillær kassett, etterfylle skjede væsker og passende elektroforese buffere avhengig av anion eller modus analyse, og deretter bruke spenninger.
- Analysere spektrum data.
- Pakk topper fra massen Spectral data ved hjelp av automatisk integrasjon programvare for å få topp informasjon, inkludert m/z, peak Area, og migrasjon tid (Mt).
Merk: metoden er beskrevet i detalj andre steder14. - Ekskluder signal topper som tilsvarer isotopomers, epoxyaddukt ioner og andre produkt ioner av kjente metabolitter.
- Kommenter gjenværende topper med informasjon fra HMT metabolitten-database i henhold til m/z- verdier og MTS.
- Normalisere områder i de kommenterte toppene til interne standard nivåer og antall celler per utvalg.
- Evaluere konsentrasjonen av hver metabolitten i den kultivert celler (pmol/106 celler) ved hjelp av standard kurver forberedt for hver metabolitten.
- Bruk kvantifisert metabolitten konsentrasjoner for etterfølgende statistiske analyser og biologiske tolkninger14.
- Pakk topper fra massen Spectral data ved hjelp av automatisk integrasjon programvare for å få topp informasjon, inkludert m/z, peak Area, og migrasjon tid (Mt).
Representative Results
Siden metabolitten konsentrasjoner i kreftceller (pmol/106 celler) er normalisert til antall levedyktige celler, eksperimentelle forhold bør settes opp med forsiktighet for å minimere variasjon i antall levedyktige celler mellom forholdene. For eksempel var diamide behandling på en relativt høy konsentrasjon (250 μm), men for en kort tid slik at alle cellene til å vokse så likt som mulig, og dermed equalizing antall levedyktige celler analysert. Under disse eksperimentelle forhold, HCC827 og PC-9 celler vokste like for 3 h (figur 1). CE-MS analyse av diamide celler sammenlignet med PBS-behandlet (kontroll) celler avslørte 175 og 150 differensial metabolitter i HCC827 og PC-9-celler, henholdsvis. Blant disse var flere mellom produkter i den pentose fosfat veien (PPP) og i øvre Glykolysen signifikant høyere i de diamide forholdene i begge cellelinjene, mens et par tricarboxylic yre (TCA) syklus mellom produkter var lavere i de behandlede forhold (figur 2 og Figur 3).
PPP genererer redusere ekvivalenter i form av redusert nikotinamid adenine dinucleotide fosfat (NADPH), som brukes for Redox homeostase vedlikehold og fatty acid biosyntesen15. Etter diamide behandling, nivået av gluconic syre-en oksidert glukose-økt 12-fold i HCC827 celler og 10-Fold i PC-9-celler; tilsvarende, etter diamide behandling, nivået av glukose 6-fosfat (G6P)-en fosforylert glukose og det første heksokinase-katalysert Glykolysen produkt-også økt 6,3-og 3,5-fold i HCC827 og PC-9 celler, henholdsvis (Figur 4). I tillegg, etter diamide behandling, nivåene av 6-phosphogluconate (6PG)-den første mellomliggende i PPP-dramatisk økt 89-fold i HCC827 celler og 231-fold i PC-9-celler i forhold til nivåene sett i PBS kontroller (Figur 4). I kontrastnivåer av andre glycolytic mellom produkter, for eksempel fruktose 6-fosfat (F6P) og fruktose 1, 6-bisphosphate (F1, 6P), endret ikke i diamide eksperimentelle tilstand (Figur 4). Totalt nikotinamid adenine dinucleotide fosfat (NADP+) nivåer var nesten tilsvarende mellom diamide behandling og PBS kontroll forhold (Figur 4), noe som tyder på at glukose var hovedsakelig catabolized via PPP.
Figur 1. Uendret celle tall ved diamide behandling. Cellevekst reaksjoner på 250 μm av diamide ble målt ved hjelp av trypan blå farging. Cellenumrene til (A) HCC827 og (B) PC-9-celler behandlet med PBS (blå) eller diamide (rød; 250 μm) for 1 eller 3 timer vises. Data vises som gjennomsnittet ± SD (n = 6). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative MS topper av metabolitter. Electropherograms kommenterte som (A) gluconic acid, (B) GLUKOSE 6-fosfat (G6P), (C) 6-Phosphogluconate (6PG), og (D) nikotinamid ADENINE dinucleotide FOSFAT (NADP+) innhentet av CE-MS analyse. Hver linje angir cellelinjen (fast, HCC827; prikket, PC-9) og behandling (blå, PBS; rød, diamide) som brukes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Metabolome profiler av intracellulære metabolitter. Fold endringer av metabolitter i (A) HCC827 og (B) PC-9 celler behandlet med diamide vises som log2(diamide/PBS). Totalt ble 175 og 150 metabolitter kommentert i henholdsvis HCC827-og PC-9-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Up-regulering av PPP ved diamide behandling. Intracellulære konsentrasjoner (pmol/106 celler) av viktige metabolitter involvert i Glykolysen og pentose fosfat sti (PPP) etter behandling med diamide er vist. Metabolitter ble utvunnet fra HCC827 og PC-9-celler behandlet med PBS (blå) eller diamide (rød, 250 μm) i 30 min. representative metabolitter som gluconic syre, glukose 6-fosfat (G6P), fruktose 6-fosfat (F6P), 6 -phosphogluconate (6PG), og nikotinamid adenine dinucleotide FOSFAT (NADP+) vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her beskriver vi en allment tilgjengelig metodikk for å forberede metabolitter fra kulturperler av kultivert kreftceller for CE-MS-baserte metabolomic analyse. En av de mest kritiske punktene i denne protokollen er riktig utarbeidelse av kreftceller, fordi målt metabolitten konsentrasjoner er normalisert til antall levedyktige celler. For nøyaktig estimering av celle nummer, er det nødvendig å utarbeide minst en ekstra kultur parabolen per eksperimentell gruppe for å telle antall levedyktige celler parallelt med ekstraksjon av metabolitter for metabolomic analyse. I tillegg bør det samme antall celler bli sådd i hver rett for de replikerer og i parabolen for telling; i fremtiden, vil dette bli hjulpet av en rask og stressor (f. eks Trypsin-Free) celle telling protokoll som gjør at samme rett til å bli brukt til både å telle levedyktige celler og utvinne metabolitter. Forsiktighet bør utvises under vask, slik at cellene ikke løsner fra overflaten av rettene. Alvorlige cytotoksisitet tester og andre eksperimenter som reduserer celle vedheft, kan være uegnet for denne utvinnings protokollen på grunn av potensielt tap av celler under vaskeprosessen.
Det er viktig å bruke en 5% mannitol løsning som vaskebuffer for å utvinne metabolitter fra kultivert celler for CE-MS-baserte metabolomic analyse, fordi salt-baserte buffere, som PBS, forstyrrer metabolomic analyse og negativt påvirke målingen.
To eller tre retter kan kombineres som et enkelt utvalg av individuelt utvinne metabolitter fra hver tallerken og deretter pooling prøver; men å kombinere flere retter øker ofte gjenværende mannitol i den utpakkede metabolitten løsning. Dette kan også påvirke metabolomic analyse av CE-MS. Derfor anbefales det å ikke bruke flere retter eller brønner som en enkelt prøve.
Denne metabolomic analysemetoden med CE-MS er utviklet for omfattende måling av molekyler med molekylære vekter mellom 50 og 1000 da; Dermed er denne protokollen optimalisert for ekstraksjon av vandige, lav molekylvekt forbindelser. Derfor er denne protokollen ikke egnet for å utvinne hydrofobe metabolitter som lipider eller makromolekyler som proteiner og nukleinsyre syrer. Siden det er en økende etterspørsel etter omfattende lipid analyser eller lipidomics av kultivert celleprøver, utvikling av en enkel og effektiv protokoll for samtidig ekstraksjon av både hydrofile og hydrofobe metabolitter er nødvendig.
Det første trinnet av metabolitten ekstraksjon-aspirating medium og vaske celler med mannitol-bør gjennomføres så raskt som mulig for å minimere endringer i metabolsk profil av cellene. Behandling av celler med metanol etter vask med mannitol antas å denaturere proteiner og dermed hindre enzymer fra katalyserende ytterligere metabolske reaksjoner. Men selv etter metanol behandling, ikke-enzymatisk kjemiske reaksjoner-som Redox reaksjoner, noen dekarboksylering prosesser, og tiolderivat sammenhengene-kan finne sted. Som sådan bør alle konsentrasjoner av metabolitter som er involvert i disse reaksjonene som måles av denne protokollen, tolkes med forsiktighet. I motsetning til Genova eller transcriptome, består metabolome av molekyler med et bredt utvalg av kjemiske egenskaper; Derfor kan ingen enkelt protokoll trekke ut alle metabolitter uten tap eller forstyrrelse. For mer nøyaktige målinger av slike svært reaktive metabolitter, en protokoll spesielt utformet for å trekke ut visse grupper av metabolitter, som krever fraksjoneringer og derivatizations, bør konsulteres. Protokollen som presenteres her, men beskriver en enkel og rask ekstraksjon av vandige metabolitter fra kultivert celleprøver for metabolomic analyse av CE-MS. I denne utredningen vi ikke kunne beskrive hvordan du setter opp CE-MS i detalj fordi fokuset i dagens manuskript er forskjellig, men beskriver detaljert fremgangsmåte for å sette opp CE-MS kan kreve en egen dedikert artikkel.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av Shonai Regional Industry Promotion Center for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet delvis av forskningsmidler fra Yamagata Prefecture og Tsuruoka City, av National Cancer Center forskning og utvikling Fund [gi nummer 28-A-9], og av Japan Society for fremme av vitenskap (JSP) KAKENHI [gi nummer 17K07189] til HM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
| Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
| CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
| CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
| CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
| Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
| Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
| Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
| Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
| Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
| Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
| D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
| Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
| Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
| Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
| HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
| Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
| Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
| Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
| Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
| Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
| PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
| Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ·cm pure water |
| Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |
References
- Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).
- Soga, T. Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming. Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and Cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Fukuda, H., et al. Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection. European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).
- Miles, K. A., Williams, R. E. Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism. Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes. Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).
- Makinoshima, H., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).
- Makinoshima, H., et al. Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).
- Makinoshima, H., et al. Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma. Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).
- Sato, Y., et al. Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1129 (2018).
- Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).
- Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Patra, K. C., Hay, N. The pentose phosphate pathway and cancer. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).
