Summary
في هذه الدراسة، نقوم بتعديل الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون مع جسيمات نانوية ذهبية لتعزيز حساسية الكشف العصبي.
Abstract
لأكثر من 30 عاما، كانت الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون (CFMEs) المعيار للكشف عن الناقل العصبي. عموما، يتم استنشاق ألياف الكربون في الشعيرات الدموية الزجاجية، وسحبت إلى تفتق غرامة، ومن ثم مختومة باستخدام الايبوكسي لخلق مواد القطب الكهربائي التي تستخدم لاختبار قياس فولتامتري دوري سريع. استخدام CFMEs العارية له عدة قيود، على الرغم من. أولا وقبل كل شيء، ألياف الكربون يحتوي في الغالب الكربون القاعدية الطائرة، التي لديها مساحة سطح منخفضة نسبيا وتسفر عن حساسية أقل من المواد النانوية الأخرى. وعلاوة على ذلك، فإن الكربون الجرافيتي محدود بقراره الزمني، والموصلية المنخفضة نسبياً. وأخيراً، من المعروف أن المواد الكيميائية العصبية والجزيئات الكبيرة قد فول على سطح أقطاب الكربون حيث أنها تشكل البوليمرات غير الموصلة التي تمنع المزيد من امتصاص العصبي. لهذه الدراسة، ونحن تعديل CFMEs مع الجسيمات النانوية الذهب لتعزيز الاختبارات الكيميائية العصبية مع قياس فولتامتري دوري المسح السريع. تم إيداع Au3+ كهربائياً أو مطلياً من محلول غروي على سطح CFMEs. وبما أن الذهب معدن مستقر وخامل نسبياً، فهو مادة قطبية مثالية للقياسات التحليلية للمواد الكيميائية العصبية. الذهب الجسيمات النانوية المعدلة (AuNP-CFMEs) كان الاستقرار لاستجابة الدوبامين لأكثر من 4 ح. وعلاوة على ذلك، تظهر AuNP-CFMEs حساسية متزايدة (ارتفاع ذروة التأكسد الحالي من تصوير الفولتاجرام الدوري) وأسرع حركية نقل الإلكترون (أقل ΔEP أو فصل الذروة) من CFMEs عارية غير معدلة. تطوير AuNP-CFMEs يوفر إنشاء أجهزة استشعار الكهروكيميائية جديدة للكشف عن التغيرات السريعة في تركيز الدوبامين والمواد الكيميائية العصبية الأخرى في حدود أقل للكشف. هذا العمل له تطبيقات واسعة لتعزيز القياسات الكيميائية العصبية. سيكون توليد الجسيمات النانوية الذهبية المعدلة CFMEs ذات أهمية حيوية لتطوير أجهزة استشعار أقطاب جديدة للكشف عن الناقلات العصبية في الجسم الحي في القوارض ونماذج أخرى لدراسة الآثار الكيميائية العصبية لتعاطي المخدرات، والاكتئاب، والسكتة الدماغية، ونقص التروية، وغيرها من الدول السلوكية والمرض.
Introduction
يتم استخدام الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون (CFMEs)1 على أفضل وجه كأجهزة استشعار حيوية للكشف عن أكسدة العديد من الناقلات العصبية الحاسمة2, بما في ذلك الدوبامين3, إفراز4, السيروتونين5, أدينوزين6, الهستامين7، وغيرها8. التوافق البيولوجي وحجم ألياف الكربون جعلها الأمثل لزرع كما أن هناك تخفيف تلف الأنسجة بالمقارنة مع الأقطاب القياسية أكبر. 9 ومن المعروف أن CFMEs تمتلك خصائص الكهروكيميائية المفيدة وقادرة على إجراء قياسات سريعة عند استخدامها مع التقنيات الكهروكيميائية السريعة، والأكثر شيوعا سريع المسح الضوئي قياس فولتاممتري دوري (FSCV)10،11. FSCV هو الأسلوب الذي يمسح الإمكانات المطبقة بسرعة ويوفر صورة فولتوغرام دوري محددة لanalytes محددة12،13. تيار الشحن الكبير الذي ينتجه المسح السريع مستقر على ألياف الكربون ويمكن طرح الخلفية لإنتاج صور فولتوغرام دورية محددة.
نظراً لالكيمياء الكهربائية المثلى والأهمية العصبية البيولوجية, وقد درست الدوبامين على نطاق واسع. الدوبامين الكاتيكولامين هو رسول الكيميائية الأساسية التي تلعب دورا محوريا في السيطرة على الحركة, الذاكرة, الإدراك, والعاطفة داخل الجهاز العصبي. فائض أو نقص الدوبامين يمكن أن يسبب العديد من التدخل العصبي والنفسي; ومن بين هذه هي مرض باركنسون، والفصام، والسلوك الادمان. اليوم, مرض باركنسون لا يزال اضطراب امنى بسبب انحطاط الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط المشاركة في تخليق الدوبامين14. وتشمل أعراض مرض باركنسون الهزة، وبطء الحركة، وتصلب، ومشاكل في الحفاظ على التوازن. من ناحية أخرى, المنشطات مثل الكوكايين15 والأمفيتامين16,17 تعزيز تجاوز الدوبامين. تعاطي المخدرات يحل في نهاية المطاف محل التدفق المنتظم للدوبامين وظروف الدماغ تتطلب فائضا من الدوبامين, مما يؤدي في نهاية المطاف إلى سلوكيات الادمان.
في السنوات الأخيرة، كان هناك تركيز على تحسين وظائف القطب الكهربائي في الكشف عن الناقل العصبي18. الطريقة الأكثر انتشارا لتعزيز حساسية القطب الكهربائي هو عن طريق طلاء سطح الألياف. ومن المستغرب، كان هناك بحوث محدودة أجريت على الجسيمات النانوية المعدنية الكهربائي على ألياف الكربون19. الجسيمات المعدنية النانوية النبيلة مثل الذهب، قد تكون مودعت كهربائيا على سطح الألياف مع مواد وظيفية أخرى20. على سبيل المثال، زيادة المساحة السطحية الكهروتيفة للإمتزاز العصبي تحدث. الجسيمات النانوية المعدنية المعبأة بالكهرباء تشكل بسرعة، ويمكن تنقيتها، والتمسك ألياف الكربون. ولا تزال الكيمياء الكهربائية هامة لكل من ترسب الجسيمات النانوية المعدنية النبيلة وتعزيز سطح ألياف الكربون، لأنها تسمح بالتحكم في النويات ونمو هذه الجسيمات النانوية. وأخيراً، فإن زيادة الخصائص الحفازة والموصلية، وتحسين النقل الجماعي هما من بين مزايا أخرى لاستخدام الجسيمات النانوية المعدنية في التحليل الكهربائي.
دورة التسلسل مختبر متقدم من الجامعة الأمريكية (الكيمياء البيولوجية التجريبية الأولى والثانية CHEM 471/671-472/672) هو مزيج من مختبرات التحليل والفيزيائي والكيمياء الحيوية. الفصل الدراسي الأول هو لمحة عامة عن تقنيات المختبر. الفصل الدراسي الثاني هو مشروع بحثي يقوده الطلاب ويقوده21. لهذه المشاريع، وقد فحص الطلاب سابقا آلية الجزيء الحيوي، والبروتين، والببتيد، والأحماض الأمينية التي يسهلها توليف الجسيمات النانوية الذهب22،23. وقد ركزت الأعمال الأحدث على تشكيل إنتاج الجسيمات النانوية الذهبية (AuNP) على أسطح الأقطاب الكهربائية وتقييم آثار الملوثات المعالجة الهـذاية على قدرة الـ CFMEs على الكشف عن الناقلات العصبية. في العمل الحالي، وقد طبق المختبر هذه التقنية لإثبات أن حساسية CFMEs في الكشف عن الدوبامين الأكسدة يتم تعزيزها من خلال وضع القطب من AuNP على سطح الألياف. ويتميز كل عارية-CFME من قبل متفاوتة معدل المسح الضوئي, الاستقرار وتركيز الدوبامين عند الكشف عن التيارات الدوبامين أكسدة لقياس أكسدة الدوبامين على سطح CFME. [أو]3+ كان بعد ذلك [إلكتروبلند] إلى [أو]0 و [إلكترود] [أنس تو] [إلكترود] [أنفيز] على الألياف سطح كجسيمات نانوية, يتبع ب [سري] من توصيف تجارب. بعد مقارنة مباشرة, تم العثور على AuNP-CFMEs لامتلاك حساسية أعلى من الكشف عن الدوبامين. طلاء موحد من AuNP على سطح الألياف عن طريق الكهربائي يجعل أعلى منطقة السطح الكهروتيف. وبالتالي, زيادة الامتزاز الدوبامين على سطح القطب المعدلة. أدى هذا إلى ارتفاع التيارات التأكسدية الدوبامين. الفصل المحتمل لأكسدة الدوبامين والحدمن قمم (E ع) من AuNP-CFMEs كان أيضا أصغر, مما يشير إلى أسرع حركة نقل الإلكترون. وتشمل الأعمال المستقبلية لهذه الدراسة اختبار في الجسم الحي على حد سواء العارية وAuNP-CFMEs للكشف عن الدوبامين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- بناء أقطاب كهربائية من ألياف الكربون
-
إعداد ألياف الكربون
- لإنشاء الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون، قم أولاً بفصل ألياف الكربون (ألياف الكربون، قطرها 7 مم) واحداً تلو الآخر باستخدام اليدين والقفازات وملعقة.
- سحب أو سحب ألياف واحدة من الغزل الملتوية.
- استنشق ألياف كربون معزولة في الشعرية الزجاجية (واحد برميل البورسليكات الزجاج الشعري دون خيوط دقيقة، 1.2 مم القطر الخارجي، 0.68 مم القطر الداخلي).
- إنشاء حامل قطب للأقطاب الكهربائية عن طريق قطع قطعة من الورق المقوى الذي هو ما يقرب من 10 سم في الطول بنسبة 25 سم في العرض.
- سحب الأقطاب الكهربائية باستخدام سحب الشعرية العمودية.
- افتح الباب المنزلق للسحب الشعري العمودي.
- تخفيف وإزالة قضيب حامل معدني، عن طريق تدوير الحفر تشاك عكس اتجاه عقارب الساعة مع مساحة كافية لإدراج الشعرية الزجاج.
- أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية في حامل القطب الكهربائي. رفع الشعرية الزجاجية إلى الجزء العلوي من الشعرية العمودية يدويا باليد.
- تشديد الشعرية الزجاجية مع الحفر تشاكس في اتجاه عقارب الساعة دون كسر أو تحطيم الشعيرات الدموية الزجاج.
- ضبط سخان 1، سخان 2، وإعدادات المغناطيس إلى الشركة المصنعة اقترح مستويات لسحب الشعيرات الدموية الزجاج إلى تفتق غرامة لمواد القطب الكهربائي.
- اضغط على زر البدء الأحمر لتسخين لفائف ملفوف لسحب الأقطاب الكهربائية عن طريق الضغط والجاذبية والتدفئة.
- اسمحوا لفائف ملفوف بارد من حالته الساخنة الحمراء. قطع ألياف الكربون مع مقص يربط بين اثنين من الأقطاب الكهربائية سحبت من أعلى إلى أسفل. استخدم طريقة الحفر تشاك لإزالة الشعرية الزجاجية من الساحبة الشعرية العمودية عن طريق الالتواء في الاتجاه المعاكس لاتجاه عقارب الساعة.
2. الكربون الألياف الميكروكب الكهربائي إعداد
- تحت منظار مجسم أو مجهر، قطع ألياف الكربون جاحظ من سطح الشعرية الزجاجية مع مقص الجراحية أو شفرة الحلاقة حادة إلى ما يقرب من 100-150 ميكرومتر في الطول.
- إعداد حل الايبوكسي عن طريق خلط 10 غرام من الايبوكسي مع 0.2 مل من تصلب في قارورة 25 مل باستخدام مسحة القطن.
- تراجع فقط غيض من كل قطب في حل الايبوكسي وتصلب لمدة 15 ق تقريبا.
- تراجع الجزء العلوي المذكور أعلاه من ميكروبولوت ألياف الكربون في الأسيتون لمدة 3 ق تقريبا لغسل أي الايبوكسي الزائد من برميل من ميكروبولوت ألياف الكربون.
3. وضع القطب
- ضع القطب العامل (ميكروبولتر ألياف الكربون) في حل HAuCl 0.5 m M4 بالإضافة إلى القطب المرجعي، كلوريد الفضة الفضية (Ag/AgCl) باستخدام المتلاعب المجهري.
- قم بتوصيل قطب العمل والقطب المرجعي بالجهد والرأس.
- افتح برنامج HDCV UNC. تغيير الإعدادات على البرنامج لتطبيق الموجي. أدخل الموجي التالي في إعدادات الكمبيوتر: المسح الضوئي من 0.2 V إلى −1.0 V في حل KCl 0.1 M الذي يحتوي على 0.5 mM HAuCl4 بمعدل مسح قدره 50 مل/ثانية لمدة 10 دورات. اضغط على السهم الأخضر لتطبيق الموجي. ثم اضغط على زر البدء لبدء تسجيل القياسات.
4. المسح المجهري الإلكترون
ملاحظة: صورة عارية والذهب نانوجسيم تعديل الأقطاب الدقيقة ألياف الكربون باستخدام المسح الضوئي أداة المجهر الإلكتروني (SEM). قم بتحميل العينة على شريط موصل أسود واتباع إرشادات وصف الشركة المصنعة.
-
تشغيل الأداة
- قم بتشغيل المفتاح إلى ابدأ وحرر.
- افتح برنامج InTouchScope بالنقر المزدوج فوقه.
- حرر المفتاح يجب أن تهبط على الرمز الأول بمفردها
- انتظر حتى يتوقف زر EVAC عن الوميض.
- بمجرد توقف زر EVAC عن الوميض، اضغط على زر VENT.
- انتظر حتى يتوقف زر VENT عن الوميض.
- تأكد من أن مسافة العمل (WD) هي في 20 مم - 30 مم.
- أثناء الانتظار، قم بإعداد العينة (العينات).
-
المسح الضوئي
- بمجرد توقف زر VENT عن الوميض، قم بتحميل العينة (العينات) في الأداة.
- تأكد من توجيه الجزء المنحني من حامل العينة نحو الأداة عند تحميل العينة (العينات).
- اضغط على الزر EVAC بمجرد تحميل العينة (العينات).
- ضبط مسافة العمل إلى 10 ملم.
- بمجرد توقف زر EVAC عن الوميض، قم بتشغيل الكمبيوتر.
- انقر على برنامج In Touch Scope الموجود على سطح المكتب. هناك نوعان في نطاق اللمس البرمجيات، انقر على واحد دون دائرة خضراء وصفراء.
- بمجرد فتح البرنامج، انقر على مراقبة (أعلى يمين الشاشة)، لتشغيل شعاع. تأكد من توقف زر EVAC عن الوميض قبل النقر على المراقبة.
- بدء تحليل العينة (العينات).
- تأكد من أن إعدادات الجهد ومسافة العمل (WD) والمسبار الحالي (PC) مقبولة.
- قم بالتصغير (~50X) للحصول على إعداد أعلى والتكبير للحصول على إعداد أقل.
- تعيين مسافة العمل في 10 ملم.
- قبل التقاط صورة للعينة (العينات)، تأكد من حفظ الصورة إلى مجلد الوجهة المطلوب.
- لاختيار المجلد المطلوب، انقر على الإعدادات (أعلى يسار الشاشة).
- تصدير الصور من الكمبيوتر عبر محرك أقراص محمول.
-
ايقاف تشغيل
- انقر على مراقبة لإيقاف شعاع.
- اضغط على زر VENT وانتظر حتى يتوقف عن الوميض.
- أثناء انتظار زر VENT للتوقف عن الوميض، اضبط مسافة العمل مرة أخرى إلى 20 مم - 30 مم.
- بمجرد توقف زر VENT عن الوميض، قم بإلغاء تحميل العينة (العينات) من الأداة.
- اضغط على زر EVAC، وانتظر حتى يتوقف عن الوميض.
- بمجرد توقف زر EVAC عن الوميض، أخرج من البرنامج وأغلق الكمبيوتر.
- قم بتشغيل المفتاح إلى رمز O لإيقاف تشغيل الأداة تمامًا.
5. اختبار قياس فولتامتري دوري سريع المسح الضوئي
- قم بتوصيل الميكروبوتيكب من ألياف الكربون بالجهد ومرحلة الرأس مع القطب المرجعي Ag/AgCl.
- باستخدام micromanipulator، خفض ميكروبولتر ألياف الكربون في خلية التدفق بشكل جيد عن طريق ضبط يدويا المقابض قياس X، Y، وZ.
- إعداد حل العازلة في المياه DI (131.5 m NaCl، 3.25 مليون مترمن كل شيء، 1.2 مليون متر CaCl 2، 1.25 mM NaH2PO4،1.2 m MgCl 2، و 2.0 m M Na2SO4 مع تعديل درجة الحموضة إلى 7.4).
- املأ خلية التدفق بالمخزن المؤقت للملح المخزن بالفوسفات (PBS) (pH = 7.4).
- باستخدام حقنة عازلة مملوءة بسعة 60 مل، قم بحقن المخزن المؤقت PBS في خلية التدفق بحوالي 1 مل/دقيقة.
- ضع القطب الكهربائي في خلية التدفق وطبق الموجي عن طريق الضغط على الزر الأخضر. مراقبة الذبذبات وإما قطع القطب الكهربائي أو ضبط الربح لمنع التحميل الزائد. السماح لما يقرب من 10 دقيقة من التوازن بين كل تشغيل القطب الكهربائي.
- تعيين الموجي الافتراضي إلى الموجي الدوبامين. المسح الضوئي من - 0.4 V إلى 1.3 V في 10 هرتز و 400 فولت / ث.
- إعداد حل الأسهم من الدوبامين 10 mM, السيروتونين, إفراز, وغيرها في حمض البيركلوريك. تخفيف المواد الكيميائية العصبية إلى التركيز النهائي من 1 μM في العازلة عن طريق الأنابيب 1 μM من محلول مخزون الدوبامين في 10 مل من PBS العازلة باستخدام ماصة.
- لبدء القياسات، اضغط على زر السجل. بعد 10 ثانية, حقن 0.2 مل من الدوبامين 1 μM في خلية التدفق أو أي تركيز آخر من الناقل العصبي. ضبط التركيز، ومعدل المسح الضوئي، الموجي (عقد المحتملة أو التبديل المحتملة) وفقا لذلك. تعيين إجمالي وقت التشغيل لـ 30 s.
- تحليل تشغيل باستخدام برنامج تحليل HDCV. تغيير المعلمات حسب الضرورة.
- بعد الانتهاء من التجربة، وتنظيف خلية التدفق عن طريق حقن 3 مل من الماء ومن ثم الهواء في الموانئ العازلة وحقن من خلية التدفق ثلاث مرات لكل منهما.
- إيقاف الموجي والصك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بالنسبة للرقم 1، نعرض مخططًا حيث يتم استخدام اختبار FSCV لقياس تركيز الناقلات العصبية في المختبر. يعرض الشكل 1 الموجي الدوبامين المطبقة. والمسح الموجي المثلث من -0.4 V إلى 1.3 V في 400 V / ثانية. في الجزء الثاني من الشكل إلى اليسار, فإنه يعرض أكسدة الدوبامين إلى الدوبامين-ortho-quinone (DOQ), عملية نقل الإلكترون اثنين يحدث من سطح analyte إلى سطح القطب الكهربائي. وأخيراً، يتم وضع مؤامرة الحالية مقابل الوقت مع مؤامرة اللون. المؤامرة الحالية مقابل الوقت هو تمثيل أكسدة الدوبامين. أنها مسطحة عندما لا يكون هناك أكسدة الدوبامين, ويرتفع عموديا عندما يتم أكسدة الدوبامين إلى الدوبامين-orthoquinone وخفضت مرة أخرى إلى الدوبامين كما الامتزاز analyte, وبعد ذلك, desorbs من سطح القطب الكهربائي. مؤامرة اللون هو مؤامرة ثلاثية الأبعاد من التيار. التيار الأصفر هو التيار الخلفية (على مقربة من الصفر), في حين أن المؤامرة الخضراء هي الأكسدة الإيجابية الحالية (أكسدة الدوبامين إلى الدوبامين orthoquinone), والمؤامرة الزرقاء هو الحد السلبي الحالي (الدوبامين أورثوكينون الحد إلى الدوبامين).
تم استخدام SEM لملامح سطح الصورة من أقطاب الكربون العارية والمعدلة. في الشكل2، نرى فرقا فريدا في الميزات السطحية بين ثلاثة أنواع مختلفة من المواد الكهربائي. في الشكل 2a، يظهر ميكروبومتر من ألياف الكربون العارية. يبلغ قطر الألياف حوالي 7 ميكرومتر مع ارتفاعات أسطوانية على طول السطح الخارجي. ويبين الشكل 2ب الجسيمات النانوية الذهبية المنسّعة بالكهرباء على سطح ألياف الكربون لمدة 20 دقيقة تقريباً مع حافة حادة كبيرة من الذهب تبرز من سطح ألياف الكربون. كما تم التحقق من وجود الذهب مع قياسات EDS/EDX. ثم خفضنا الوقت الكهربائي إلى 5 دقائق حيث لاحظنا الذهب طلاء موحدة رقيقة كما هو مبين في الشكل 2c.
مقارنة الحساسية ونقل الإلكترون
ويبين الشكل 3أ مقارنة بين الحساسية ونقل الإلكترون. كما هو مبين مع التصوير الفولتي دوري متداخلة، والأقطاب الدقيقة ألياف الكربون المعدلة بالذهب لديها تيارات أعلىبكثير الأكسدة الذروة (الشكل3ب)وأسرع حركية نقل الإلكترون (Δ EP). تم قياس الأهمية مع اختبار t غير المقترن (P = 0.004 و .0016 على التوالي). أشرطة الخطأ هي خطأ قياسي للمتوسط.
الاستقرار
العارية(الشكل 4a)والجسيمات النانوية الذهبية المعدلة (الشكل4ب)تم وضع CFMEs في خلية التدفق لمدة 4 ح. وقد اتخذت قياسات للكشف عن الدوبامين 1 μM كل ساعة على مدى 4 ساعة. وكان كلا القطبين استجابة مستقرة فيما يتعلق الدوبامين. استجابة مستقرة لادوبامين (دون أكسدة المياه) أمر بالغ الأهمية لإجراء القياسات في الأنسجة البيولوجية. أشرطة الخطأ هي خطأ قياسي للمتوسط.
معدل المسح الضوئي
وتراوح معدل المسح الضوئي بين 100 فولت/ث إلى 000 1 فولت/ث. وأظهرت كل من العارية (الشكل5أ)والجسيمات النانوية الذهبية (الشكل5ب)الأقطاب المعدلة استجابة خطية فيما يتعلق بالكشف عن الدوبامين، وبالتالي، مما يشير إلى التحكم في الامتزاز على سطح الجسيمات النانوية العارية والذهب المعدلة الأقطاب الدقيقة. أشرطة الخطأ هي خطأ قياسي للمتوسط.
تركيز
وتراوح التركيز بين 100 نانومتر إلى 100 ميكرومتر الدوبامين للعارية (الشكل6أ)والجسيمات النانوية الذهبية المعدلة (الشكل6ب)الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون. وكان النطاق الخطي من 100 nM إلى 10 درجة مئوية. بعد 10 ميكرومتر، نلاحظ منحنى asymptotic تدل على أن الدوبامين هو supersaturated على سطح ميكروبولت ألياف الكربون. الاستجابة الخطية لذروة الأكسدة الحالية من الدوبامين فيما يتعلق تركيز الدوبامين يدل على التحكم الامتزاز إلى سطح القطب الكهربائي. تركيزات الدوبامين ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الدماغ هي ضمن هذا النطاق وتختلف بين مناطق الدماغ.
الشكل 1 مخطط لأكسدة الدوبامين. تراكب من ألياف الكربون الكسيد المؤكسد المؤكسد. يظهر نقل تهمة من السطح كما يتم أكسدة الدوبامين إلى الدوبامين-orthoquinone والعودة إلى الدوبامين كما يتم تطبيق الموجي الدوبامين المثلث (-0.4 V إلى 1.3 V في 400 V / ثانية). وتظهر المؤامرات الحالية مقابل الوقت واللون تدل على أكسدة الدوبامين (الأخضر) والحد من الدوبامين (الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 صور SEM من (أ) الأقطاب الدقيقة العارية من ألياف الكربون، (ب) الجسيمات النانوية الذهبية المعدلة أقطاب ألياف الكربون الدقيقة مع وقت ترسب القطب 20 دقيقة، و (ج) الأقطاب الدقيقة المعدلة للجسيمات الذهبية مع وقت ترسب القطب 5 دقائق. وهذا يوفر دليلا على النتائج المبدئية التي يمكن التحكم في حجم وسمك الطلاء الجسيمات النانوية الذهب من قبل الوقت الكهربائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 مقارنة الحساسية من الأقطاب العارية والجسيمات النانوية الذهبيةالمعدلة . (أ) تراكب من الفولتوغرامات الدورية من الأقطاب الدقيقة العارية والذهبية النانوجسيم المعدلة. (B). شريط الرسم البياني تدل على الاختلافات في ذروة التيار التأكسدي من الأقطاب الدقيقة العارية وجزيئات الذهب تعديل. (C). شريط الرسم البياني تبين الفرق في ΔEP بين العارية والذهب الجسيمات النانوية تعديل الأقطاب الدقيقة. أشرطة الخطأ هي خطأ قياسي للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 تجربة الاستقرار. (أ) تم وضع الأقطاب الدقيقة العارية و(B) المعدلة بالجسيمات النانوية الذهبية في خلية تدفق لما مجموعه 4 ساعة على الأقل. تم قياس حساسيتها نحو الدوبامين 1 μM أكثر من 4 ح. وكان على حد سواء استجابة موحدة لادوبامين أكثر من 4 ح. أشرطة الخطأ هي خطأ قياسي من المتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 تجربة معدل المسح الضوئي. (أ) تموضع الأقطاب الدقيقة المعدلة للجسيمات النانوية الذهبية في خلية تدفق، وتراوح معدل المسح الضوئي بين 100 فولت/ثانية و1000 فولت/ثانية. وكان كل من الأقطاب الدقيقة العارية والذهبية النانوجسيم المعدلة استجابة خطية فيما يتعلق بمعدل المسح الضوئي، مما يدل على التحكم الامتزاز الدوبامين على سطح العارية والذهب نانوجسيم تعديل ميكروبوليست ألياف الكربون. أشرطة الخطأ هي خطأ قياسي للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 تجربة التركيز. (أ) العارية و (B) تعرضت الأقطاب الدقيقة تعديل الجسيمات النانوية الذهب لتركيزات مختلفة من الدوبامين 100 نانومتر – 100 درجة مئوية. وكان كل من الأقطاب الدقيقة العارية والجسيمات النانوية الذهبية المعدلة استجابة خطية فيما يتعلق الدوبامين تصل إلى 10 درجة مئوية، مما يدل على السيطرة الامتزاز على سطح القطب الكهربائي. في تركيزات أعلى من 10 درجة مئوية, نلاحظ منحنى المتقاربة, وهو ما يدل على تشبع الدوبامين على سطح القطب عن طريق احتلال جميع مواقع الامتزاز مما أدى إلى مزيد من السيطرة على الانتشار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن نبرهن على طريقة جديدة لبناء الذهب نانوجسيم تعديل الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون للكشف عن الناقلات العصبية مثل الدوبامين باستخدام المسح الضوئي السريع قياس فولتامتري دوري. هذه الطريقة هي نهج فعال وأخضر وغير مكلف نسبيا لتعزيز حساسية الكشف عن الجزيئات الحيوية. سمك الذهب المودعة على سطح ألياف الكربون يمكن السيطرة عليها من قبل وقت القطب الكهربائي وتركيز الذهب الموجود في حل القطب الكهربائي. وقد تبين أن الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون المعدلة بالذهب لديها مساحات سطحية كهربائية أعلى بكثير من الأقطاب العارية بالإضافة إلى حركية نقل الإلكترون الأسرع. كما كان لديهم حساسية أعلى وحدود أقل للكشف عن المواد العارية القطب غير المعدلة. وعلاوة على ذلك, وأظهرت الأقطاب الاستقرار نحو الكشف عن الدوبامين عند اختبارها في خلية التدفق لمدة 4 ساعة على الأقل. كان هناك استجابة خطية فيما يتعلق ذروة التيار التأكسدي للكشف عن الدوبامين فيما يتعلق بكل من معدل المسح الضوئي والتركيز لأقطاب ألياف الكربون المعدلة الذهب تدل على التحكم في الامتزاز على سطح القطب الكهربائي.
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول سحب الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون مع الساحبة الشعرية العمودية وتحقيق التصاق بين الوجهين بين الشعيرات الدموية الزجاجية وألياف الكربون باستخدام الايبوكسي. وعلاوة على ذلك، فإن وضع القطب من الذهب على سطح ألياف الكربون هو تحديا كبيرا للحفاظ على التوازن بين وجود طلاء موحد رقيقة من الذهب على سطح القطب والإفراط في إيداع الذهب الزائد على سطح القطب الكهربائي، والتي من شأنها أن تعوق الكشف عن الناقل العصبي من خلال الضوضاء وإشارة الزائد. وتشمل التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها طريقة تحسين طريقة وضع القطب فيما يتعلق بكل من الوقت والتركيز. وينبغي استخدام مصادرمختلفة من الذهب (AuCl 3، HAuCl4،وغيرها من هيدرات الذهب) لإجراء هذه التجارب. وتشمل القيود المفروضة على هذه الطريقة إمكانية تحميل الذهب المعبّأ بالكهرباء فوق إشارة التقوية بسبب الإفراط في الترسب. وعلاوة على ذلك، كمادة قطب معدني، يمكن للأقطاب الكهربائية المعدلة بالذهب أن تتأكسد المياه عند المسح الضوئي إلى إمكانات أعلى (أكثر من 1.45 فولت)، والتي يمكن أن تتداخل مع إشارة analyte.
هذه الطريقة هي تقدم ملحوظ في هذا المجال حيث أن الأقطاب الدقيقة المعدلة للجسيمات النانوية الذهبية تعزز بشكل كبير الكشف عن الناقل العصبي ولم يتم فحصها بدقة للكشف عن الناقل العصبي باستخدام FSCV. وهناك طريقة أخرى لتعزيز الإشارات الكهروكيميائية لـ CMFEs هي من خلال التعديل باستخدام الأنابيب النانوية الكربونية24و25و26. غالبًا ما تزيد الأقطاب الكهربائية من التدفّن في نظام التعليق على الأنابيب النانوية الكربونية من الإشارة. ومع ذلك، يتم زيادة الضوضاء أيضا كما طبقة من الأنابيب النانوية الكربون المودعة غير متجانسة. ترسب الجسيمات النانوية الذهبية هي طريقة سريعة وقابلة للاستنساخ وفعالة لإنشاء أجهزة استشعار الجزيئات الحيوية المحسنة. وسوف تشمل تطوير طريقة في المستقبل الاستفادة المثلى من تعديل الجسيمات النانوية الذهب من الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون خلق رقيقة، طبقات موحدة من الذهب على السطح على الأقطاب الدقيقة من ألياف الكربون. وعلاوة على ذلك, سيتم إجراء دراسة وتحسين الكشف عن المواد الكيميائية العصبية الأخرى (إفراز, السيروتونين, الهيستامين, أدينوسين, وغيرها) أيضا. وأخيرا، سيتم استخدام هذه الأقطاب الدقيقة المعززة المعدلة بالذهب لأداء في قياسات الجسم الحي من الناقلات العصبية في القوارض أو نماذج ذبابة الفاكهة. تعزيز الكشف عن الدوبامين من خلال تعديل الجسيمات النانوية الذهب يسمح للعديد من التطبيقات والدراسات الممكنة في العلوم العصبية مثل دراسة مرض باركنسون, تعاطي المخدرات, واضطرابات أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر الجامعة الأمريكية، ومنحة دعم البحوث الكلية، وناسا DC منحة الفضاء، وNSF-MRI #1625977.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502-5G | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
| Pine WaveNeuro Potentiostat | Pine Instruments | NEC-WN-BASIC | This orders comes in bulk with all other accessories such as headstages, adapters, cords, and other electronics |
| Pine Flow Cell and Micromanipulator | Pine Instruments | NEC-FLOW-1 | This is also another bulk order including the micromanipulator, flow cell, knobs, tubing, connectors, etc. |
| Glass-Capillary | A-M Systems | 602500 | |
| T-650 Carbon Fiber | Goodfellow | C 005711 | |
| Epon 828 Epoxy | Miller-Stephenson | EPON 828 TDS | |
| Diethelynetriamine | Sigma Aldrich | D93856-5ML | |
| Gold (III) chloride | Sigma Aldrich | 254169 | Comes as either HAuCl4 or AuCl3 |
| pH meter | Fisher | S90528 | |
| Farraday Cage | AMETEK TMC | 81-334-03 | |
| Syringe Pump | NEW ERA PUMP | NE-1000 | |
| Eppendorf Pipettes and Tips | Eppendorf | 2231000222 | This is also a bulk order containing multiple pipettes and tips |
| 10 -1,000 mL beakers | VWR | 10536-390 | |
| Carbon fiber | Goodfellow | C 005711 | |
| SEM | JEOL | JSM-IT100 |
References
- Zestos, A. G., Nguyen, M. D., Poe, B. L., Jacobs, C. B., Venton, B. J. Epoxy insulated carbon fiber and carbon nanotube fiber microelectrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 182, 652-658 (2013).
- Bucher, E. S., Wightman, R. M. Electrochemical analysis of neurotransmitters. Annual review of analytical chemistry. 8, 239-261 (2015).
- Zestos, A. G., Venton, B. J. Communication—Carbon Nanotube Fiber Microelectrodes for High Temporal Measurements of Dopamine. Journal of The Electrochemical Society. 165, G3071-G3073 (2018).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of neurochemistry. 119, 932-944 (2011).
- Abdalla, A., et al. In Vivo Ambient Serotonin Measurements at Carbon-Fiber Microelectrodes. Analytical chemistry. 89, 9703-9711 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PloS one. 13, e0196932 (2018).
- Denno, M. E., Privman, E., Borman, R. P., Wolin, D. C., Venton, B. J. Quantification of histamine and carcinine in Drosophila melanogaster tissues. ACS chemical neuroscience. 7, 407-414 (2016).
- Sanford, A. L., et al. Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes. Analytical chemistry. 82, 5205-5210 (2010).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Analytical chemistry. 76, 5697-5704 (2004).
- Raju, D., et al. Polymer modified carbon fiber-microelectrodes and waveform modifications enhance neurotransmitter metabolite detection. Analytical Methods. 11, 1620-1630 (2019).
- Jacobs, C. B., Ivanov, I. N., Nguyen, M. D., Zestos, A. G., Venton, B. J. High temporal resolution measurements of dopamine with carbon nanotube yarn microelectrodes. Analytical chemistry. 86, 5721-5727 (2014).
- Zestos, A. G., Yang, C., Jacobs, C. B., Hensley, D., Venton, B. J. Carbon nanospikes grown on metal wires as microelectrode sensors for dopamine. Analyst. 140, 7283-7292 (2015).
- Zestos, A. G. Carbon Nanoelectrodes for the Electrochemical Detection of Neurotransmitters. International Journal of Electrochemistry. , (2018).
- Kim, J. H., et al. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease. Nature. 418, 50 (2002).
- Zestos, A. G., et al. Ruboxistaurin Reduces Cocaine-Stimulated Increases in Extracellular Dopamine by Modifying Dopamine-Autoreceptor Activity. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1960-1969 (2019).
- Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS Journal. 19, 1284-1293 (2017).
- Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42, 1940 (2017).
- Zestos, A. G., Venton, B. J. Carbon Nanotube-Based Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection. ECS Transactions. 80, 1497-1509 (2017).
- Zachek, M. K., Hermans, A., Wightman, R. M., McCarty, G. S. Electrochemical Dopamine Detection: Comparing Gold and Carbon Fiber Microelectrodes using Background Subtracted Fast Scan Cyclic Voltammetry. J Electroanal Chem (Lausanne Switz). 614, 113-120 (2008).
- Li, J., Xie, H., Chen, L. A sensitive hydrazine electrochemical sensor based on electrodeposition of gold nanoparticles on choline film modified glassy carbon electrode. Sensors and Actuators B: Chemical. 153, 239-245 (2011).
- Hartings, M. R., Fox, D. M., Miller, A. E., Muratore, K. E. A hybrid integrated laboratory and inquiry-based research experience: replacing traditional laboratory instruction with a sustainable student-led research project. Journal of Chemical Education. 92, 1016-1023 (2015).
- Hart, C., et al. Protein-templated gold nanoparticle synthesis: protein organization, controlled gold sequestration, and unexpected reaction products. Dalton Transactions. 46, 16465-16473 (2017).
- Hartings, M. R., et al. Concurrent zero-dimensional and one-dimensional biomineralization of gold from a solution of Au3+ and bovine serum albumin. Science and technology of advanced materials. 14, 065004 (2013).
- Xiao, N., Venton, B. J. Rapid, sensitive detection of neurotransmitters at microelectrodes modified with self-assembled SWCNT forests. Analytical chemistry. 84, 7816-7822 (2012).
- Zestos, A. G., Jacobs, C. B., Trikantzopoulos, E., Ross, A. E., Venton, B. J. Polyethylenimine Carbon Nanotube Fiber Electrodes for Enhanced Detection of Neurotransmitters. Analytical chemistry. 86, 8568-8575 (2014).
- Yang, C., et al. Carbon nanotubes grown on metal microelectrodes for the detection of dopamine. Analytical chemistry. 88, 645-652 (2015).
