Summary
Syftet med denna artikel är att beskriva ett protokoll för extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade anhängare celler för metabolomiska analys, särskilt kapillär elektrofores-masspektrometri.
Abstract
Metabolomic analys är en lovande Omics strategi för att inte bara förstå den specifika metaboliska regleringen i cancer celler jämfört med normala celler, men också för att identifiera bio markörer för tidigt stadium cancer upptäckt och förutsägelse av kemoterapi svar i patienter med cancer. Beredning av enhetliga prover för metabolomisk analys är en kritisk fråga som återstår att ta itu med. Här presenterar vi ett enkelt och tillförlitligt protokoll för extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade ansittande celler för metabolomiska analys med hjälp av kapillärelektrofores-masspektrometri (CE-MS). Vattenhaltiga metaboliter från odlade celler analyseras genom odling och tvättning av celler, behandling av celler med metanol, extrahering av metaboliter och avlägsnande av proteiner och makro molekyler med rotations kolonner för CE-MS-analys. Representativa resultat med hjälp av lung cancer cellinjer som behandlats med diamid, en oxidativ reagens, illustrerar tydligt observerbar metabolisk förskjutning av celler under oxidativ stress. Denna artikel skulle vara särskilt värdefullt för studenter och utredare som deltar i metabolomik forskning, som är nya för att skörda metaboliter från cellinjer för analys av CE-MS.
Introduction
Otto Warburg observerade att cancer celler förvärva ovanliga förmåga att ta upp glukos och jäsa det att producera laktat i närvaro av adekvat syre-ett fenomen som kallas Warburg effekt eller aeroba Glykolys1,2. Mitokondriell respirationsdefekter spekuleras som den underliggande grunden för aeroba Glykolys i cancer celler3. Faktum är att Warburg effekten är grunden för tumör avbildning av fluordeoxyglucose (FDG)-positron emission tomografi (PET), som ofta används i klinisk praxis4,5. En hög grad av aerob Glykolys anses vara ett viktigt inslag i cancer och har nyligen antagits som en av de välkända "kännetecken för cancer," som beskrivs av D. Hanahan och B. Weinberg6. Somatiska mutationer i onkogener och tumörsuppressorgener – såsom Hras/kras/nras, EGFR, BRAF, myc, TP53, isocitrat dehydrogenas (Idh) och fumarathydratas (FH )-har kopplats till specifika metaboliska förändringar i cancer celler, tros vara ett resultat av Warburg effekt7.
Metabolomic analys är en lovande metod inte bara för att förstå metabolisk reglering i cancer celler utan också för att identifiera tidigt stadium cancer bio markörer och kemoterapi svar förutsägelse. Efter behandling av känsliga eller resistenta cancer celler med cancer föreningar, spårning av deras metaboliska svar underlättar identifiering av metabola bio markörer för att förutsäga effekten av specifika cancer terapier hos patienter8 ,9,10,11. I denna artikel, cancer cellinjer härrör från en lung adenocarcinom med en EGFR -mutation som behandlats med diamid-som orsakar oxidativ stress-användes som modeller för metabolomiska analys. Fördelen med denna analys metod med kapillärelektrofores-masspektrometri (CE-MS) är dess omfattande mätning av laddade metaboliter med massa intervallet m/z 50-100012,13. Syftet med denna artikel är att ge nybörjare en detaljerad stegvist visuellt protokoll för beredning av vattenhaltiga metaboliter från odlade cancer celler och efterföljande metabolomiska analys, särskilt av CE-MS.
Protocol
1. cell kultur dag 1
Anmärkning: varje prov för metabolit extraktion bör beredas från en enda 100 mm vävnad kultur mat rätt som är måttligt men inte helt konfluenta (som innehåller cirka 2 – 5 miljoner celler). Beräkna antalet rätter som behövs för analysen och förbereda dem därefter.
- Culture HCC827 och PC-9-celler i 5% CO2 vid 37 ° c i RPMI-1640 medium kompletterat med 10% fetal bovint serum (FBS).
- Aspirera cell odlings mediet från 100 mm kultur rätter.
- Tvätta cellerna på varje skål med 2 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium. Skaka försiktigt varje skål så att PBS-lösningen helt täcker ytan på skålen.
- Aspirera tvättbuffert från kulturen rätter.
- Värm 0,25% trypsin-EDTA-lösning till 37 ° c och tillsätt 2 mL trypsin-EDTA-lösning med en 5 mL serologiska pipett. Försiktigt klippa varje skål så att trypsin helt täcker ytan av skålen.
- Inkubera kultur rätterna vid 37 ° c i ca 5 minuter.
- Tillsätt 4 mL förvärmda kompletta odlings substrat per fat. Omsuspendera cellerna i medium genom att försiktigt Pipettera flera gånger.
- Överför varje cell SUS pension till ett separat 15 mL koniskt rör och centrifugera vid 800 × g i 5 min.
- Omsuspendera varje cellpellet i 2 mL förvärmda kompletta odlings substrat.
- Bestäm det totala antalet och procentuell genomförbarhet av cellerna med hjälp av automatiserad cell räknare och 0,4% trypan blå lösning.
- Blanda 10 μL cell SUS pension och 10 μL 0,4% trypan blå lösning.
- Fyll på 10 μL av provet i cell räknings kammaren genom kapillärverkan.
- Skjut in kammar glaset i den automatiserade cell räknaren. Det genomlysnings ljuset tänds automatiskt och instrumentet autofokus fokuserar på cellen.
- Tryck på Capture -knappen för att fånga bilden och visa resultatet.
- Om det behövs, tillsätt ytterligare odlings substrat för att uppnå önskad cell koncentration.
- Seed ca 1 – 2,5 miljoner celler per 100 mm cell kultur rätt.
Anmärkning: Metabolitkoncentrationer som bestäms av CE-MS-analys kommer att normaliseras baserat på antalet livskraftiga celler. För cell räkning är det nödvändigt att förbereda minst en extra seedad kultur rätt för varje grupp. - Inkubera kulturen rätter i 5% CO2 vid 37 ° c för 18 h.
2. beredning av reagenser
- Späd en kommersiell intern standardlösning inklusive L-metioninsulfon och d-kamfer-10-sulfonsyra 1000-faldigt i ultrarent vatten.
Anmärkning: för färre än 80 prover, blanda helt enkelt 50 μL av den interna standardlösningen 1 och 45 mL ultrarent vatten i en 50 mL mätkolv, och ta sedan upp lösningen upp till 50 mL med ultrarent vatten. - Bered en 0,05 g/mL-mannitollösning i ultrarent vatten som tvättbuffert.
Anmärkning: för färre än 30 prover, lös bara 25 g mannitol i 500 mL ultrarent vatten. Cirka 15 mL tvättbuffert krävs per 100 mm odlings fat, så Förbered en tillräcklig mängd tvättbuffert enligt antalet prover.
3. förtvätt av centrifugalfilter
- Pipettera 250 μL ultrarent vatten i filter glaset för varje centrifugalfilter enhet (se material tabellen).
Anmärkning: två filter enheter per prov krävs. - Locket filter enheterna tätt och centrifugera vid 9 100 × g vid 4 ° c i 5 min.
- Kontrol lera volymen på varje filtrat – om betydande filtrat har ackumulerats under det första korta snurrandet kan filter enheten vara defekt. Kassera i så fall filter enheten och Använd en ny filter enhet i stället.
- Stäng filter enheternas lock ordentligt och centrifugera igen vid 9 100 × g vid 4 ° c i 30 min.
- Se till att inget ultrarent vatten finns kvar i någon av filter kopparna. ta bort det filtrerade ultrarent vattnet i varje samlings rör med en pipett och kassera.
Anmärkning: försök inte att ta bort kvarvarande vatten i en filterkopp med en pipett eftersom det kan skada filtret. - Byt ut filter kopparna i deras samlings rör.
Obs: Använd centrifugalfilterenheterna inom en timme eftersom filtren kan skadas vid torkning.
4. cell kultur dag 2
-
Ta ut 100 mm kultur rätter från inkubator.
Anmärkning: den rekommenderade cell kultur varaktigheten är 18 h. - Aspirera cell odlings mediet från varje 100 mm kultur rätt.
- Tillsätt 10 mL cell odlings substrat som innehåller lämpliga koncentrationer av föreningar eller droger till varje mat rätt, och var noga med att inte störa cell lagret.
Anmärkning: i demonstrations syfte lade vi till 10 μL 250 mM diamid upplöst i PBS (slut koncentration på 250 μM) i detta experiment. - Inkubera kultur rätterna vid 37 ° c i 30 minuter i närvaro av diamid eller PBS som kontroll.
- Aspirera cell odlings mediet från varje 100 mm kultur rätt.
- Tvätta cellerna genom att försiktigt lägga till 2 mL 5% mannitol lösning till kanten av varje mat rätt, noga med att inte störa cell lagret, sedan något luta skålen.
Obs: PBS eller saltlösning stör CE-MS-baserad metabolomiska analys och negativt påverkar mät resultaten, och därför bör inte användas som tvättbuffert. - Aspirera tvättbuffert från varje odlings fat, tvätta sedan cellerna igen genom att försiktigt lägga till 10 mL tvättbuffert per mat rätt och något luta skålen.
- Aspirera helt tvättbufferten från kanten på varje odlings fat.
Obs: aspirera så mycket tvättbuffert som möjligt, samtidigt som man uppmärksammar att inte aspirera cellerna. Kvarvarande mannitol kan störa CE-MS-analysen. aspiration av celler kommer att minska antalet celler och därmed bli en källa till fel i data normalisering.
5. extraktion av metaboliter från odlade celler
- Tillsätt 800 μL av 99,7% metanol per odlings fat. Försiktigt klippa varje kultur skålen fram och tillbaka för att täcka hela sin yta. Låt rätterna stå i rums temperatur i 30 s.
- Tillsätt långsamt 550 μL av den utspädda interna standardlösningen per mat rätt genom att doppa pipettens spets i metanol och Pipettera försiktigt upp och ner flera gånger.
- Försiktigt klippa varje kultur skålen fram och tillbaka för att täcka hela sin yta.
- Låt rätterna stå i rums temperatur i 30 s.
6. ultrafiltrering av cell extrakt
- Överför den extraherade lösningen från varje odlings fat till ett separat 1,5 mL mikrocentrifugerör.
- Centrifugera rören vid 2 300 × g vid 4 ° c i 5 min.
- Överför 350 μL av varje supernatanten till två centrifugalfilterenheter per prov.
Anm.: från varje odlings fat överförs totalt 700 μL av den extraherade lösningen till två filter rör (350 μL/rör). - Centrifugera filter rören vid 9 100 × g vid 4 ° c i cirka 2 timmar tills ingen vätska finns kvar i filter kopparna.
- Ta bort filter kopparna och tätt nära locken på samlings rören.
7. prov avdunstning
- Förbered en centrifugalevaporator-typiskt, detta består av en för ångare, en kall fälla, och en vakuum pump.
- Placera uppsamlings rören i centrifugalförångaren.
Obs: Låt locken på rören vara öppna. - Indunsta de extraherade prov lösningarna under vakuum förhållanden vid rums temperatur.
Obs: typiska konfigurationer för antalet rotationer och tryck är 1 500 rpm och 1 000 PA, respektive, och det tar vanligt vis cirka 3 h att helt avdunsta proverna. - Kontrol lera att ingen vätska finns kvar i något av samlings rören och Stäng locken på rören tätt.
- Förvara uppsamlings rören i en extremt låg temperatur (− 80 ° c) i djupfrysen tills metabolomiska analys.
8. metabolomic analys av CE-MS
- Omsuspendera filtratet i 50 μL ultrarent vatten omedelbart före CE-MS-analysen.
- Utför CE-MS-analys med metoder beskrivna tidigare12,13 med hjälp av kapillärelektrofores system och Mass spektrometersystem med tid för flygning utrustade med en Isokratisk pump, en CE-MS-adapter och en CE-ESI-MS-spruta.
Obs: båda systemen kan styras av program varan av systemet leverantörer och är anslutna med en smält kiseldioxid kapillär (50 μm inre diameter × 80 cm total längd).- Ställ in instrument och prov flaskor, Förbered kapillär med en kapillär kassett, fylla på skida vätskor och lämpliga elektrofores buffertar beroende på anjon eller katjonanalys läge, och sedan tillämpa spänningar.
Anmärkning: instrumentering och analytiska förhållanden beskrivs i detalj på andra ställen12,13. - Öppna program varan och Förbered en arbets lista som innehåller data insamlings metoder och exempel information.
- Starta en testkörning och kontrol lera data som signalintensitet och topp form av interna standarder och den högsta upplösningen av andra standard föreningar.
- Finjustera analys villkoren vid behov.
- Injicera prov lösningarna på 50 mbar för 3 s och en spänning på 30 kV.
Anmärkning: CE-MS utfördes antingen i positivt eller negativt Jon läge. Ställ in spektrometer för att skanna massa intervallet m/z 50 – 1000. Kapillärspänningen fastställdes till 4 kV. kväve gas flödet (värme temperatur 300 ° c). För positivt läge, var fragmenteraren, skimmer och OCT RFV spänning fastställdes till 75, 50 och 125 V, respektive. För negativt Jon läge, var fragmenteraren, skimmer och OCT RFV spänning satt till 100, 50, och 200 V, respektive.
- Ställ in instrument och prov flaskor, Förbered kapillär med en kapillär kassett, fylla på skida vätskor och lämpliga elektrofores buffertar beroende på anjon eller katjonanalys läge, och sedan tillämpa spänningar.
- Analysera spektrum data.
- Extrahera toppar från massan spektraldata med hjälp av automatisk integration program vara för att få topp information inklusive m/z, Peak Area och migration Time (MT).
Obs: metoden beskrivs i detalj någon annan stans14. - Exkludera signal toppar som motsvarar isopomers, addukt joner och andra produkt joner av kända metaboliter.
- Anteckna återstående toppar med information från HMT-metaboliten databasen enligt m/z -värden och MTs.
- Normalisera områden i de kommenterade topparna till interna standard nivåer och antal celler per sampling.
- Utvärdera koncentrationen av varje metabolit i de odlade cellerna (pmol/106 -celler) med hjälp av standard kurvor som förberetts för varje metabolit.
- Använd kvantifierade metabolitkoncentrationer för efterföljande statistiska analyser och biologiska tolkningar14.
- Extrahera toppar från massan spektraldata med hjälp av automatisk integration program vara för att få topp information inklusive m/z, Peak Area och migration Time (MT).
Representative Results
Eftersom metabolitkoncentrationer i cancer celler (pmol/106 -celler) normaliseras till antalet livskraftiga celler, bör experimentella tillstånd inrättas med försiktighet för att minimera variationen i antalet livskraftiga celler mellan förhållandena. Till exempel, diamid behandling var en relativt hög koncentration (250 μm) men för en kort tid att låta alla celler att växa så lika som möjligt, därmed utjämna antalet livskraftiga celler analyseras. Under dessa experimentella betingelser ökade HCC827-och PC-9-cellerna lika mycket för 3 timmar (figur 1). CE-MS-analys av diamid-behandlade celler jämfört med PBS-behandlade (kontroll) celler avslöjade 175 och 150 differential metaboliter i HCC827 respektive PC-9-celler. Bland dessa var flera intermediärer i pentofosfatvägen (PPP) och i övre Glykolys signifikant högre i de diamid-behandlade tillstånden i båda cellinjerna, medan några få trikarboxylsyror (TCA) cykel intermediärer var lägre i den behandlade förhållanden (figur 2 och figur 3).
PPP genererar Reduktions ekvivalenter i form av reducerat nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH), som används för Redox homeostas-underhåll och fett syra bio syntes15. Efter diamid behandling, nivån av glukonsyra-ett oxiderat glukos-ökade 12-faldigt i HCC827 celler och 10-faldigt i PC-9-celler; på samma sätt, efter diamid behandling, nivån av glukos 6-fosfat (G6P)-en fosforylerad glukos och den första hexokinase-katalyseras Glykolys produkt-också ökat 6,3-och 3,5-faldigt i HCC827 och PC-9 celler, respektive (figur 4). Dessutom, efter diamid behandling, nivåerna av 6-fosfoglukonat (6PG)-den första intermediären i PPP-ökade dramatiskt 89-faldigt i HCC827 celler och 231-faldigt i PC-9-celler jämfört med de nivåer som ses i PBS kontroller (figur 4). Däremot har nivåerna av andra glykolytiska intermediärer, såsom fruktos-6-fosfat (F6P) och fruktos-1,6-bisfosfonat (F1, 6P), inte ändrats i det experimentella tillståndet diamide (figur 4). Totalt nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADP+) nivåer var nästan likvärdiga mellan diamid behandling och PBS kontroll förhållanden (figur 4), vilket tyder på att glukos huvudsakligen KATABOLIZED via PPP.
I figur 1. Oförändrat cell nummer vid behandling med diamid. Cell tillväxt svar på 250 μm diamid mättes med trypan blå färgning. Cell numren för (a) HCC827 och (B) PC-9-celler som behandlats med PBS (blå) eller diamid (röd; 250 μm) för 1 eller 3 timmar visas. Data visas som medelvärdet ± SD (n = 6). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 2. Representativa MS-toppar av metaboliter. Elektropherogram kommenterade som (a) glukonsyra, (B) glukos-6-fosfat (G6P), (C) 6-fosfoglukonat (6pg) och (D) nikotinamid ADENIN-dinukleotidfosfat (NADP+) som erhållits genom CE-MS-analys. Varje rad anger cellinjen (fast, HCC827; prickig, PC-9) och behandling (blått, PBS; röd, diamid) som används. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 3. Metabolome-profiler av intracellulära metaboliter. Gånger förändringar av metaboliter i (a) HCC827 och (B) PC-9-celler som behandlats med diamid visas som log2(diamid/PBS). Totalt, 175 och 150 metaboliter kommenterades i HCC827 och PC-9-celler, respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 4. Uppreglering av PPP vid behandling med diamid. Intracellulära koncentrationer (pmol/106 celler) av viktiga metaboliter som är involverade i Glykolys och pentofosfatvägen (PPP) efter behandling med diamid visas. Metaboliter har extraherats från HCC827 och PC-9-celler som behandlats med PBS (blå) eller diamid (röd, 250 μm) i 30 min. representativa metaboliter såsom glukonsyra, glukos-6-fosfat (G6P), fruktos-6-fosfat (F6P), 6 -fosfoglukonat (6Pg) och nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADP+) visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här beskriver vi en allmänt tillgänglig metod för att förbereda metaboliter från odlade cancer celler för CE-MS-baserad metabolomiska analys. En av de mest kritiska punkterna i detta protokoll är korrekt beredning av cancer celler, eftersom uppmätta metaboliten koncentrationer normaliseras till antalet livskraftiga celler. För noggrann uppskattning av cell nummer, är det nödvändigt att förbereda minst en ytterligare odlings mat rätt per experimentell grupp för att räkna antalet livskraftiga celler parallellt med utvinning av metaboliter för metabolomiska analys. Dessutom bör samma antal celler vara seedade i varje mat rätt för replikaten och i skålen för räkning; i framtiden, detta skulle vara hjälpt av en snabb och stressor-fri (t. ex. trypsin-Free) cell räknings protokoll som gör att samma mat rätt som skall användas för både räkna livskraftiga celler och extrahera metaboliter. Försiktighet bör iakttas vid tvättar så att cellerna inte lossnar från ytan av rätterna. Allvarliga cytotoxicitetsundersökningar och andra experiment som minskar celladhesion kan vara olämpliga för detta extraktionsprotokoll på grund av potentiell förlust av celler under tvätt proceduren.
Det är viktigt att använda en 5% mannitol lösning som tvättbuffert för extraktion av metaboliter från odlade celler för CE-MS-baserad metabolomiska analys, eftersom saltbaserade buffertar, såsom PBS, interfererar med metabolomiska analys och negativt påverka mätningen.
Två eller tre rätter kan kombineras som ett enda prov genom att individuellt extrahera metaboliter från varje mat rätt och sedan poolning prover; men att kombinera flera rätter ökar ofta resterande mannitol i den extraherade metaboliten lösning. Detta kan också störa metabolomiska analys av CE-MS. Därför rekommenderas att inte använda flera rätter eller brunnar som ett enda prov.
Denna metabolomiska analys metod med CE-MS har utvecklats för heltäckande mätning av laddade molekyler med molekyl vikter mellan 50 och 1000 da; Därför är detta protokoll optimerad för utvinning av vattenhaltiga, låg molekyl ära vikt föreningar. Därför är detta protokoll inte lämpligt för extraktion av hydrofoba metaboliter såsom lipider eller makro molekyler såsom proteiner och nukleinsyror. Eftersom det finns en ökande efter frågan på omfattande lipidanalyser eller lipidomik av odlade cellprover, behövs utveckling av ett enkelt och effektivt protokoll för samtidig utvinning av både hydrofila och hydrofoba metaboliter.
Det första steget av metabolismextraktion – aspirera medel-och tvätt celler med mannitol – bör genomföras så snabbt som möjligt för att minimera förändringar av cellernas metaboliska profil. Behandling av celler med metanol efter tvättning med mannitol antas denaturera proteiner och därmed förhindra enzymer från att katalysera ytterligare metaboliska reaktioner. Men även efter metanol behandling, icke-enzymatiska kemiska reaktioner-såsom Redox reaktioner, vissa dekarboxylering processer, och tiol kopplingar-kan äga rum. Därför bör alla koncentrationer av metaboliter som är involverade i dessa reaktioner mätta med detta protokoll tolkas med försiktighet. I motsats till arvs massan eller transkriptomen består metabolomet av molekyler med en mängd olika kemiska egenskaper; Därför kan inget enda protokoll extrahera alla metaboliter utan förlust eller störning. För mer exakta mätningar av sådana mycket reaktiva metaboliter, ett protokoll som utformats särskilt för att extrahera vissa grupper av metaboliter, som kräver fraktionering och derivatizations, bör konsulteras. Det protokoll som presenteras här beskriver dock en enkel och snabb extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade cellprover för metabolomiska analys av CE-MS. I detta dokument kunde vi inte beskriva hur man ställer in CE-MS i detalj eftersom fokus för det nuvarande Manuskriptet är annorlunda, men att beskriva detaljerade steg för att inrätta CE-MS kan kräva en separat dedikerad artikel.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i Shonai regional Industry Promotion Center för deras hjälp. Detta arbete stöddes delvis av forsknings medel från Yamagata prefektur och Tsuruoka City, av National Cancer Center forsknings-och utvecklings fonden [Grant nummer 28-A-9], och av det japanska sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHI [bidrags nummer 17K07189] till HM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
| Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
| CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
| CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
| CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
| Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
| Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
| Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
| Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
| Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
| Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
| D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
| Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
| Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
| Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
| Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
| HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
| Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
| Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
| Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
| Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
| Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
| PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
| Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ·cm pure water |
| Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |
References
- Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).
- Soga, T. Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming. Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and Cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Fukuda, H., et al. Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection. European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).
- Miles, K. A., Williams, R. E. Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism. Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes. Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).
- Makinoshima, H., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).
- Makinoshima, H., et al. Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma. The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).
- Makinoshima, H., et al. Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma. Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).
- Sato, Y., et al. Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1129 (2018).
- Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).
- Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Patra, K. C., Hay, N. The pentose phosphate pathway and cancer. Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).
