Summary
Bu çalışmada, nörotransmitter algılamanın hassasiyetini arttırmak için karbon-fiber mikroelektrotları altın nanopartiküllerle değiştiriyoruz.
Abstract
30 yılı aşkın bir süredir, karbon fiber mikroelektrotlar (CFMEs) nörotransmitter tespiti için standarttır. Genellikle, karbon lifleri cam kapiller içine emişli, ince bir konik çekti, ve daha sonra bir epoksi kullanarak mühürlü hızlı tarama döngüsel voltammetri test için kullanılan Elektrot malzemeleri oluşturmak için. Ancak, çıplak CFD 'lerin kullanımı birkaç sınırlamalara sahiptir. İlk ve en önemlisi, karbon fiber çoğunlukla bazal düzlem karbon içerir, hangi nispeten düşük bir yüzey alanı vardır ve diğer Nanomalzemeler daha düşük hassasiyetleri verir. Ayrıca, Grafitik karbon temporal çözünürlüğü ile sınırlıdır, ve nispeten düşük iletkenlik. Son olarak, nörokimyasalların ve makromoleküllerin karbon elektrotlarının yüzeyinde faul olduğu bilinmektedir ve bu da daha fazla nörotransmitter adsorpsiyonu engelleyen iletken olmayan polimerler oluşturur. Bu çalışma için, biz hızlı tarama döngüsel voltammetry ile nörokimyasal test geliştirmek için altın nanopartiküller ile CFMEs değiştirin. Au3 + elektroyatırılmış veya cfmes yüzeyine bir Koloidal solüsyondan dipkaplamalı oldu. Altın istikrarlı ve nispeten inert metal olduğundan, nörokimyasalların analitik ölçümleri için ideal bir elektrot malzemesidir. Altın nano madde modifiye (AuNP-CFMEs) üzerinde dopamin tepkisi için bir istikrar vardı 4 h. Ayrıca, AuNP-CFMEs (döngüsel voltammograms daha yüksek zirve oksidatif akım) ve daha hızlı elektron transfer kinetiği (düşük ΔEP veya pik ayırma) çıplak değiştirilmemiş cfmes daha artan bir hassasiyet sergiler. AuNP-CFMEs gelişimi, dopamin konsantrasyonu ve diğer nörokimyasallarda hızlı değişikliklerin tespit edilmesi için yeni elektrokimyasal sensörlerin oluşturulmasını sağlar. Bu çalışma nörokimyasal ölçümlerin geliştirilmesi için geniş uygulamalara sahiptir. Altın nano madde değiştirilmiş CFMEs nesil uyuşturucu istismar, depresyon, inme, iskemi nörokimyasal etkilerini incelemek için kemirgen ve diğer modellerde nörotransmitter içinde bulmak için yeni elektrot sensörleri gelişimi için hayati önem taşır, ve diğer davranış ve hastalık durumları.
Introduction
Karbon-fiber mikroelektrotlar (CFMEs)1 en iyi çeşitli önemli nörotransmitter oksidasyonunu algılamak için biyosensörler olarak kullanılır2, dopamin dahil3, norepinefrin4, serotonin5, adenozin6, histamin7, ve diğerleri8. Karbon liflerinin biyouyumluluğu ve büyüklüğü, daha büyük standart elektrotlara kıyasla hafifletilmiş doku hasarı olduğu için implantasyon için optimum hale gelmelerini sağlamak. 9 cfmes, yararlı elektrokimyasal özelliklere sahip olduğu bilinmektedir ve hızlı elektrokimyasal teknikleri ile kullanıldığında hızlı ölçümler yapma yeteneğine sahiptir, en sık hızlı tarama döngüsel voltammetri (fscv)10,11. Fscv, uygulanan potansiyeli hızla tarayan ve belirli analitler için belirli bir döngüsel voltammogram sağlayan bir tekniktir12,13. Hızlı tarama tarafından üretilen büyük şarj akımı karbon lifleri üzerinde kararlı ve arka plan-belirli döngüsel voltammograms üretmek için çıkarılır olabilir.
Optimum Elektrokimya ve nörobiyolojik önemi nedeniyle, dopamin yaygın olarak incelenmiştir. Katekolamin dopamin hareket kontrolü, bellek, biliş ve sinir sistemi içinde duygu önemli bir rol oynar temel bir kimyasal haberci olduğunu. Dopamin fazlasının veya eksikliği çok sayıda nörolojik ve psikolojik müdahaleye neden olabilir; Bunlar arasında Parkinson hastalığı, şizofreni ve bağımlılık davranışları bulunmaktadır. Günümüzde Parkinson hastalığı, Dopamin sentezi14' te yer alan orta beyin nöronların dejenerasyonuna bağlı olarak yaygın bir bozukluk olmaya devam etmektedir. Parkinson hastalığı belirtileri tremor, hareket yavaşlığı, sertlik ve dengeyi koruyarak sorunları içerir. Öte yandan, kokain15 ve ampfetamin gibi stimantlar16,17 dopamin taşması teşvik. Uyuşturucu istismarı sonunda dopamin ve koşulların normal akışını yerine beyin dopamin bir fazlasının gerektirecektir, hangi sonunda bağımlılık davranışları yol açar.
Son yıllarda, nörotransmitter tespiti18elektrot işlevselliğini geliştirmeye vurgu olmuştur. Elektrot hassasiyetini arttırmak için en yaygın yöntem fiber yüzeyi kaplamasıdır. Şaşırtıcı olarak, karbon lifleri üzerine metal nanopartikül elektrobiriktirme üzerinde yapılan sınırlı araştırma olmuştur19. Altın gibi Noble metal-nanopartiküller, diğer fonksiyonel malzemeler20ile fiber yüzeyi üzerine elektroyatırılabilir. Örneğin, nörotransmitter adsorpsiyonu için elektroaktif yüzey alanının artırılması ortaya çıkar. Elektroyatırılmış metal nanopartiküller hızla form, arındırılabilir, ve karbon-fiber uymak. Elektrokimya hem asil metal Nanopartiküllerin birikmesi hem de karbon liflerinin yüzey geliştirmesi için önemli olmaya devam ediyor, bu Nanopartiküllerin nüksetme ve büyümesini kontrol etmesini sağlar. Son olarak, artan katalizör ve iletken özellikleri, ve geliştirilmiş toplu taşıma elektroanaliz için metal nano opartikülleri kullanarak diğer avantajları arasındadır.
Amerikan Üniversitesi Gelişmiş Laboratuar dizisi kursu (deneysel biyolojik Kimya ı ve II CHEM 471/671-472/672) analitik, fiziksel ve biyokimya laboratuvarlarının bir kombinasyonudur. İlk dönem laboratuvar tekniklerine genel bir bakış. İkinci dönem öğrenci odaklı ve araştırma projesi21' dir. Bu projeler için, öğrenciler daha önce biomolecule, protein, peptid ve amino asit-altın nano opartiküllerin kolaylaştırılmış sentezi mekanizmasını inceledi22,23. Daha yeni çalışmalar, elektrot yüzeylerinde altın nanopmadde (AuNP) üretiminin oluşumu ve CFMEs 'in nörotransmitterleri tespit etme becerisi üzerindeki AuNPs efektlerinin değerlendirilmesi konusunda odaklanmıştır. Bu çalışmasında laboratuar, CFMEs 'in dopamin-oksidasyonunu algılayan hassasiyetinin, AuNP 'nin fiber yüzeye elektrobirikmesi yoluyla artırılacağını göstermek için bu tekniği uygulıyor. Her Bare-CFME, CFME yüzeyinde dopamin oksidasyonunu ölçmek için dopamin-oksidatif akımları tespit ederken tarama hızı, stabilite ve dopamin-konsantrasyonu değişen ile karakterize edilir. Au3 + daha sonra au0 electroreduced ve aynı anda nanopartiküller olarak fiber yüzeyine üzerine elektroyatırılmış, karakterize deneyler bir dizi izledi. Doğrudan bir karşılaştırmanın ardından, AuNP-CFMEs dopamin tespiti daha yüksek hassasiyete sahip bulundu. Elektrik biriktirme yoluyla fiber yüzeyine AuNP uniform kaplama daha yüksek bir elektroaktif yüzey alanı oluşturur; Böylece, modifiye elektrot yüzeyine dopamin adsorpsiyonu artırma. Bu daha yüksek dopamin oksidatif akımları yol açtı. "AuNP-CFMEs" ' in dopamin oksidasyonu ve azaltma zirvelerinin (∆ Ep) olası ayrımı da daha küçüktür, daha hızlı Elektron transferi kinetiği önermektedir. Bu çalışmanın gelecekteki çalışmaları, dopamin tespiti için hem çıplak hem de AuNP-CFMEs ' i k in vivo testlerini içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. karbon-fiber mikroelektrotların inşaatı
-
Karbon liflerinin hazırlanması
- Karbon fiber mikroelektrotlar oluşturmak için, ilk önce karbon liflerini (karbon fiber, çapı 7 mm) tek tek el, eldiven ve spatula kullanarak ayırın.
- Çekin veya bükülmüş iplik bir fiber yank.
- Yalıtılmış bir karbon lifine cam kapiller içine aspirate (microfilament olmadan tek varil borosilikat kapiller cam, 1,2 mm dış çapı, 0,68 mm iç çapı).
- Yaklaşık 10 cm uzunluğunda 25 cm genişliğinde bir karton parçasını keserek elektrotlar için bir Elektrot tutucu oluşturun.
- Elektrotları dikey kılcal çektirme kullanarak çekin.
- Dikey kapiller çektiren sürgülü kapıyı açın.
- Cam kapiller eklemek için yeterli alan ile matkap-ayna saat yönünün tersine çevirerek, metalik tutucu çubuk gevşetin ve çıkarın.
- Cam kapiller elektrot tutucusuna takın. Cam kapiller dikey kapiller el ile elle yukarı kaldırın.
- Cam kapiller, kesme veya kırılma olmadan saat yönünde matkap-chucks ile cam kılcal sıkın.
- Isıtıcı 1, ısıtıcı 2 ve mıknatıs ayarlarını üreticiye ayarlayın, cam kapillarlerini Elektrot malzemeleri için ince bir konik olarak çekmek için önerilen seviyeleri.
- Elektrotları basınç, yerçekimi ve ısıtma yoluyla çekmek için helezon bobini ısıtmak için kırmızı Başlangıç düğmesine basın.
- Sarmal bobin kırmızı sıcak durumundan serin bırakın. İki çekilen elektrotları yukarıdan aşağıya bağlayan makas ile karbon lifine kes. Matkap-ayna yöntemini kullanarak, cam kapiller dikey kapiller çektirme ile saat yönünde ters yönde bükülerek çıkarmak için.
2. karbon-fiber Microelektrot hazırlama
- Bir stereoskop veya mikroskop altında, cam kapiller yüzeyinden cerrahi makas veya keskin bir jilet ile yaklaşık 100 – 150 μm uzunluğundaki karbon lifini keser.
- Bir pamuklu çubuk kullanarak 25 mL şişede 0,2 mL sertleştirici ile 10 g epoksi karıştırarak epoksi çözeltisi hazırlayın.
- Yaklaşık 15 s için epoksi ve sertleştirici çözeltisi içine her elektrot sadece ucunu dip.
- Yaklaşık 3 s için aseton karbon fiber mikroelektrot yukarıda bahsedilen üst daldırma karbon fiber mikroelektrot varil herhangi bir aşırı epoksi yıkayın.
3. elektrobiriktirme
- Çalışma elektrotunun (karbon-fiber mikroelektrot) 0,5 mM HAuCl4 ' ün çözeltisi ile mikro manipülatörü kullanarak referans elektrot, gümüş-gümüş klorür (Ag/AgCl) ek olarak yerleştirin.
- Çalışma elektrot ve referans elektrot potansiyostat ve baş aşamasına bağlayın.
- UNC HDCV yazılımını açın. Dalga formunu uygulamak için yazılımın ayarlarını değiştirin. Bilgisayar ayarlarına aşağıdaki dalga formunu girin: 0,2 V ile − 1,0 V arasında 0,1 M KCl solüsyonu içeren 0,5 mM HAuCl4 ' ten 10 döngü Için 50 MV/s tarama hızında tarama yapın. Dalga formunu uygulamak için yeşil oka basın. Ardından, ölçümleri kaydetmeye başlamak için Başlat düğmesine basın.
4. tarama Elektron Mikroskopisi
Not: görüntü çıplak ve altın nanopartikül modifiye karbon fiber microelektrotlar Tarama elektron mikroskobu enstrüman (SEM) kullanarak. Numuneyi siyah iletken bandın üzerine yükleyin ve üreticinin talimatında açıklanan talimatları uygulayın.
-
Cihazı açma
- Başlat ve bırakın tuşunu açın.
- Intouchscope yazılımını çift tıklatarak açın.
- Anahtarı bırakın. Kendi üzerindeki I sembolüne inmeli.
- EVAC düğmesinin yanıp sönmeyi beklemesi için bekleyin.
- EVAC düğmesi yanıp sönmeyi durdurduktan sonra VENT düğmesine basın.
- VENT düğmesinin yanıp sönmeyi durdurmasını bekleyin.
- Çalışma mesafesinin (WD) 20 mm – 30 mm olduğundan emin olun.
- Beklerken, örnek (ler) hazırlayın.
-
Tarama
- VENT düğmesi yanıp sönmeyi durdurduktan sonra numuneyi (s) cihaza yükleyin.
- Örnek tutucunun eğri parçasının, numune (ler) yüklenirken cihaza doğru işaret edilmesini sağlayın.
- Numune (ler) yüklendikten sonra EVAC düğmesine basın.
- Çalışma mesafesini 10 mm 'ye ayarlayın.
- EVAC düğmesi yanıp sönmeyi durdurduktan sonra bilgisayarı açın.
- Masaüstünde bulunan Touch Scope yazılımına tıklayın. İki dokunmatik kapsam yazılım, yeşil ve sarı daire olmadan birini tıklayın vardır.
- Yazılım açıldığında, ışın açmak için, gözlemlemek (ekranın sağ üst) tıklayın. GÖZLEM düğmesine tıklamadan önce EVAC düğmesinin yanıp sönmesini durdurduğundan emin olun.
- Örnek (ler) analiz etmeye başlayın.
- Voltaj, çalışma mesafesi (WD) ve prob akımı (PC) ayarlarının kabul edilebilir olduğundan emin olun.
- Daha yüksek bir ayar için uzaklaştır (~ 50X) ve daha düşük bir ayar için yakınlaştırın.
- Çalışma mesafesini 10 mm olarak ayarlayın.
- Numunenin (s) bir resmini çekmeden önce, resmin istenen hedef klasöre kaydedilmesini sağlayın.
- İstediğiniz klasörü seçmek için ayarları tıklayın (ekranın sol üst).
- Fotoğrafları bilgisayardan Flash sürücü üzerinden dışa aktarın.
-
Kapatma
- Tıklayın gözlemlemek ışın kapatmak için.
- VENT düğmesine basın ve yanıp sönmeyi durdurmasını bekleyin.
- VENT düğmesinin yanıp sönmesini beklerken, çalışma mesafesini 20 mm – 30 mm 'ye geri ayarlayın.
- VENT düğmesi yanıp sönmeyi durdurduktan sonra numuneyi (s) aletten boşaltın.
- EVAC düğmesine basın ve yanıp sönmeyi durdurmasını bekleyin.
- EVAC düğmesi yanıp sönmeyi durdurduktan sonra, yazılımın dışına çıkın ve bilgisayarı kapatın.
- Cihazı tamamen kapatmak için anahtarı O sembolüne çevirin.
5. hızlı tarama döngüsel voltammetri test
- Karbon fiber mikroelektrot, Ag/AgCl referans elektrot ile birlikte potansiyostat ve baş aşamasına bağlanır.
- Mikromanipülatörü kullanarak, X, Y ve Z ölçüm düğmelerini manuel olarak ayarlayarak karbon fiber mikroelektrodunun akış hücresine doğru şekilde düşürülmesi.
- DI su (131,5 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,25 mm Nah2Po4, 1,2 mM MgCl2ve 2,0 mm na2yani4 pH ile ayarlanabilir buffer eriyik hazırlamak 7,4).
- Akış hücresini fosfat tamponlu tuz (PBS) tampon ile doldurun (pH = 7,4).
- Bir dolu 60 mL tampon şırıngası kullanarak, yaklaşık 1 mL/dk akış hücresine PBS tampon enjekte.
- Elektrodu akış hücresine yerleştirin ve yeşil düğmeye basarak dalga formunu uygulayın. Osiloskop gözlemlemek ve ya elektrot kesilmiş ya da aşırı yükleme önlemek için kazanç ayarlayın. Her elektrot çalışması arasında yaklaşık 10 dk dengelemesinden için izin verin.
- Varsayılan dalga formunu dopamin dalga formuna ayarlayın. 10 Hz ve 400 V/s 'de 0,4 V-1,3 V arasında tarama yapın.
- 10 mM dopamin, serotonin, norepinefrin ve diğerleri perklorik asit stok çözümü hazırlayın. Bir pipet kullanarak 10 mL PBS tamponundaki dopamin stok çözeltisi 1 μM pipetleme ile tampon olarak 1 μM ' lik son konsantrasyona nörokimyasalların seyreltilme.
- Ölçümlere başlamak için kayıt düğmesine basın. 10 s sonra, 0,2 mL enjekte 1 μM dopamin akış hücresine veya herhangi bir diğer konsantrasyon nörotransmitter. Konsantrasyonunu, tarama hızını, dalga formunu (potansiyel veya anahtarlama potansiyelini) buna göre ayarlayın. 30 s için toplam çalışma süresini ayarlayın.
- HDCV analiz yazılımını kullanarak çalışmasını analiz edin. Parametreleri gerektiği gibi değiştirin.
- Deneme tamamlandıktan sonra, 3 mL su enjekte ederek akış hücresini temizleyin ve sonra her biri üç kez akış hücresinin tampon ve enjeksiyon limanlarına hava yerleştirin.
- Dalga formunu ve aleti kapatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1için, BIZ FSCV test içinde vitro nörotransmitter konsantrasyonu ölçmek için kullanılan bir şematik gösterir. Şekil 1 uygulanan dopamin dalga formunu görüntüler. Üçgen dalga formu-0,4 V 'den 1,3 V 'ye 400 V/s 'de tarama yapar. Sol rakam ikinci bölümünde, dopamin-Ortho-Quinone (DOQ) için dopamin oksidasyonu görüntüler, iki elektron transfer süreci elektrot yüzeyine analit yüzeyinden oluşur. Son olarak, bir geçerli vs zaman Plot bir renk çizimi ile kaplanmış. Mevcut vs zaman Plot dopamin oksidasyon bir temsilidir. Dopamin oksidasyon olmadığı zaman düz ve dopamin dopamin-orthoquinone için oksitlenmiş ve analitik adsorbs olarak dopamin geri aşağı azaltılmış ve daha sonra, elektrot yüzeyinden desorbs dikey olarak yükselir. Renk Arsa akım 3 boyutlu bir arsa olduğunu. Sarı akım arka plan akımı (sıfır yakın), yeşil Arsa pozitif oksidasyon akımı (dopamin orthoquinone dopamin oksidasyonu) iken, ve mavi Arsa negatif azalma akımı (dopamin için dopamin orthoquinone azalma).
SEM, çıplak ve modifiye karbon elektrotlarının görüntü yüzey özellikleri için kullanılmıştır. Şekil 2' de, üç farklı elektrot malzemesi arasında yüzey özellikleri içinde benzersiz bir fark görürsünüz. Şekil 2a'da, çıplak karbon fiber mikroelektrot gösterilir. Fiber, dış cephe boyunca silindirik sırtlı yaklaşık 7 μm çapındadır. Şekil 2B , yaklaşık 20 dakika karbon fiber yüzeyinden altın çıkıntılı büyük keskin sırt ile karbon fiber yüzeyine elektroyatırılmış altın nano maddeler gösterir. EDS/EDX ölçümleri ile altın varlığı daha da doğrulandı. Daha sonra elektrobiriktirme süresini 5 dakikaya indirdik ve Şekil 2C'de gösterildiği gibi ince üniforma kaplama altını gözlemledik.
Duyarlılık ve elektron transferinin karşılaştırılması
Şekil 3A duyarlılık ve elektron transferinin bir karşılaştırmasını gösterir. Çakışan döngüsel voltammograms ile gösterildiği gibi, altın-modifiye karbon fiber mikroelektrotlar önemli ölçüde daha yüksek zirve oksidatif akımları vardır (Şekil 3B) ve daha hızlı elektron transfer kinetiği (ΔEP). Anlamlı bir eşlenmemiş t-testi ile ölçülmüştür (P = .004 ve. 0016, sırasıyla). Hata çubukları ortalama standart hatadır.
Istikrar
Çıplak (Şekil 4A) ve altın nano madde modifiye (Şekil 4b) cfmes 4 h için akış hücresine yerleştirildi. 4 saat boyunca her saatte 1 μM dopamin tespiti için ölçümler alınmıştır. Her iki elektrotta dopamin ile ilgili istikrarlı bir tepki vardı. Dopamin için istikrarlı bir yanıt (su oksidasyonu olmadan) biyolojik doku ölçümleri gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir. Hata çubukları ortalama standart hatadır.
Tarama oranı
Tarama hızı 100 V/s 'den 1.000 V/s 'ye kadar değişmektedir. Hem Bare (Şekil 5A) hem de altın nanomadde (Şekil 5B) modifiye elektrotlar dopamin tespiti ile ilgili doğrusal bir yanıt gösterdi, bu nedenle, çıplak ve altın nano madde değiştirilmiş yüzeyine adsorpsiyon kontrolünü gösteren mikroelektrot. Hata çubukları ortalama standart hatadır.
Konsantrasyon
Konsantrasyon, 100 nM-100 μM dopamin (Şekil 6a) ve altın nano madde modifiye (Şekil 6B) karbon fiber mikroelektrotlar arasında değişmektedir. Doğrusal Aralık 100 nM 'den 10 μM ' ye kadar oldu. 10 μM sonra, dopamin karbon fiber mikroelektrot yüzeyinde süper doymuş olduğunu gösteren bir asimptotik eğrisi gözlemliyoruz. Dopamin konsantrasyonu ile ilgili olarak en yüksek oksidasyon akımı için doğrusal yanıt elektrot yüzeyine adsorpsiyon kontrolünü gösterir. Beyin dopamin fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonları bu aralıkta ve beyin bölgeleri arasında değişir.
Şekil 1. Dopamin oksidasyonu şematiği. Dopamin oksitleyici karbon fiber mikroelektrot kaplama. Dopamin dopamin-orthoquinone ve geri dopamin üçgen dopamin dalga uygulanır olarak oksitlenir olarak yüzeyden şarj transferi gösterilir (-0,4 V 1,3 V içinde 400 V/s). Geçerli vs zaman ve renk çizimleri dopamin oksidasyonu (yeşil) ve dopamin azaltma (mavi) gösteren gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2. SEM görüntüleri (a) çıplak karbon fiber mikroelektrot, (b) altın-nanopmadde modifiye karbon fiber mikroelektrotlar ile 20 dk elektrot biriktirme süresi, ve (c) altın-nanopmadde modifiye mikroelektrotlar ile 5-dk elektrot biriktirme süresi. Bu, altın nanomadde kaplamaların büyüklüğü ve kalınlığı elektrobiriktirme süresi ile kontrol edilebilir ilke sonuçlarının kanıtı sağlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. Çıplak ve altın-nanopmadde modifiye elektrotların duyarlılık karşılaştırması. (A) çıplak ve altın nano madde değiştirilmiş mikro elektrotlar döngüsel voltammograms bindirme. (B). çubuk grafik çıplak ve altın nanopmadde değiştirilmiş mikroelektrotlar zirve oksidatif akım farklılıkları gösterir. (C). çıplak ve altın nano madde modifiye mikroelektrotlar arasında ΔEP farkı gösteren çubuk grafik. Hata çubukları ortalama standart hatadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. Kararlılık deneyi. (A) çıplak ve (B) altın nanopmakale-modifiye mikroelektrotlar toplam en az 4 saat boyunca bir akış hücresine yerleştirildi. 1 μM dopamin karşı duyarlılığı 4 h üzerinde ölçülmüştür. Her ikisi de 4 saat dopamin için tek bir tepki vardı. hata çubukları ortalama standart hatadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5. Tarama oranı deneyi. (A) Bare ve (B) altın nanopmakale-modifiye mikroelektrotlar bir akış hücresine yerleştirildi ve tarama hızı 100 v/s 'den 1.000 v/s 'ye değiştirildi. Hem çıplak hem de altın nano-madde değiştirilmiş mikroelektrotlar oranı tarama ile ilgili doğrusal bir yanıt vardı, böylece çıplak ve altın nano madde değiştirilmiş karbon fiber mikroelektrot yüzeyine dopamin adsorpsiyon kontrolünü ifade. Hata çubukları ortalama standart hatadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6. Konsantrasyon deneyi. (A) çıplak ve (B) altın nanopmakale-modifiye mikroelektrotlar dopamin çeşitli konsantrasyonlarda maruz kalmış 100 Nm – 100 μM. Hem çıplak hem de altın nanomadde değiştirilmiş mikroelektrotlar, 10 μM ' ye kadar dopamin ile doğrusal bir tepki göstermişti, böylece elektrot yüzeyine adsorpsiyon kontrolünü gösterir. 10 μM ' den yüksek konsantrasyonlarda, tüm adsorpsiyon sitelerini işgal ederek ve daha fazla difüzyon kontrolüne neden olan, elektrot yüzeyinde dopamin doygunluğunun göstergesi olan bir asimptotik eğrisi gözlemliyoruz. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biz hızlı tarama döngüsel voltammetry kullanarak dopamin gibi nörotransmitter tespiti için altın-nanopmadde modifiye karbon fiber mikroelektrotlar inşa etmek için bir roman yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, biyomolekül algılamanın hassasiyetini arttırmak için verimli, yeşil ve nispeten ucuz bir yaklaşımdır. Karbon lifinin yüzeyine yatırılan altın kalınlığı, elektrobiriktirme süresi ve elektrobiriktirme çözeltisi içinde bulunan altın konsantrasyonu ile kontrol edilebilir. Altın modifiye karbon-fiber mikroelektrotlar daha hızlı elektron transfer kinetiği ek olarak çıplak elektrotlar daha önemli ölçüde daha yüksek elektroaktif yüzey alanlarına sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca daha yüksek hassasiyetleri ve çıplak modifiye edilmemiş elektrot malzemelerinden daha düşük algılama sınırları vardı. Ayrıca, elektrotlar en az 4 h için akış hücresinde test edildiğinde dopamin tespiti yönünde bir istikrar gösterdi. Elektrotların yüzeyine adsorpsiyon kontrolünü gösteren altın modifiye karbon fiber elektrotlar için hem tarama hızı hem de konsantrasyon ile ilgili olarak dopamin tespiti için zirve oksidatif akımı ile ilgili doğrusal bir yanıt vardı.
Protokoldeki kritik adımlar arasında dikey kılcal çektirme ile karbon fiber mikroelektrotların çekilmesi ve epoksi kullanılarak cam kapiller ve karbon fiber arasında arayüzey yapışma elde edilmesi yer aldı. Ayrıca, karbon fiber yüzeyine altın elektrobirikmesi oldukça elektrodu yüzeyinde altın ince bir üniforma kaplama sahip ve aşırı altın yatırılması arasında bir denge korumak için zordur gürültü ve sinyal aşırı aracılığıyla nörotransmitter algılama engel olacak elektrot. Değişiklikler ve yöntem sorun giderme, hem zaman hem de konsantrasyon ile ilgili olarak elektrobiriktirme yöntemini optimize etmek içerir. Farklı altın kaynakları (AuCl3, haucl4ve diğer altın Hidratlar) bu deneyleri gerçekleştirmek için kullanılmalıdır. Yöntemin sınırlamaları, aşırı biriktirme nedeniyle potansiyostat sinyalinin aşırı yüklenmesine neden olan elektroyatırılmış altın olasılığını içerir. Ayrıca, bir metal elektrot malzemesi olarak, altın modifiye elektrotlar potansiyel (üzerinde 1,45 V), daha yüksek potansiyeller için tarama zaman su oksitlemek olabilir, hangi analit sinyali ile müdahale olabilir.
Yöntem altın nanopmadde modifiye mikroelektrotlar önemli ölçüde nörotransmitter algılama geliştirmek ve iyice FSCV kullanarak nörotransmitter algılama için incelenmemiş olarak alanında işaretlenmiş bir ilerleme olduğunu. Cmfes için elektrokimyasal sinyallerin artırılması başka bir yöntem karbon nanotüpler ile modifikasyon yoluyla24,25,26. Karbon nanotüpler süspansiyonları içine dipkaplama elektrotlar genellikle sinyali artırır. Ancak, biriken karbon nanotüpler tabakası heterojen olduğu gibi gürültü de artar. Altın nanomadde birikimi, gelişmiş biyomolekül sensörleri oluşturmak için hızlı, tekrarlanabilir ve etkili bir yöntemdir. Gelecek Yöntem geliştirme karbon-fiber mikroelektrotlar altın nanopmadde modifikasyon optimizasyon dahil edecek ince oluşturmak, karbon fiber mikroelektrot üzerinde yüzey üzerinde altın üniforma katmanları. Dahası, çalışma ve diğer nörokimyasalların tespiti optimizasyonu (norepinefrin, serotonin, histamin, adenozin, ve diğerleri) de yapılacaktır. Son olarak, bu gelişmiş altın modifiye mikroelektrotlar kemirgen veya meyve sinek modellerinde nörotransmitter içinde vivo ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılacaktır. Altın nano madde modifikasyon ile dopamin algılama geliştirme birçok olası uygulama ve nörobilimlerde çalışmalar gibi Parkinson hastalığı, uyuşturucu istismarı ve diğer bozukluklar okuyan sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz Amerikan Üniversitesi, fakülte araştırma destek Grant, NASA DC uzay Grant ve NSF-MRI # 1625977 teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502-5G | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
| Pine WaveNeuro Potentiostat | Pine Instruments | NEC-WN-BASIC | This orders comes in bulk with all other accessories such as headstages, adapters, cords, and other electronics |
| Pine Flow Cell and Micromanipulator | Pine Instruments | NEC-FLOW-1 | This is also another bulk order including the micromanipulator, flow cell, knobs, tubing, connectors, etc. |
| Glass-Capillary | A-M Systems | 602500 | |
| T-650 Carbon Fiber | Goodfellow | C 005711 | |
| Epon 828 Epoxy | Miller-Stephenson | EPON 828 TDS | |
| Diethelynetriamine | Sigma Aldrich | D93856-5ML | |
| Gold (III) chloride | Sigma Aldrich | 254169 | Comes as either HAuCl4 or AuCl3 |
| pH meter | Fisher | S90528 | |
| Farraday Cage | AMETEK TMC | 81-334-03 | |
| Syringe Pump | NEW ERA PUMP | NE-1000 | |
| Eppendorf Pipettes and Tips | Eppendorf | 2231000222 | This is also a bulk order containing multiple pipettes and tips |
| 10 -1,000 mL beakers | VWR | 10536-390 | |
| Carbon fiber | Goodfellow | C 005711 | |
| SEM | JEOL | JSM-IT100 |
References
- Zestos, A. G., Nguyen, M. D., Poe, B. L., Jacobs, C. B., Venton, B. J. Epoxy insulated carbon fiber and carbon nanotube fiber microelectrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 182, 652-658 (2013).
- Bucher, E. S., Wightman, R. M. Electrochemical analysis of neurotransmitters. Annual review of analytical chemistry. 8, 239-261 (2015).
- Zestos, A. G., Venton, B. J. Communication—Carbon Nanotube Fiber Microelectrodes for High Temporal Measurements of Dopamine. Journal of The Electrochemical Society. 165, G3071-G3073 (2018).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of neurochemistry. 119, 932-944 (2011).
- Abdalla, A., et al. In Vivo Ambient Serotonin Measurements at Carbon-Fiber Microelectrodes. Analytical chemistry. 89, 9703-9711 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PloS one. 13, e0196932 (2018).
- Denno, M. E., Privman, E., Borman, R. P., Wolin, D. C., Venton, B. J. Quantification of histamine and carcinine in Drosophila melanogaster tissues. ACS chemical neuroscience. 7, 407-414 (2016).
- Sanford, A. L., et al. Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes. Analytical chemistry. 82, 5205-5210 (2010).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Analytical chemistry. 76, 5697-5704 (2004).
- Raju, D., et al. Polymer modified carbon fiber-microelectrodes and waveform modifications enhance neurotransmitter metabolite detection. Analytical Methods. 11, 1620-1630 (2019).
- Jacobs, C. B., Ivanov, I. N., Nguyen, M. D., Zestos, A. G., Venton, B. J. High temporal resolution measurements of dopamine with carbon nanotube yarn microelectrodes. Analytical chemistry. 86, 5721-5727 (2014).
- Zestos, A. G., Yang, C., Jacobs, C. B., Hensley, D., Venton, B. J. Carbon nanospikes grown on metal wires as microelectrode sensors for dopamine. Analyst. 140, 7283-7292 (2015).
- Zestos, A. G. Carbon Nanoelectrodes for the Electrochemical Detection of Neurotransmitters. International Journal of Electrochemistry. , (2018).
- Kim, J. H., et al. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease. Nature. 418, 50 (2002).
- Zestos, A. G., et al. Ruboxistaurin Reduces Cocaine-Stimulated Increases in Extracellular Dopamine by Modifying Dopamine-Autoreceptor Activity. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1960-1969 (2019).
- Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS Journal. 19, 1284-1293 (2017).
- Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42, 1940 (2017).
- Zestos, A. G., Venton, B. J. Carbon Nanotube-Based Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection. ECS Transactions. 80, 1497-1509 (2017).
- Zachek, M. K., Hermans, A., Wightman, R. M., McCarty, G. S. Electrochemical Dopamine Detection: Comparing Gold and Carbon Fiber Microelectrodes using Background Subtracted Fast Scan Cyclic Voltammetry. J Electroanal Chem (Lausanne Switz). 614, 113-120 (2008).
- Li, J., Xie, H., Chen, L. A sensitive hydrazine electrochemical sensor based on electrodeposition of gold nanoparticles on choline film modified glassy carbon electrode. Sensors and Actuators B: Chemical. 153, 239-245 (2011).
- Hartings, M. R., Fox, D. M., Miller, A. E., Muratore, K. E. A hybrid integrated laboratory and inquiry-based research experience: replacing traditional laboratory instruction with a sustainable student-led research project. Journal of Chemical Education. 92, 1016-1023 (2015).
- Hart, C., et al. Protein-templated gold nanoparticle synthesis: protein organization, controlled gold sequestration, and unexpected reaction products. Dalton Transactions. 46, 16465-16473 (2017).
- Hartings, M. R., et al. Concurrent zero-dimensional and one-dimensional biomineralization of gold from a solution of Au3+ and bovine serum albumin. Science and technology of advanced materials. 14, 065004 (2013).
- Xiao, N., Venton, B. J. Rapid, sensitive detection of neurotransmitters at microelectrodes modified with self-assembled SWCNT forests. Analytical chemistry. 84, 7816-7822 (2012).
- Zestos, A. G., Jacobs, C. B., Trikantzopoulos, E., Ross, A. E., Venton, B. J. Polyethylenimine Carbon Nanotube Fiber Electrodes for Enhanced Detection of Neurotransmitters. Analytical chemistry. 86, 8568-8575 (2014).
- Yang, C., et al. Carbon nanotubes grown on metal microelectrodes for the detection of dopamine. Analytical chemistry. 88, 645-652 (2015).
