Summary
इस अनुच्छेद के उद्देश्य के लिए metabolomic विश्लेषण, विशेष रूप से, केशिका electrophoresis-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए सुसंस्कृत आसंजन कोशिकाओं से जलीय चयापचयों के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
Abstract
Metabolomic विश्लेषण एक होनहार omics दृष्टिकोण न केवल सामान्य कोशिकाओं की तुलना में कैंसर की कोशिकाओं में विशिष्ट चयापचय विनियमन को समझने के लिए, लेकिन यह भी प्रारंभिक चरण के कैंसर का पता लगाने और कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी के लिए biomarkers की पहचान करने के लिए है कैंसर के मरीज हैं । Metabolomic विश्लेषण के लिए एक समान नमूने की तैयारी एक महत्वपूर्ण मुद्दा है कि दूर किया जा करने के लिए रहता है । यहाँ, हम केशिका electrophoresis-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CE-MS) का उपयोग कर metabolomic विश्लेषण के लिए सुसंस्कृत आसंजन कोशिकाओं से जलीय चयापचयों निकालने के लिए एक आसान और विश्वसनीय प्रोटोकॉल मौजूद. संवर्धित कोशिकाओं से जलीय चयापचयों का विश्लेषण कर रहे हैं और कोशिकाओं को धोने, मेथनॉल के साथ कोशिकाओं के इलाज, चयापचयों निकालने, और CE-MS विश्लेषण के लिए स्पिन स्तंभों के साथ प्रोटीन और अणुओं को हटाने. प्रतिनिधि फेफड़ों के कैंसर सेल diamide, एक ऑक्सीडेटिव अभिकर्मक के साथ इलाज लाइनों का उपयोग कर परिणाम, ऑक्सीडेटिव तनाव के तहत कोशिकाओं के स्पष्ट रूप से नमूनीय चयापचय बदलाव का वर्णन । इस अनुच्छेद के छात्रों और metabolomics अनुसंधान में शामिल जांचकर्ताओं के लिए विशेष रूप से मूल्यवान होगा, जो सेल लाइनों से CE-MS द्वारा विश्लेषण के लिए फसल चयापचयों के लिए नए हैं.
Introduction
Otto warburg ने कहा कि कैंसर की कोशिकाओं को ग्लूकोज लेने के लिए असामांय करने की क्षमता प्राप्त है और यह पर्याप्त ऑक्सीजन की उपस्थिति में लैक्टेट उत्पादन के लिए किण्व-warburg प्रभाव या एरोबिक ग्लाइकोलिसिस1,2के रूप में बताया घटना । माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दोष कैंसर की कोशिकाओं में एरोबिक ग्लाइकोलिसिस के लिए अंतर्निहित आधार के रूप में speculated हैं3. दरअसल, वारबर्ग प्रभाव ट्यूमर इमेजिंग के लिए आधार है fluorodeoxyglucose (fdg)-पॉजिट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), जो व्यापक रूप से नैदानिक अभ्यास में प्रयोग किया जाता है4,5. एरोबिक ग्लाइकोलिसिस की एक उच्च दर कैंसर की एक प्रमुख विशेषता माना जाता है और हाल ही में एक अच्छी तरह से जाना जाता है के रूप में अपनाया गया है "कैंसर की पहचान," के रूप में डी Hanahan और बी Weinberg द्वारा वर्णित6। Oncogenes और ट्यूमर दबानेवाला जीन में कायिक म्यूटेशन-जैसे एचरास/kras/एनआरए, egfr, braf, myc, TP53, isocitrate डिहाइड्रोजनेज (idh), और fumarate hydratase (एफ एच )-कैंसर की कोशिकाओं में विशिष्ट चयापचय परिवर्तन करने के लिए जोड़ा गया है, Warburg प्रभाव7का परिणाम माना जाता है ।
Metabolomic विश्लेषण एक आशाजनक दृष्टिकोण न केवल कैंसर की कोशिकाओं में चयापचय विनियमन को समझने के लिए, लेकिन यह भी प्रारंभिक चरण के कैंसर biomarkers और कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया भविष्यवाणी की पहचान करने के लिए है । विरोधी यौगिकों के साथ संवेदनशील या प्रतिरोधी कैंसर कोशिकाओं के उपचार के बाद, उनके चयापचय प्रतिक्रियाओं की ट्रैकिंग कैंसर रोगियों में विशिष्ट विरोधी चिकित्सा की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए चयापचय biomarkers की पहचान को सुविधाजनक बनाता है8 ,9,10,11. इस लेख में, कैंसर कोशिका लाइनों के साथ एक फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता एक egfr उत्परिवर्तन के साथ माना जाता है, जो ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनता है-metabolomic विश्लेषण के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया । केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CE-MS) का उपयोग कर इस विश्लेषणात्मक विधि का लाभ व्यापक रेंज m/z 50-100012,13के साथ चार्ज चयापचयों इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए novices प्रदान करने के लिए एक विस्तृत पदश: सभ्य कैंसर कोशिकाओं और बाद में metabolomic विश्लेषण से जलीय चयापचयों की तैयारी के लिए दृश्य प्रोटोकॉल, विशेष रूप से CE-MS.
Protocol
1. दिन 1 पर सेल संस्कृति
नोट: metabolite निष्कर्षण के लिए प्रत्येक नमूना एक एकल १०० मिमी ऊतक संस्कृति पकवान से तैयार किया जाना चाहिए कि मध्यम लेकिन पूरी तरह से नहीं है (लगभग 2-5 मिलियन कोशिकाओं युक्त) संगम । परख के लिए आवश्यक व्यंजन की संख्या की गणना और उंहें तदनुसार तैयार करते हैं ।
- HCC827-१६४० मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक-5% CO2 में ३७
- १०० mm संस्कृति व्यंजन से कोशिका संस्कृति मीडिया aspirate ।
- कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना फॉस्फेट buffered खारा (PBS) समाधान के 2 मिलीलीटर का उपयोग कर प्रत्येक डिश पर कोशिकाओं को धो लें । धीरे से प्रत्येक डिश रॉक ताकि PBS समाधान पूरी तरह से पकवान की सतह को शामिल किया गया ।
- संस्कृति व्यंजन से धो बफर महाप्राण ।
- गर्म ०.२५% trypsin-EDTA समाधान के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और एक 5 मिलीलीटर सीरम विज्ञानी pipette के साथ trypsin के 2 मिलीलीटर-EDTA समाधान जोड़ें । धीरे से प्रत्येक डिश रॉक ताकि ट्रिपसिन पूरी तरह से पकवान की सतह को शामिल किया गया ।
- लगभग 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर संस्कृति व्यंजन सेते ।
- प्रति डिश पूर्व गरम पूर्ण विकास माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें । मध्यम में कोशिकाओं को धीरे से कई बार pipetting द्वारा निलंबित ।
- प्रत्येक कोशिका निलंबन को एक अलग 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र पर ८०० × g में 5 मिनट के लिए स्थानांतरित करें ।
- पूर्व गरम पूर्ण विकास के माध्यम से 2 मिलीलीटर में प्रत्येक सेल गोली resuspend ।
- स्वचालित कक्ष काउंटर और ०.४% trypan नीला समाधान का उपयोग करके कक्षों की कुल संख्या और प्रतिशत व्यवहार्यता निर्धारित करें ।
- सेल निलंबन के 10 μL और ०.४% trypan ब्लू समाधान के 10 μL मिश्रण ।
- सेल कार्रवाई के माध्यम से कक्ष गिनती चैंबर स्लाइड में नमूना के 10 μL लोड ।
- कक्ष स्लाइड को स्वचालित कक्ष काउंटर में संमिलित करें । संचारित प्रकाश स्वचालित रूप से illuminates और साधन ऑटो सेल पर केंद्रित है ।
- छवि कैप्चर करने के लिए कैप्चर बटन दबाएँ और परिणाम प्रदर्शित करें ।
- यदि आवश्यक हो, तो वांछित कोशिका एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आगे विकास माध्यम जोड़ें ।
- बीज लगभग 1-2.5 लाख १०० मिमी सेल संस्कृति पकवान प्रति कोशिकाओं ।
नोट: Metabolite सांद्रता से निर्धारित CE-MS विश्लेषण व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के आधार पर सामान्यीकृत किया जाएगा. सेल गिनती के प्रयोजन के लिए, यह प्रत्येक समूह के लिए कम से एक अतिरिक्त वरीयता प्राप्त संस्कृति पकवान तैयार करने के लिए आवश्यक है । - 18 ज के लिए ३७ ° c पर 5% CO2 में संस्कृति व्यंजन सेते ।
2. अभिकर्मकों की तैयारी
- L-methionine सल्फॉन और डी-कपूर-10-सल्फॉनिक एसिड १०००-ultrapure पानी में गुना सहित एक वाणिज्यिक आंतरिक मानक समाधान पतला ।
नोट: ८० से कम नमूनों के लिए, बस आंतरिक मानक समाधान के ५० μl मिश्रण 1 और ४५ मिलीलीटर ultrapure पानी के एक ५० मिलीलीटर आयतनी flask में, तो ultrapure पानी के साथ समाधान करने के लिए ५० मिलीलीटर ले आओ । - एक ०.०५ जी/एमएल mannitol समाधान में ultrapure पानी धोने बफर के रूप में तैयार करें ।
नोट: 30 से कम नमूनों के लिए, बस 25 ग्राम mannitol के ५०० मिलीलीटर में ultrapure पानी भंग । धोने बफर के लगभग 15 मिलीलीटर १०० मिमी संस्कृति पकवान प्रति आवश्यक है, इसलिए नमूनों की संख्या के अनुसार धोने बफर की एक पर्याप्त मात्रा तैयार ।
3. पूर्व धोने केंद्रापसारक फ़िल्टर इकाइयों
- एक केंद्रापसारक फ़िल्टर इकाई के फिल्टर कप में ultrapure पानी के pipette २५० μL ( सामग्री की मेजदेखें) ।
नोट: नमूना प्रति दो फ़िल्टर इकाइयों की आवश्यकता है । - 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर इकाइयों को कसकर और ९,१०० × जी पर अपकेंद्रित्र कैप ।
- प्रत्येक छानना की मात्रा की जांच करें-यदि महत्वपूर्ण छानना पहली छोटी स्पिन के दौरान जमा है, फिल्टर इकाई दोषपूर्ण हो सकता है । इस स्थिति में, फ़िल्टर इकाई छोड़ें और इसके बजाय एक नई फ़िल्टर इकाई का उपयोग करें ।
- बंद फिल्टर इकाइयों के lids कसकर और अपकेंद्रित्र फिर से ९,१०० × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ।
- किसी भी फिल्टर कप में कोई ultrapure पानी नहीं रहता है कि यह सुनिश्चित करें; एक पिपेट के साथ प्रत्येक संग्रह ट्यूब में फ़िल्टर्ड ultrapure पानी निकालें और त्यागने ।
नोट: एक पिपेट के साथ एक फिल्टर कप में अवशिष्ट पानी को हटाने की कोशिश नहीं के रूप में यह फिल्टर को नुकसान हो सकता है । - फिल्टर कप उनके संग्रह ट्यूबों में बदलें ।
नोट: फिल्टर सुखाने पर क्षतिग्रस्त हो सकता है के बाद से एक घंटे के भीतर केंद्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग करें ।
4. दिन 2 पर सेल संस्कृति
-
इनक्यूबेटर से १०० एमएम कल्चर डिश बाहर निकालिए ।
नोट: अनुशंसित कक्ष culture अवधि 18 h है । - प्रत्येक १०० मिमी संस्कृति पकवान से कोशिका संस्कृति माध्यम aspirate.
- कोशिका संस्कृति माध्यम है कि यौगिकों या प्रत्येक डिश के लिए दवाओं की उचित सांद्रता भी शामिल है की 10 मिलीलीटर जोड़ें, देखभाल करने के लिए सेल परत परेशान नहीं है ।
नोट: प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, हम इस प्रयोग में २५० मिमी diamide के PBS (अंतिम २५० μM की एकाग्रता) में भंग की 10 μL जोड़ा । - एक नियंत्रण के रूप में diamide या PBS की उपस्थिति में 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर संस्कृति व्यंजन सेते ।
- प्रत्येक १०० मिमी संस्कृति पकवान से कोशिका संस्कृति माध्यम aspirate.
- धीरे से एक डिश के किनारे करने के लिए 5% mannitol समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोने, सेल परत को परेशान करने के लिए नहीं करने के लिए ध्यान रखना, तो थोड़ा पकवान झुकाव ।
नोट: PBS या खारा समाधान CE-MS-आधारित metabolomic विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप और प्रतिकूल माप परिणामों को प्रभावित करता है, और इस प्रकार धोने बफ़र के रूप में उपयोग नहीं किया जाना चाहिए । - प्रत्येक संस्कृति डिश से धो बफर aspirate, तो धीरे से धोने के प्रति डिश बफर के 10 मिलीलीटर और थोड़ा झुकाव पकवान जोड़ने से कोशिकाओं को फिर से धो लें ।
- पूरी तरह से प्रत्येक संस्कृति पकवान के किनारे से धो बफर महाप्राण ।
नोट: संभव के रूप में ज्यादा धोने बफर के रूप में महाप्राण, जबकि ध्यान दे कोशिकाओं को महाप्राण नहीं है । अवशिष्ट mannitol CE-MS विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं; कोशिकाओं की आकांक्षा कोशिकाओं की संख्या में कमी आएगी और इस प्रकार डेटा सामान्यीकरण में त्रुटि का एक स्रोत बन जाएगा ।
5. सुसंस्कृत कोशिकाओं से चयापचयों का निष्कर्षण
- संस्कृति पकवान प्रति ९९.७% मेथनॉल के ८०० μL जोड़ें । धीरे प्रत्येक संस्कृति पकवान रॉक आगे और पीछे अपनी पूरी सतह को कवर करने के लिए । 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर बर्तन छोड़ दें ।
- धीरे से मेथेनॉल में पिपेट की नोक डुबो और धीरे ऊपर और नीचे कई बार पिपेट द्वारा डिश प्रति पतला आंतरिक मानक समाधान के ५५० μl जोड़ें ।
- धीरे प्रत्येक संस्कृति पकवान रॉक आगे और पीछे अपनी पूरी सतह को कवर करने के लिए ।
- 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर बर्तन छोड़ दें ।
6. कोशिका के अर्क के ultraनिस्यंदन
- एक अलग १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए प्रत्येक संस्कृति डिश से निकाले समाधान स्थानांतरण ।
- २,३०० × g पर ट्यूब को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करते हैं ।
- नमूना प्रति दो केंद्रापसारक फिल्टर इकाइयों में प्रत्येक supernatant के ३५० μL स्थानांतरण ।
नोट: प्रत्येक संस्कृति डिश से, निकाले समाधान के ७०० μL की कुल दो फिल्टर ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया जाता है (३५० μL/ - ९,१०० × जी पर लगभग 2 ज के लिए कोई तरल फिल्टर कप में रहता है जब तक 4 ° c पर फिल्टर ट्यूबों अपकेंद्रित्र ।
- फिल्टर कप निकालें और कसकर संग्रह ट्यूबों के lids बंद ।
7. नमूना वाष्पीकरण
- एक केंद्रापसारक वाष्पक तैयार-आमतौर पर, यह एक वाष्पक, एक ठंडा जाल, और एक वैक्यूम पंप के होते हैं ।
- केन्द्रापसारक वाष्पक में संग्रह ट्यूबों रखें ।
नोट: ट्यूबों के lids खुला छोड़ दें । - वाष्पित होना निर्वात शर्तों के तहत निकाले गए नमूना समाधान कमरे के तापमान पर ।
नोट: rotations और दबाव की संख्या के लिए विशिष्ट विंयास १,५०० rpm और १,००० Pa, क्रमशः रहे हैं, और यह आमतौर पर लगभग 3 एच लेता है पूरी तरह से नमूनों लुप्त हो जाना । - कोई तरल संग्रह ट्यूब में से किसी में रहता है और कसकर ट्यूबों के lids बंद की पुष्टि करें ।
- एक अल्ट्रा कम तापमान में संग्रह ट्यूबों (− ८० डिग्री सेल्सियस) metabolomic विश्लेषण तक डीप फ्रीजर स्टोर ।
8. CE द्वारा metabolomic विश्लेषण-MS
- CE-MS विश्लेषण से पहले तुरंत ultrapure पानी की ५० μL में छानना निलंबित ।
- एक isocratic पंप, एक ce-ms एडाप्टर, और एक ce-ईएसआई-एमएस स्प्रेयर के साथ सुसज्जित केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली और समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमीटर प्रणाली का उपयोग कर पहले से12,13 वर्णित तरीकों से CE-ms विश्लेषण करते हैं ।
नोट: दोनों प्रणालियों सिस्टम विक्रेताओं के सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है और एक संगलित सिलिका केशिका (५० μm आंतरिक व्यास × ८० सेमी कुल लंबाई) से जुड़े हैं ।- उपकरणों और नमूना शीशियों की स्थापना की, एक केशिका कैसेट के साथ केशिका तैयार, एक प्रकार का वृक्ष तरल पदार्थ और ऋणायन या कटियन विश्लेषण मोड के आधार पर उपयुक्त वैद्युतकणसंचलन बफ़र्स भरने, और फिर voltages लागू करें.
नोट: इंस्ट्रूमेंटेशन और विश्लेषण संबंधी स्थितियों में12,13कहीं विस्तार से वर्णित हैं । - सॉफ़्टवेयर खोलें और डेटा प्राप्ति विधियां और नमूना जानकारी युक्त worklist तैयार करें ।
- एक परीक्षण रन शुरू करने और संकेत तीव्रता और आंतरिक मानकों और अन्य मानक यौगिकों की चोटी संकल्प के शिखर आकार जैसे डेटा की जाँच करें ।
- यदि आवश्यक हो तो विश्लेषणात्मक स्थितियों को ठीक-ट्यून ।
- 3 एस के लिए ५० mbar और 30 केवी की एक वोल्टेज पर नमूना समाधान सुई.
नोट: CE-MS या तो सकारात्मक या नकारात्मक आयन मोड में आयोजित किया गया था । स्पेक्ट्रोमीटर सेट करने के लिए मास रेंज एम/ केशिका वोल्टेज 4 केवी पर सेट किया गया था; नाइट्रोजन गैस की प्रवाह दर (हीटर तापमान 300 डिग्री सेल्सियस) । सकारात्मक मोड के लिए, fragmentor, पौना और अक्टूबर RFV वोल्टेज क्रमशः ७५, ५० और १२५ V पर सेट किए गए थे । नकारात्मक आयन मोड के लिए, fragmentor, पौना, और अक्टूबर RFV वोल्टेज क्रमशः १००, ५० और २०० V पर सेट किया गया था ।
- उपकरणों और नमूना शीशियों की स्थापना की, एक केशिका कैसेट के साथ केशिका तैयार, एक प्रकार का वृक्ष तरल पदार्थ और ऋणायन या कटियन विश्लेषण मोड के आधार पर उपयुक्त वैद्युतकणसंचलन बफ़र्स भरने, और फिर voltages लागू करें.
- स्पेक्ट्रम डेटा का विश्लेषण करें ।
- एम/जेड, पीक क्षेत्र, और माइग्रेशन समय (एमटी) सहित पीक जानकारी प्राप्त करने के क्रम में स्वत: एकीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मास स्पेक्ट्रल डेटा से चोटियों को निकालने.
नोट: विधि विवरण में14कहीं वर्णन किया गया है । - आइसोटोप, अभिवाहिनी आयनों, और ज्ञात चयापचयों के अन्य उत्पाद आयनों के लिए इसी संकेत चोटियों को बाहर निकालें.
- एम/जेड वैल्यू और एमटीएस के अनुसार एचएमटी मेटाबेलाइट डाटाबेस से जानकारी के साथ शेष चोटियों को एनोटेट करें ।
- आंतरिक मानक स्तर और नमूने प्रति कोशिकाओं की संख्या के लिए एनोटेटिड चोटियों के क्षेत्रों को सामान्य.
- प्रत्येक चयापचय के लिए तैयार मानक घटता का उपयोग कर सुसंस्कृत कोशिकाओं (pmol/106 कोशिकाओं) में प्रत्येक metabolite की एकाग्रता का मूल्यांकन.
- बाद के सांख्यिकीय विश्लेषणों और जैविक व्याख्याओं के लिए मात्रात्मक चयाप्लाइटसांद्रता का उपयोग करें ।
- एम/जेड, पीक क्षेत्र, और माइग्रेशन समय (एमटी) सहित पीक जानकारी प्राप्त करने के क्रम में स्वत: एकीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मास स्पेक्ट्रल डेटा से चोटियों को निकालने.
Representative Results
के बाद से कैंसर की कोशिकाओं में metabolite सांद्रता (pmol/106 कोशिकाओं) व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं, प्रायोगिक शर्तों की देखभाल के साथ स्थापित किया जाना चाहिए ताकि स्थितियों के बीच व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में भिन्नता को कम करने के लिए. उदाहरण के लिए, diamide उपचार एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता (२५० μm) पर था, लेकिन एक कम समय के लिए सभी कोशिकाओं के रूप में समान रूप से संभव के रूप में विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए, जिससे विश्लेषण व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या बराबरी । इन प्रायोगिक स्थितियों के तहत, HCC827 और पीसी-9 कोशिकाओं 3 एच के लिए समान रूप से बढ़ी (चित्रा 1). CE-एमएस विश्लेषण diamide का इलाज कोशिकाओं के साथ तुलना में PBS इलाज (नियंत्रण) कोशिकाओं से पता चला १७५ और १५० विभेदक चयापचयों में HCC827 और पीसी-9 कोशिकाओं, क्रमशः. इनमें से, पेन्टोज फॉस्फेट पथ (पीपीपी) और ऊपरी ग्लाइकोलिसिस में कई मध्यवतयों में दोनों कोशिका रेखाओं में डायमाइड उपचारित दशाओं में काफी अधिक थे, जबकि उपचारित में कुछ ट्राइकैक्सिलिक अम्ल (टीसीए) चक्र मध्यवर्ती कम थे । शर्तें (चित्रा 2 और चित्रा 3).
पीपीपी कम निकोटीनेमाइड एडिनिन डाईन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट (एनएडीपीएच) के रूप में समकक्ष को कम करती है, जिसका उपयोग रेडॉक्स होमियोस्टैसिस अनुरक्षण और फैटी एसिड जैवसंश्लेषण15के लिए किया जाता है । Diamide उपचार के बाद, gluconic एसिड का स्तर — एक ऑक्सीकरण ग्लूकोज-HCC827 कोशिकाओं में 12 गुना और पीसी-9 कोशिकाओं में 10 गुना वृद्धि हुई; इसी प्रकार डाइराइड उपचार के बाद ग्लूकोस 6 फॉस्फेट (G6P)-फॉस्फोरेटिड ग्लूकोस तथा पहले हैक्सोकाइनेज-उत्प्रेरित ग्लाइकोलिसिस उत्पाद के स्तर में भी ६.३-और ३.५-गुना वृद्धि हुई है । इसके अलावा, diamide उपचार के बाद, 6-phosphogluconate के स्तर (6PG)-पीपीपी में पहली मध्यवर्ती-नाटकीय रूप से वृद्धि हुई ८९-HCC827 कोशिकाओं में गुना और २३१-PBS नियंत्रण में देखा स्तर की तुलना में पीसी-9 कोशिकाओं में गुना (चित्रा 4). इसके विपरीत, अंय glycolytic मध्यवर्ती के स्तर, जैसे फ्रुक्टोज 6-फॉस्फेट (F6P) और फ्रुक्टोज 1, 6-bisphosphate (F1, 6P), diamide प्रायोगिक स्थिति में परिवर्तन नहीं किया (चित्रा 4) । कुल nicotinamide ऐडेनीन डिन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट (nadp+) स्तर diamide उपचार और pbs नियंत्रण की स्थिति के बीच लगभग बराबर थे (चित्रा 4), सुझाव है कि ग्लूकोज मुख्य रूप से पीपीपी के माध्यम से catabolized किया गया था.
चित्रा 1 । Diamide उपचार पर अपरिवर्तित सेल नंबर । Diamide के २५० μm करने के लिए सेल वृद्धि प्रतिक्रियाओं trypan ब्लू धुंधला का उपयोग कर मापा गया । (क) HCC827 और (ख) 1 या 3 ज के लिए पीबीएस (नीला) या डायमाइड (लाल; २५० μm) से उपचारित पीसी-9 कोशिकाएँ दर्शाए गए हैं । डेटा माध्य ± SD (n = 6) के रूप में दिखाए जाते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 । प्रतिनिधि चयापचयों के एमएस चोटियों । (क) ग्लूकोनिक अम्ल, (ख) ग्लूकोस 6-फॉस्फेट (G6P), (ग) 6-फॉस्फोग्लूकोनेट (6pg), और (घ) निकोटिनामाइड एडिनिन डाईन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट (एनएडीपी प्रत्येक पंक्ति कक्ष रेखा (ठोस, HCC827; बिंदीदार, PC-9) और उपचार (नीला, PBS; लाल, diamide) का उपयोग इंगित करता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 । Intracellular चयापचयों के मेटाकोसोम प्रोफाइल. (क) में चयापचयों के परिवर्तन गुना (क) HCC827 और (ख) डाइमाइड के साथ उपचारित पीसी-9 कोशिकाओं को लॉग-2(डाईमाइड/पीबीएस) के रूप में दर्शाया जाता है । कुल में, १७५ और १५० चयापचयों HCC827 और पीसी में एनोटेट थे-9 कोशिकाओं, क्रमशः । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 । ऊपर-पीपीपी के डिमाइड उपचार पर नियमन । Intracellular सांद्रता (pmol/106 कोशिकाओं) ग्लाइकोलिसिस में शामिल कुंजी चयापचयों और पेन्टोस फॉस्फेट मार्ग (पीपीपी) डायमाइड के साथ उपचार के बाद दिखाया गया है । चयापचयों HCC827 से निकाले गए थे और पीसी-9 कोशिकाओं PBS (नीला) या diamide के साथ इलाज (लाल, २५० μm) के लिए gluconic एसिड, ग्लूकोज 6-फॉस्फेट (G6P), फ्रुक्टोज 6-फॉस्फेट (F6P), 6 -फॉस्फोग्लूकोनेट (6Pg), और निकोटीनामाइड एडिनीन डाईन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट (nadp+) दिखाया जाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
Discussion
यहां, हम एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन करने के लिए CE-MS-आधारित metabolomic विश्लेषण के लिए सभ्य कैंसर कोशिकाओं से चयापचयों तैयार । इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक कैंसर की कोशिकाओं की उचित तैयारी है, क्योंकि मापा metabolite सांद्रता व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को सामान्यीकृत हैं. सेल नंबर के सटीक अनुमान के लिए, यह करने के लिए प्रयोगात्मक समूह के प्रति कम से एक अतिरिक्त संस्कृति पकवान तैयार करने के लिए metabolomic विश्लेषण के लिए चयापचयों के निष्कर्षण के साथ समानांतर में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, कोशिकाओं के एक ही नंबर प्रतिकृति के लिए प्रत्येक डिश में और गिनती के लिए पकवान में वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए; भविष्य में, यह एक त्वरित और stressor से सहायता प्राप्त होगा मुक्त (जैसे, trypsin मुक्त) सेल प्रोटोकॉल है कि एक ही डिश दोनों व्यवहार्य कोशिकाओं और निष्कर्षण metabolites गिनती के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है गणना । देखभाल washes के दौरान लिया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं को व्यंजन की सतह से अलग नहीं है । गंभीर साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण और अंय प्रयोगों है कि सेल आसंजन को कम करने के लिए इस निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं की संभावित हानि के कारण इस निकासी प्रोटोकॉल के लिए अनुपयुक्त हो सकता है ।
यह एक 5% mannitol समाधान के रूप में उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है धोने बफर के लिए संवर्धित कोशिकाओं से चयापचयों से निकालने के लिए CE-MS-आधारित metabolomic विश्लेषण, क्योंकि नमक आधारित बफ़र्स, जैसे PBS, metabolomic विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप और प्रतिकूल माप को प्रभावित.
दो या तीन व्यंजन व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक डिश से चयापचयों निकालने और फिर नमूने पूलिंग द्वारा एक एकल नमूना के रूप में जोड़ा जा सकता है; हालांकि, कई व्यंजनों के संयोजन अक्सर निकाले metabolite समाधान में अवशिष्ट mannitol बढ़ जाती है । यह भी metabolomic विश्लेषण के साथ CE-MS के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इसलिए, यह एक एकल नमूना के रूप में कई व्यंजन या कुओं का उपयोग नहीं करने के लिए सिफारिश की है.
इस metabolomic विश्लेषण विधि CE-MS का उपयोग ५० और १००० Da के बीच आणविक भार के साथ आवेशित अणुओं के व्यापक मापन के लिए विकसित किया गया है; इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल जलीय, कम आणविक वजन यौगिकों के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित है । इसलिए, यह प्रोटोकॉल हाइड्रोफोबिक चयापचयों जैसे कि प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्लों जैसे लिपिड्स या मैक्रोलोक्यूल्स को निकालने के लिए उपयुक्त नहीं है । के बाद से वहां व्यापक लिपिड विश्लेषण या संवर्धित सेल नमूनों की lipidomics के लिए एक बढ़ती मांग है, दोनों हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफिलिक चयापचयों के एक साथ निष्कर्षण के लिए एक आसान और प्रभावी प्रोटोकॉल के विकास की जरूरत है ।
Metabolite निष्कर्षण के पहले कदम-aspirating माध्यम और mannitol के साथ कपड़े धोने-कोशिकाओं के चयापचय प्रोफ़ाइल में परिवर्तन को कम करने के लिए के रूप में जल्दी से संभव के रूप में आयोजित किया जाना चाहिए । Mannitol के साथ धोने के बाद मेथनॉल के साथ कोशिकाओं के उपचार denature प्रोटीन करने के लिए ग्रहण कर लिया है और इस तरह आगे चयापचय प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरक से एंजाइमों को रोकने के । हालांकि, मेथनॉल उपचार के बाद भी, गैर एंजाइमेटिक रासायनिक प्रतिक्रियाओं-जैसे रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं, कुछ decarboxylation प्रक्रियाओं, और thiol लिंकेज-हो सकता है । इस तरह, इस प्रोटोकॉल द्वारा मापा इन प्रतिक्रियाओं में शामिल चयापचयों के किसी भी सांद्रता सावधानी से व्याख्या की जानी चाहिए. जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम के विपरीत, metabolome रासायनिक गुणों की एक विस्तृत विविधता के साथ अणुओं के होते हैं; इसलिए, कोई एकल प्रोटोकॉल किसी भी हानि या अशांति के बिना सभी चयापचयों निकाल सकते हैं । ऐसे अत्यधिक प्रतिक्रियाशील चयापचयों के अधिक सटीक मापन के लिए, एक प्रोटोकॉल विशेष रूप से चयापचयों के कुछ समूहों को निकालने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो fractionations और derivatizations की आवश्यकता है, परामर्श किया जाना चाहिए । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल, तथापि, का वर्णन करता है एक सरल और त्वरित निष्कर्षण से जलीय चयापचयों का metabolomic विश्लेषण के लिए CE-MS. इस पत्र में हम वर्णन नहीं कर सकता कैसे स्थापित करने के लिए CE-MS विस्तार में क्योंकि वर्तमान पांडुलिपि का ध्यान अलग है, तथापि, विस्तृत कदम का वर्णन करने के लिए CE-MS सेट एक अलग समर्पित लेख की आवश्यकता हो सकती है ।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम Shonai क्षेत्रीय उद्योग संवर्धन केंद्र के सभी सदस्यों को उनकी मदद के लिए धंयवाद । इस काम के भाग में यामागाता प्रांत और Tsuruoka शहर से अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय कैंसर केंद्र अनुसंधान और विकास कोष द्वारा [अनुदान संख्या 28-A-9], और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा (JSPS) KAKENHI [अनुदान संख्या 17K07189] एचएम ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
| Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
| CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
| CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
| CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
| Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
| Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
| Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
| Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
| Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
| Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
| D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
| Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
| Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
| Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
| HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
| Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
| Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
| Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
| Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
| Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
| PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
| Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ·cm pure water |
| Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |
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