Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

Published: June 9, 2019 doi: 10.3791/59551
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3, 1,2, 4, 1,2,4
1Shonai Regional Industry Promotion Center, 2Tsuruoka Metabolomics Laboratory, National Cancer Center, 3Human Metabolome Technologies, Inc, 4Division of Translational Informatics, Exploratory Oncology Research and Clinical Trial Center, National Cancer Center

Summary

המטרה של מאמר זה היא לתאר פרוטוקול להפקת מטבוליטים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic, במיוחד, אלקטרופורזה-במסה של נימים.

Abstract

ניתוח Metabolomic היא גישה מבטיחה omics לא רק להבין את התקנה מטבולית ספציפית תאים סרטניים לעומת תאים נורמליים אלא גם כדי לזהות סמנים ביואריטים לאיתור מוקדם בשלב הסרטן וחיזוי של תגובת כימותרפיה ב חולי סרטן. הכנת דגימות אחידה לניתוח metabolomic היא נושא קריטי שנותר לטפל בו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול קל ואמין להפקת חילוף חומרים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic באמצעות אלקטרופורזה-המסה של הקפימטריה (CE-MS). מימית מטבוליטים מתאים מתורבתים מנותח על ידי culturing וכביסה תאים, טיפול בתאים עם מתנול, חילוץ מטבוליטים, והסרת חלבונים וקרו עם עמודות ספין עבור ניתוח CE-MS. תוצאות הנציג באמצעות קווי סרטן ריאות התאים שטופלו diamide, מגיב חמצוני, להמחיש את משמרת מטבולית בבירור הנצפה של תאים תחת לחץ חמצוני. מאמר זה יהיה יקר במיוחד לסטודנטים וחוקרים המעורבים במחקר טבולומיקס, מי הם חדשים לאסוף מטבוליטים מקווי התא לניתוח על ידי CE-MS.

Introduction

אוטו ורבורג הבחין כי התאים הסרטניים לרכוש את היכולת יוצא דופן לקחת את הגלוקוז ולהחמיץ אותו כדי לייצר לקטט בנוכחות של חמצן הולם-תופעה כינה אפקט ורבורג או האירובי גליקוליזיס1,2. ליקויים בנשימה מיטוכונדריאלי הם העריכו כבסיס הבסיסי של גליקוליזיס אירובי בתאי סרטן3. אכן, אפקט ורבורג הוא בסיס הדמיה של הגידול על ידי פלואורודיט גלוקוז (fdg)-פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה (PET), אשר נמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה קלינית4,5. שיעור גבוה של גליקולוליזיס אירובי נחשב לתכונה מרכזית של סרטן, שאומצה לאחרונה כאחת הידועות "הסימנים הידועים של סרטן", כפי שמתואר על ידי ד. האנהאן ו ב ויינברג6. מוטציות סומטיים באואונגנים וגנים מדכא גידול-כגון HRAS/קראס/nras, egfr, braf, myc, TP53, isocitrate דהידרוגנאז (idh), ו fumarate הידרואטאז (fh ) — קושרו לשינויים מטבוליים ספציפיים בתאי הסרטן, האמינו כתוצאה מאפקט ורבורג7.

ניתוח Metabolomic היא גישה מבטיחה לא רק כדי להבין את הרגולציה המטבולית בתאים סרטניים אלא גם כדי לזהות מוקדם בשלב ביוארקרס סרטן וחיזוי תגובה כימותרפיה. בעקבות הטיפול של תאים סרטניים רגישים או עמידים עם תרכובות נוגדות סרטן, מעקב אחר תגובות מטבולית שלהם מקלה על זיהוי של בסמנים מטבוליים כדי לנבא את היעילות של טיפולים נוגדי סרטן ספציפיים בחולי סרטן8 ,9,10,11. במאמר זה, תא סרטן קווי נגזר אדנוקרצינומה ריאה עם מוטציה Egfr שטופלו diamide-מה שגורם לחץ חמצוני — שימשו מודלים עבור ניתוח metabolomic. היתרון של שיטה אנליטית זו באמצעות אלקטרופורזה-המסה ספקטרומטריה (CE-MS) הוא מדידה מקיפה של הטעונה מטבוליטים עם טווח מסה m/z 50-100012,13. מטרת מאמר זה היא לספק לטירונים פרוטוקול חזותי מפורט ויזואלי להכנת מטבוליטים מימית מתאי סרטן וניתוח metabolomic עוקבות, במיוחד על ידי CE-MS.

Protocol

1. תרבות התא ביום 1

הערה: כל דוגמה עבור מיצוי המטולייט צריכה להיות מוכנה ממנה אחת של 100 מ"מ בלבד מרקמת רקמה בינוני, אך לא באופן מלא (המכיל כ-2 – 5 מיליון תאים). חשב את מספר המנות הדרושות לצורך הביצוע והכינו אותם בהתאם.

  1. תרבות HCC827 ותאים PC-9 ב 5% CO2 ב 37 ° c ב RPMI-1640 בינונית בתוספת עם 10% סרום העובר (fbs).
  2. ממנה את מדיית התרבות הסלולרית. ממנות התרבות 100 מ"מ
  3. רוחצים את התאים על כל מנה בעזרת 2 מ ל של תמיסת מלח מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום. הסלע בעדינות כל מנה כך הפתרון PBS לחלוטין מכסה את פני השטח של המנה.
  4. . מכבסת התרבות
  5. חם 0.25% טריפסין-EDTA הפתרון ל 37 ° c ולהוסיף 2 מ ל של טריפסין-EDTA פתרון עם הצנרת 5 מ ל בתוספת. מטלטל בעדינות כל מנה כך שהטריפסין מכסה לחלוטין את פני השטח של המנה.
  6. מודקון את מנות התרבות ב 37 ° c עבור כ 5 דקות.
  7. הוסף 4 מ ל של בינוני מראש מחומם לחלוטין הצמיחה לכל מנה. השהה מחדש את התאים במדיום על-ידי ליטוף מספר פעמים בעדינות.
  8. העבר כל השעיה התא לתוך שפופרת 1-mL ו צנטריפוגה נפרדת ב 800 × g עבור 5 דקות.
  9. השהה מחדש את כל הגלולה ב 2 מ ל של מדיום צמיחה מראש מחומם לחלוטין.
  10. קבע את המספר הכולל ואת הכדאיות הכוללת של התאים באמצעות מונה התאים האוטומטי ו-0.4% טרי, פתרון כחול.
    1. מערבבים 10 μL של השעיה לתא ו 10 μL של 0.4% הפתרון הכחול.
    2. טען 10 μL של דגימה לתוך התא ספירת שקופית קאמרית באמצעות נימי הפעולה.
    3. הכנס את השקופית הקאמרית. לתוך מונה התאים האוטומטי האור המשודר מאיר אוטומטית והכלי מתמקד באופן אוטומטי על התא.
    4. לחץ על לחצן הלכידה כדי ללכוד את התמונה ולהציג את התוצאות.
    5. במידת הצורך, להוסיף בינוני גדילה נוסף כדי לקבל את הריכוז הרצוי התא.
  11. זרע כ 1 – 2.5 מיליון תאים לכל 100 מ"מ צלחת תרבות התא.
    הערה: ריכוזי מטבוליט נקבעים על-ידי ניתוח CE-MS יהיה מנורמל על בסיס מספר תאים קיימא. לצורך ספירת תאים, יש צורך להכין לפחות מנה אחת נוספת של תרבות הזריעה עבור כל קבוצה.
  12. מודיית את מנות התרבות ב 5% CO2 ב 37 ° c עבור 18 h.

2. הכנת ריאגנטים

  1. לדלל את הפתרון הפנימי המסחרי כולל L-מתיונין סולפון ו d-קמפור-10-sulfonic חומצה 1000-מקפלים במים באולטרטהורים.
    הערה: עבור פחות מ 80 דגימות, פשוט לערבב 50 μl של התקן הפנימי פתרון 1 ו 45 mL של מים אלקטרופורזה ב בקבוקון מנפח 50 mL, ואז להביא את הפתרון עד 50 ml עם מים באולטרטהורים.
  2. להכין מ0.05 g/mL פתרון ניטול במים באלקטרופורזה כמו מאגר לשטוף.
    הערה: עבור פחות מ 30 דגימות, פשוט לפזר 25 גרם של ניטול ב 500 mL של מים אלקטרופורזה. כ 15 מ ל של מאגר לשטוף נדרש לכל 100 mm מאכל התרבות, כך להכין נפח מספיק של שטיפת מאגר על פי מספר דגימות.

3. כביסה מראש יחידות מסנן צנטריפוגלי

  1. פיפטה 250 μL של מים באולטרסאונד לתוך גביע המסנן של כל יחידת מסנן צנטריפוגלי (ראה את הטבלה של חומרים).
    הערה: יש צורך בשתי יחידות סינון לכל מדגם.
  2. כיסוי יחידות מסנן הדוק צנטריפוגה ב 9,100 × g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  3. בדוק את עוצמת הקול של כל פילטרט — אם פילטרט משמעותי צבר במהלך הספין הקצר הראשון, יחידת הסינון עלולה להיות פגומה. במקרה זה, מחק את יחידת הסינון והשתמש ביחידת סינון חדשה במקום זאת.
  4. סגור את העפעפיים של יחידות מסנן בחוזקה צנטריפוגה שוב ב 9,100 × g ב 4 ° c עבור 30 דקות.
  5. ודא שאין מים בעלי בדיקת אולטרה-טהורות באף אחת מכוסות הפילטר; להסיר את המים באולטרסאונד מסוננים בכל צינור אוסף עם פיפטה ולהשליך.
    הערה: אל תנסו להסיר מים שיורית בגביע מסנן עם פיפטה, כפי שהוא עלול לגרום נזק למסנן.
  6. החלף את כוסות הפילטר בצינורות האוספים שלהם.
    הערה: השתמש ביחידות הסינון הצנטריפוגלי בתוך שעה מאז שהמסננים עלולים להיפגע בעת ייבוש.

4. תרבות התא ביום 2

  1. קחו את מנות התרבות ה100 מילימטר מהאינקובטור.
    הערה: משך תרבות התא המומלץ הוא 18 שעות.
  2. מנושף את מדיום התרבות התאית מכל אחד מכלי התרבות 100 מ"מ.
  3. הוסף 10 מ ל של מדיום תרבות התא הכולל ריכוזים מתאימים של תרכובות או תרופות לכל מנה, מטפל לא להפריע שכבת התא.
    הערה: למטרות הדגמה, הוספנו 10 μL של 250 mM diamide מומס PBS (הריכוז הסופי של 250 μM) בניסוי זה.
  4. מכשלה את מנות התרבות ב-37 ° c למשך 30 דקות בנוכחות diamide או PBS כפקד.
  5. מנושף את מדיום התרבות התאית מכל אחד מכלי התרבות 100 מ"מ.
  6. לשטוף את התאים על ידי הוספת בעדינות 2 מ ל של 5% ניטול פתרון לקצה של כל מנה, מטפלת לא להפריע את שכבת התא, ואז קצת להטות את הצלחת.
    הערה: PBS או פתרון מלוחים מפריעה לניתוח metabolomic מבוסס CE-MS ומשפיע לרעה על תוצאות המדידה, ובכך לא צריך לשמש ככביסה מאגר.
  7. מטפי את מאגר הכביסה מכל צלחת התרבות, ולאחר מכן לשטוף את התאים שוב על ידי הוספת בעדינות 10 מ ל של מאגר לשטוף לכל מנה והטיית מעט את הצלחת.
  8. מטפי לגמרי את מאגר הכביסה. מהקצה של כל מנה תרבותית
    הערה: מרוב מאגר לשטוף ככל האפשר, תוך שימת לב לא למשוך את התאים. מננירול משיורי עלול להפריע לניתוח CE-MS; השאיפה של תאים תפחית את מספר התאים וכך תהפוך למקור של שגיאה בנורמליזציה של נתונים.

5. הפקת מטבוליטים מתאים מתורבתים

  1. הוסף 800 μL של 99.7% מתנול לכל מאכל תרבות. הסלע בעדינות כל צלחת התרבות הלוך ושוב כדי לכסות את כל המשטח. השאירו את הכלים בטמפרטורת. החדר במשך 30 ס מ
  2. לאט להוסיף 550 μL של הפתרון תקן פנימי מדולל לכל מנה על ידי המהול את קצה הפיפטה לתוך מתנול ובעדינות ללטף למעלה ולמטה מספר פעמים.
  3. הסלע בעדינות כל צלחת התרבות הלוך ושוב כדי לכסות את כל המשטח.
  4. השאירו את הכלים בטמפרטורת. החדר במשך 30 ס מ

6. אולטראפילטרציה של תמציות תאים

  1. העבר את הפתרון המחולצים מכל צלחת תרבות לצינור שפופרת מיקרו-1.5 mL נפרד.
  2. צנטריפוגה את הצינורות ב 2,300 × g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  3. העבר 350 μL של כל סופרנטאנט לשתי יחידות סינון צנטריפוגליים לכל מדגם.
    הערה: מכל מאכל תרבות, סך של 700 μL של הפתרון שחולץ מועבר לשני צינורות מסנן (350 μL/tube).
  4. צנטריפוגה את צינורות הפילטר ב-9,100 × g בשעה 4 ° צלזיוס עבור כ-2 מעלות עד שאין שרידי נוזלים בכוסות הפילטר.
  5. הסר את כוסות הפילטר וסגור בחוזקה את העפעפיים של צינורות הגבייה.

7. התאיידות לדוגמא

  1. הכינו מאייד צנטריפוגלי-בדרך כלל, זה מורכב מאייד, מלכודת קרה ומשאבת ואקום.
  2. הניחו את צינורות הגבייה. במאייד הצנטריפוגלי
    הערה: השאר את העפעפיים של הצינורות פתוחים.
  3. להתנדף את הפתרונות לדוגמה שחולצו בתנאי ואקום בטמפרטורת החדר.
    הערה: תצורות טיפוסיות עבור מספר סיבובים והלחץ הם 1,500 rpm ו 1,000 אבא, בהתאמה, וזה בדרך כלל לוקח כ 3 h כדי להתאדות לחלוטין את הדגימות.
  4. ודא כי לא נשאר נוזל בכל צינורות האוסף ולסגור את העפעפיים של הצינורות בחוזקה.
  5. אחסנו את צינורות הגבייה בטמפרטורה נמוכה במיוחד (ל80 ° c) עד לניתוח metabolomic.

8. אנליזה Metabolomic של לסה נ-MS

  1. השהה מחדש את פילטרט ב 50 μl של מים באולטרסאונד באופן מיידי לפני ניתוח CE-MS.
  2. בצע ניתוח CE-MS לפי שיטות שתוארו בעבר12,13 באמצעות מערכת אלקטרופורזה קפילר ומערכת זמן של טיסה ספקטרומטר מסה מצויד משאבת isocratic, ce-ms מתאם, ו-ce-ESI מרסס.
    הערה: ניתן לשלוט בשתי המערכות על ידי התוכנה של ספקי המערכת ומחוברים באמצעות סיליקה קפילר מותך (50 יקרומטר קוטר פנימי × 80 ס מ אורך כולל).
    1. כוונן מכשירים ומבחנות לדוגמה, הכן את הקפילר באמצעות קלטת קפילר, לחדש את נוזלי המעטפת ומאגרי האלקטרופורזה המתאימים, בהתאם למצב ניתוח של האניב או הקטיון ולאחר מכן החל מתח.
      הערה: מכשור ותנאים אנליטיים מתוארים בפרוטרוט במקומות אחרים12,13.
    2. פתח את התוכנה והכנת רשימת עבודה המכילה שיטות לרכישת נתונים ומידע לדוגמה.
    3. התחל בבדיקה ובדוק את הנתונים כגון עוצמת האות וצורת השיא של תקנים פנימיים ורזולוציית השיא של תרכובות סטנדרטיות אחרות.
    4. כוונן את התנאים האנליטיים במידת הצורך.
    5. הכנס את הפתרונות לדוגמה ב 50 mbar עבור 3 s ומתח של 30 kV.
      הערה: CE-MS התנהל גם במצב יון חיובי או שלילי. הגדר את הספקטרומטר כדי לסרוק את טווח המסה m/z 50-1000. מתח נימי הנימים הוגדר ב-4 kV; קצב הזרימה של גז חנקן (טמפרטורת חימום 300 ° c). במצב חיובי, המתח הפרגמנטור, מזרן ומתח ה75 של OCT הוגדרו ב-50 ו-125 V, בהתאמה. עבור מצב יון שלילי, מדריך הפרגמנטור, מזרן, והמתח של OCT RFV הוגדר ב 100, 50, ו 200 V, בהתאמה.
  3. . לנתח נתוני ספקטרום
    1. לחלץ את הפסגות מן הנתונים ספקטרלי מסה באמצעות תוכנה שילוב אוטומטי כדי להשיג מידע השיא כולל m/z, אזור השיא, ואת זמן ההגירה (MT).
      הערה: השיטה מתוארת בפירוט במקום אחר14.
    2. אל תכלול את פסגות האותות המתאימות לisotopomers, ליוני האוורור וליונים מוצרים אחרים של מטבוליטים ידועים.
    3. ביאור פסגות שנותרו עם מידע ממסד הנתונים HMT מטבוליט על פי ערכי m/z ו MTs.
    4. נרמל אזורים של הפסגות המוערת לרמות סטנדרטיות פנימיות ומספרי תאים לכל מדגם.
    5. הערכת הריכוז של כל מטבוליט בתאים מתורבתים (pmol/106 תאים) באמצעות עקומות סטנדרטיות מוכן לכל מטבוליט.
    6. השתמש בריכוזי מטבוליט הקוונט לניתוחים סטטיסטיים נוספים ופרשנויות ביולוגיות14.

Representative Results

מאז ריכוזי מטבוליט בתאי הסרטן (pmol/106 תאים) הם מנורמל למספר תאים קיימא, תנאים ניסיוניים צריך להיות מוגדר עם טיפול כדי למזער את הווריאציה במספר תאים קיימא בין התנאים. לדוגמה, הטיפול diamide היה בריכוז גבוה יחסית (250 μm) אבל לזמן קצר כדי לאפשר את כל התאים לגדול באותה מידה ככל האפשר, ובכך משווה את מספר תאים קיימא שנותחו. תחת תנאים ניסיוניים אלה, HCC827 ו-PC-9 תאים גדל באופן שווה עבור 3 h (איור 1). CE-MS ניתוח של תאים מטופלים diamide בהשוואה לתאים PBS (שליטה) חשף 175 ו 150 מטבוליטים דיפרנציאלי ב HCC827 ו-PC-9 תאים, בהתאמה. בין השאר, מספר מintermediates במסלול הפנטוז פוספט (PPP) ובגליקולזיס העליון היו גבוהים באופן משמעותי בתנאים שטופלו על-ידי diamide בשני קווי התא, ואילו בכמה מחזורי חומצה tricarboxylic הintermediates היו נמוכים יותר בטיפול מצבים (איור 2 ואיור 3).

ה-PPP יוצר הפחתת המקבילה בצורה של מופחתת באופן מופחת של אדניאוקליטישן פוספט (NADPH), המשמש לתחזוקת הומאוסטזיס מחדש ולחומצת שומן ביוסינתזה15. בעקבות טיפול diamide, רמת חומצה gluconic-גלוקוז תחמוצת-גדל 12-קיפול בתאים HCC827 ו 10-קיפול בתאים PC-9; באופן דומה, בעקבות הטיפול diamide, רמת הגלוקוז 6-פוספט (G6P)-גלוקוז זרחתי ואת המוצר הראשון ההקאוקיאז-מזרז גליקוליוזיס-גם גדל 6.3-ו 3.5-מקפלים ב HCC827 ו-PC-9 תאים, בהתאמה (איור 4). בנוסף, בעקבות הטיפול diamide, הרמות של 6-פוספיוגלוקונאט (6PG) — המתווך הראשון ב-PPP — מוגברת באופן דרמטי 89-קיפול בתאים HCC827 ו 231-קיפול בתאים PC-9 בהשוואה לרמות שנראו בבקרי PBS (איור 4). לעומת זאת, רמות של גליקוליטיק intermediates אחרות, כגון פרוקטוז 6-פוספט (F6P) ו פרוקטוז 1, 6-ביספופוספט (F1, 6P), לא שינוי במצב ניסיוני diamide (איור 4). סך הכול משמש כמעט שווה ערך בין הטיפול באמצעותdiamide לבין תנאי הבקרה PBS (איור 4), הרומז כי גלוקוז היה בעיקר ביטול באמצעות PPP.

Figure 1
איור 1. מספרי תאים ללא שינוי על טיפול diamide. התגובות צמיחת תאים ל 250 יקרומטר של diamide נמדדו באמצעות טרימין כחול כתמים. מספרי תאים של (A) HCC827 ו-(ב) PC-9 תאים שטופלו PBS (כחול) או diamide (אדום; 250 μm) עבור 1 או 3 h מוצגים. נתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. הנציגה MS פסגות של מטבוליטים. Electropherograms מסומן כ (א) חומצה גלוקונאית, (ב) גלוקוז 6-פוספט (G6P), (ג) 6-פוספופגלוconate (6Pg), ו-(ד) ניקטינויד אדנוטין פוספט (NADP+) המתקבל על ידי ניתוח CE-MS. כל שורה מציינת את קו התא (מלא, HCC827; מנוקד, PC-9) וטיפול (כחול, PBS; אדום, diamide) בשימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. פרופילים של מטבווליטים של החומר החשמלי התאיים. מקפלים שינויים של מטבוליטים ב (א) HCC827 ו (ב) PC-9 תאים שטופלו diamide מוצגים כיומן2(diamide/PBS). בסך הכל, 175 ו 150 מטבוליטים היו מוHCC827 בתאים PC-9, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. התקנה של PPP על טיפול diamide. ריכוזים תאיים (pmol/106 תאים) של מטבוליטים מפתח מעורב גליקוליזיס ומסלול פוספט פנטוז (PPP) לאחר הטיפול עם diamide מוצגים. מטבוליטים חולצו מ HCC827 ו-PC-9 תאים שטופלו PBS (כחול) או diamide (אדום, 250 μm) עבור 30 דקות. נציג מטבוליטים כגון חומצה gluconic, גלוקוז 6-פוספט (G6P), פרוקטוז 6-פוספט (F6P), 6 -פוספולגלוקונאט (6Pg), וניאוניאואיד אדנינויאמיד פוספט (nadp+) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה נגישה נרחב כדי להכין מטבוליטים מתאי סרטן מתורבת עבור ניתוח metabolomic מבוסס CE-MS. אחת הנקודות הקריטיות ביותר בפרוטוקול זה היא ההכנה הנכונה של תאים סרטניים, כי נמדד ריכוזי מטבוליזם לייט הם מנורמל למספר תאים קיימא. להערכת מדויק של מספר התא, יש להכין לפחות מנה אחת נוספת לתרבות לכל קבוצה ניסיונית כדי לספור את מספר התאים הקיימא במקביל עם החילוץ של מטבוליטים לניתוח metabolomic. בנוסף, יש לזרע את אותו מספר תאים בכל מנה עבור המשכפלת ובצלוחית לספירה; בעתיד, זה יהיה לסייע על ידי מהיר, ללא מלחיץ (למשל, טריפסין-ללא) פרוטוקול ספירת תאים המאפשר את הצלחת זהה לשמש הן לספור תאים קיימא ולחילוץ מטבוליטים. הטיפול צריך להילקח במהלך שוטף כך תאים לא להתנתק מהמשטח של הכלים. בדיקות ציטורעילות חמורה וניסויים אחרים הפחתת הדבקה בתאים עשויים להיות בלתי מתאימים לפרוטוקול החילוץ בשל אובדן פוטנציאלי של תאים במהלך הליך הכביסה.

חשוב להשתמש 5% ניטול פתרון כמו מאגר לשטוף לחילוץ מטבוליטים מתאים מתורבתים עבור ניתוח metabolomic מבוסס CE-MS, משום מאגרים מבוססי מלח, כגון PBS, להפריע ניתוח metabolomic ולהשפיע לרעה מדידה.

שניים או שלושה מאכלים יכולים להיות משולבים כמדגם אחד על ידי חילוץ בנפרד מטבוליטים מכל מנה ולאחר מכן לאגירת דגימות; עם זאת, שילוב מנות מרובות לעתים קרובות מגביר ניטול שיורית בפתרון מטבוליט שחולצו. הדבר עלול גם להפריע לניתוח metabolomic על-ידי CE-MS. לכן, מומלץ לא להשתמש בכלים או בבארות מרובים כמדגם אחד.

שיטת ניתוח metabolomic זו באמצעות CE-MS פותחה עבור מדידה מקיפה של מולקולות טעונה עם משקולות מולקולרית בין 50 ו 1000 Da; לפיכך, פרוטוקול זה ממוטב להפקת מימית, תרכובות במשקל מולקולרי נמוך. לכן, פרוטוקול זה אינו מתאים לחילוץ הידרופובי מטבוליטים כגון שומנים או קרו כגון חלבונים וחומצות גרעין. מאז יש דרישה גוברת לניתוח השומנים המקיף או lipidomics של דגימות תאים מתורבת, הפיתוח של פרוטוקול קל ואפקטיבי לחילוץ סימולטני של שני הידרופיפילית והידרופובי מטבוליטים נדרש.

הצעד הראשון של הפקת מטבוליזם-שוטף בינוני וכביסה תאים עם mannitol-יש לנהל מהר ככל האפשר כדי למזער את השינויים בפרופיל חילוף החומרים של התאים. טיפול בתאים עם מתנול לאחר כביסה עם ניטול הוא הניח החלבונים ובכך למנוע אנזימים לזרז תגובות מטבולית נוספת. עם זאת, גם לאחר הטיפול המתנול, תגובות כימיות לא-אנזימטיות-כגון תגובות נגד חמצון, כמה תהליכים דארבוקלציה, וקשרים מסוג תיול-עשויים להתרחש. ככזה, כל ריכוזים של מטבוליטים המעורבים בתגובות אלה נמדד על ידי פרוטוקול זה צריך להתפרש בזהירות. בניגוד לגנום או טראנסקריפט, המטאבאלי מורכב של מולקולות עם מגוון רחב של תכונות כימיות; מכאן, אף פרוטוקול יחיד יכול לחלץ את כל מטבוליטים ללא כל הפסד או הפרעה. למדידות מדויקות יותר של מטבוליטים מאוד תגובתי כגון, פרוטוקול שתוכנן במיוחד כדי לחלץ קבוצות מסוימות של מטבוליטים, אשר דורש הפסקות ובעלי ללעג, יש להתייעץ. הפרוטוקול המוצג כאן, עם זאת, מתאר הוצאה פשוטה ומהירה של מטבוליטים מימית מדגימות תאים מתורבת לניתוח metabolomic על ידי CE-MS. במאמר זה לא יכולנו לתאר כיצד להגדיר CE-MS בפירוט מכיוון שהמוקד של כתב היד הנוכחי הוא שונה, אולם, המתאר צעדים מפורטים להגדרת CE-MS עשוי לדרוש מאמר ייעודי נפרד.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לכל חברי המרכז לקידום התעשייה האזורית שונוב על עזרתם. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי קרנות מחקר מפריפקטורה של יאמאגאטה ו Tsuruoka העיר, על ידי קרן הלאומי למחקר ופיתוח של המרכז לסרטן [גרנט מספר 28-A-9], ועל ידי החברה היפן לקידום המדע (JSPS) KAKENHI [גרנט מספר 17K07189] ל-HM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated cell counter Thermo Scientific AMQAX1000 Countess II automated cell counter
Automatic integration software Agilent Technologies MassHunter G3335-60041 version B.02.00
CE system Agilent Technologies Agilent 7100 CE system
CE/MS adapter kit Agilent Technologies G1603A
CE-ESI-MS Sprayer kit Agilent Technologies G1607A
Cell counting chamber slide Thermo Scientific C10282 Countess cell counting chamber slides
Centrifugal filter device, 5 kDa Human Metabolome Technologies ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml Thermo Scientific N339651
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml Thermo Scientific N339653
Costar stripette, 10 ml Corning 4488
Costar stripette, 5 ml Corning 4487
D(-)-Mannitol Wako 133-00845 500 g
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
Electrophoresis buffer Human Metabolome Technologies H3301-1001 for cation analysis
Electrophoresis buffer Human Metabolome Technologies H3302-1021 for anion analysis
Fetal bovine serum Biowest S1780
Filter tip, 1000 μl Watson 124P-1000S
Filter tip, 20 μl Watson 124P-20S
Filter tip, 200 μl Watson 1252-703CS
Fused silica capillary Polymicro Technologies TSP050375 50 μm i.d. × 80 cm total length
HCC827 American Type Culture Collection CRL-2868
Internal standard solution Human Metabolome Technologies H3304-1002
Isocratic pump Agilent Technologies Agilent 1100 Series Isocratic Pump
Methanol Wako 138-14521 1 L, LC/MS grade
Microtube, 1.5 ml Watson 131-415C
Operating Software Agilent Technologies ChemStation G2201AA version B.03.01 for CE
PC-9 RIKEN Bio Resource Center RCB4455
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R8758-500ML
Sterile tissue culture dish, 100 mm Corning 430167
Time-of-flight mass spectrometer Agilent Technologies Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Scientific T10282
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-100ML
Ultrapure water Merck Milli-Q water 18.2 MΩ·cm pure water
Volumetric flask, 50 ml Iwaki 5640FK50E TE-32

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).
  2. Soga, T. Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming. Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).
  3. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and Cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
  4. Fukuda, H., et al. Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection. European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).
  5. Miles, K. A., Williams, R. E. Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism. Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).
  6. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  7. Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes. Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).
  8. Makinoshima, H., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).
  9. Makinoshima, H., et al. Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).
  10. Makinoshima, H., et al. Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma. Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).
  11. Sato, Y., et al. Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1129 (2018).
  12. Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).
  13. Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).
  14. Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
  15. Patra, K. C., Hay, N. The pentose phosphate pathway and cancer. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).

Tags

מחקר הסרטן סוגיה 148 מטאבולאום תאים סרטניים אלקטרופורזה קפיוריקה-המסה ספקטרומטריה (CE-MS) גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז (G6PD) מתח חמצוני diamide
הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maruyama, A., Kami, K., Sasaki, K.,… More

Maruyama, A., Kami, K., Sasaki, K., Sato, H., Sato, Y., Tsuchihara, K., Makinoshima, H. Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59551, doi:10.3791/59551 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter