Tekniske aspekt af automatiseret syntese og real-time Kinetic evaluering af [¹¹C] SNAP-7941

Summary

Her repræsenterer vi en protokol for fuldautomatiseret radioaktiv mærkning af [¹¹C] SNAP-7941 og analysen af real-time kinetikken af denne Pet-Tracer på P-GP udtrykker og ikke-udtrykker celler.

Abstract

Positron emission tomografi (PET) er en essentiel Molekylær billedbehandlings teknik, der giver indsigt i veje og brugerspecifikke målrettede radioligands til in vivo-undersøgelser. Inden for denne protokol beskrives en robust og pålidelig fjernstyret radio syntese af [¹¹C] SNAP-7941, en antagonist til melanin koncentrerende hormonreceptor 1. Den radio syntese starter med Cyclotron produceret [¹¹c] co₂ , der efterfølgende yderligere reageret via en gas-fase overgang til [¹¹c] ch₃OHF. Derefter, dette reaktive mellemprodukt er introduceret til forløberen løsning og danner den respektive radiotracer. Kemisk såvel som den radiokemiske renhed bestemmes ved hjælp af RP-HPLC, der rutinemæssigt gennemføres i den radiofarmaceutiske kvalitetskontrolproces. Desuden er den molære aktivitet beregnes som det er en nødvendighed for følgende real-time kinetiske undersøgelser. Desuden anvendes [¹¹C] SNAP-7941 på MDCKII-WT-og Mdckii-hMDR1-celler til at evaluere virkningen af p-glykoprotein (p-GP)-ekspression på celle akkumulering. Derfor anvendes p-GP-ekspression celle linjen (mdckii-hMDR1) enten uden eller med blokering før eksperimenter ved hjælp af p-GP-substrat (±)-verapamil, og resultaterne sammenlignes med dem, der observeres for dværg cellerne. Den overordnede eksperimentelle tilgang viser vigtigheden af en præcis tidsstyring, som er afgørende for alle prækliniske og kliniske studier med brug af PET-røbestoffer, der er radioaktivt mærket med kortlivede nuklider, såsom carbon-11 (Half-Life: 20 min).

Introduction

[¹¹C] SNAP-7941 blev udviklet som den første Positron emission tomografi (PET)-Tracer rettet mod melanin-koncentrerende hormonreceptor 1 (MCHR1)-en receptor primært involveret i den centrale regulering af appetit og fødeindtagelse¹. Carbon-11 mærkning af snap-7941, en velkarakteriseret MCHR1 antagonist, gav den autentiske Pet-Tracer^2,3,4,5. Fuldautomatiseret røntgen syntese er imidlertid yderst udfordrende med hensyn til tidseffektivitet og reproducerbarhed med den kortlivede radionukleid Carbon-11, der tilbyder en halveringstid på 20 min⁶. Den samlede syntese tid bør holdes på et minimum, og som en tommelfingerregel bør ikke overstige 2-3 halveringstiden (dvs. omkring 40-60 min for Carbon-11)⁷. Især, syntese procedurer for aktive målretning receptorsystemer med lav ekspression tætheder skal være grundigt optimeret til at opnå tilstrækkelige udbytter og dermed høj molær aktivitet⁸. Den syntetiske strategi følger ofte produktionen af radionukleider inden for en Cyclotron og frigivelse af [¹¹C] co₂ til synthesizeren. Der, [¹¹c] co₂ er først reduceret til [¹¹c] ch₄ og derefter reagerede med jod til at give [¹¹c] ch₃jeg via gas-fase metode^9,10. Yderligere behandling med sølv triflat udbytter [¹¹C] ch₃OTF direkte on-line. Bagefter introduceres dette reaktive Carbon-11-mærkede mellemprodukt i en opløsning, der indeholder forstadiet molekyle. En automatiseret røntgen syntese omfatter desuden en rensningsproces med semi-præparativ RP-HPLC, herunder efterfølgende formulering af produktet, der egner sig til prækliniske og kliniske studier.

Uanset halveringstiden for radionukliden og den tids indsats, der gøres af radiosyntesen, er farmakokinetikken af et radioaktivt lægemiddel den mest kritiske del, der skal evalueres under udviklingen af PET-Tracer. Med hensyn til Neuro Imaging, er hjernens indtræden af PET-Tracer den vigtigste forudsætning. Men, blod-hjerne barrieren (BBB), en "sikkerhedsgrænse" i hjernen, stærkt udtrykker effluks transportører, der kan losse små molekyler (f. eks Pet-Tracers) og effektivt hæmme deres anvendelighed.

En enorm ulempe under præklinisk evaluering er uventede interaktioner mod disse effluks transportører, som ofte ikke er anerkendt i in vitro eksperimenter og fører til svigt af PET-Tracer in vivo, som observeret for [¹¹C] snap-7941. μPET-billeddannelse hos rotter udviste lav hjerne ophobning, som steg dramatisk efter administration af P-GP-hæmmeren tariquidar¹¹. Disse data tydede på, at [¹¹C] snap-7941 er et substrat for dette effluks-transportørsystem, der hæmmer ligand-binding til central MCHR1. Desværre er der stadig mangel på tilstrækkelige in vitro-modeller gør det muligt at forudsige BBB penetration i en tidlig fase af Tracer udvikling.

Her beskriver vi den automatiserede syntese af [¹¹C] SNAP-7941 ved hjælp af en synthesizer til Carbon-11-methyleringer. Vægten af dette arbejde er at give et overblik om, hvordan man organiserer en fortløbende eksperimentel tilgang, herunder automatiseret syntese, kvalitetskontrol samt successive in vitro-evaluering med den meget kortlivede nuklid Carbon-11.

For det første beskrives de vigtigste trin for en vellykket radio syntese med minimale tids udgifter og maksimal udbytte. Derefter oprettes der en pålidelig kvalitetskontrolprocedure, som gør radio traceren tilgængelig for potentielle kliniske undersøgelser og opfylder kriterierne i den europæiske farmakopé¹². Kvantificering af molær koncentrationen og beregning af den pågældende molære aktivitet er et væsentligt krav for de efterfølgende kinetiske målinger.

Endelig præsenteres en ny og ligetil in vitro-metode, der evaluerer [¹¹C] snap-7941's interaktioner mod effluks-transporter, P-GP (hMDR1). Den foreslåede kinetiske model bruger en nem at håndtere enhed, der tillader en umiddelbar data fortolkning og kræver minimal cellekultur indsats¹³.

Protocol

Forsigtig: i den følgende protokol er der flere trin involveret, som kræver håndtering og manipulation af radioaktivitet. Det er vigtigt, at hvert skridt er i enighed med instituttets strålings sikkerhedsafdeling og den respektive nationale lovgiver. Det er obligatorisk at minimere eksponeringen for ioniserende stråling for de involverede operatører efter ALARA-princippet ("så lavt som det med rimelighed er muligt").

1. tidsstyring og planlægning af eksperimentet

Bemærk: den korte halveringstid af Carbon-11 kræver en nøjagtig tidsstyring for at minimere tab af radioaktivitet (figur 1). Det er vigtigt, at alle involverede personer kender deres ansvarsområde og tidspunktet for den pågældende handling. Til opsætning af et real-time kinetiske eksperiment af [¹¹C] snap-7941, er omkring fire personer nødvendige for en smidig proces.

1. Organiser en producent for [¹¹C] SNAP-7941.
2. Underrette den kvalitetskontrol operatør, som udfører specifikationen, beregningen af massekoncentrationen og den molære aktivitet af den sammenfattende starttid.
3. Hold Real-time kinetiske eksperimentatoren klar til fortynding beregning og udføre eksperimentet.
4. Instruere løberen for at overføre radioaktiviteten til det respektive sted på det respektive tidspunkt.

2. automatiseret syntese af [¹¹C] SNAP-7941 til præklinisk brug

1. Fremstilling af synthesizeren (figur 2).
   1. Tænd for synthesizer, nødvendige tekniske gasser (helium og brint) og synthesizer Control software Tracerlab. Vælg den respektive syntese sekvens snap.
   2. Vask v1-v3 en gang med vand og to gange med acetone via reaktoren og HPLC-ventilen enten ved belastning eller Injicer positionen i loop-beholderen.
   3. Tør alle tilknyttede linjer ind og ud af reaktoren via Indsprøjtnings ventilen med en kontinuerlig helium strøm aktiveret via v18.
   4. Opvarm [¹¹c] ch₃i fælden samt [¹¹c] ch₃otf fælde under en helium strøm på 100 ml · min^-1 op til 200 °C via V24, V25, V29, v15, v9, V17 og v32/V33 med fritliggende reaktor.
   5. Kontrollér den samme vej for lækager (med tilhørende reaktor) med en helium strøm på 100 mL · min^-1. Tæthed er garanteret, når strømmen falder til under 4 mL · min^-1.
   6. Tænd HPLC-pumpen (5-10 mL · min^-1) og vask HPLC-linjerne og Indsprøjtnings ventilen med acetonitril/vand (50/50, v/v) samt HPLC-linjerne med HPLC-opløsningsmidlet via v14 i pæren.
   7. Tøm pæren via v11 og V12 i affaldsflasken med en helium strøm via v19. Vask de respektive linjer med vand fra V6 igen via v11 og V12 med en helium strøm via v18.
   8. Vask V5 med ethanol og v4 med vand via v11 og V12 i produkt samlingen hætteglasset (PCV) ved hjælp af en helium strøm via V18, Tøm derefter PCV via v13 i til affaldsflasken med en helium strøm via V20.
   9. Drej HPLC-pumpen af, Skift til opløsningsmidlet til syntesen ((vandig ammonium acetat (2,5 g · L^-1)/eddikesyre 97,5/2.5 v/v; pH 3.5)/acetonitril 75/25 v/v), fastgør den semi-præparative HPLC kolonne og ækvibrere søjlen (strømmen af 5 mL · min^-1).
   10. Reagenserne til syntese og rensning fyldes: 1,5 mL vand (v2), 4,5 mL 0,9% NaCl (v4), 0,5 mL 96% ethanol (V5), 10 mL vand (v6) og 90 mL vand (pære).
   11. Fastgør et nyt hætteglas med sløjfe. et produkt hætteglas (mærket og udstyret med en beluftning nål) til v13 og den flydende nitrogen.
   12. Forudsætningen for en SPE (solid Phase ekstraktion) cylinderampul med 10 mL 96% ethanol og 20 mL vand og fastgør den mellem v11 og V12.
   13. Start pre-Run sekvens 20 min før start syntesen, bestående af opvarmning af [¹¹C] co₂ fælde til 400 °c og skylle fælden med en helium strøm på 50 ml · min^-1via V27 (2 min). Forskyl derefter [¹¹C] co₂ -fælden i 3 min med hydrogen gas (120 ml · min^-1) og afkøles til sidst til under 40 °c.
   14. 1 mg prækursorer opløses i 400 μL acetonitril (til DNA-syntese, < 10 H₂O), overføres opløsningen til reaktionen og tilsættes 5,5 ΜL tbah (264 mg · ml^-1 i methanol). Fastgør reaktoren til dens respektive position.
   15. Luk den varme celle og tænde under trykket af den varme celle.
   16. Bekræft starten af afkølingsprocessen for CH₄ -fælden med flydende nitrogen til-75 °c.
   17. Slip radioaktiviteten, når temperaturen er nået.
2. Produktion af Cyclotron på [¹¹C] co₂
   Bemærk: trin 2.2.1-2.2.4 udføres samtidig med forberedelsen af radiosyntese modulet (Se også figur 1).
   1. Tænd for cyklotron magnet.
   2. Vælg mål ¹¹C-Co₂ og Startbjælken 65 μA.
   3. Bekræft starten af bestråling ved at trykke på knappen Start bestråling
   4. Stop strålen og bekræft frigivelse af radioaktivitet i synthesizeren ved at trykke på knappen levering, efter den ønskede mængde radioaktivitet er nået (ca. 120 GBq efter 30 min).
3. Gennemførelse af den fuldt automatiserede radio syntese
   1. Bekræft, at systemet er klar til at modtage radioaktiviteten, og start den automatiserede proces
   2. Overvågning af følgende automatiserede proces.
      1. Kontroller, om [¹¹c] co₂ automatisk overføres fra Cyclotron til syntese enheden via V26 (ca. 4 min.), og at [¹¹c] co₂ er fanget på den molekylære sigte, der er imprægneret med nikkel som katalysator ([ ¹¹ C] CO₂ fælde) ved stuetemperatur.
      2. Spor, hvis [¹¹C] co₂ -fælden automatisk skylles først med helium (50 ml · min^-1) og derefter med hydrogen gas (120 ml · min^-1). Vær derefter opmærksom på, at V27 og V25 er lukkede, og at den indesluttet [¹¹c] co₂ inklusive hydrogen gassen opvarmes til 400 °c, og at den dannede [¹¹c] ch₄ transporteres videre til den forkølede [¹¹c] ch₄ fælde og fanget der.
      3. Monitor, at v10 er lukket, v9 åbnes (mod jod kolonne) og [¹¹c] ch₄ frigives igen ved opvarmning af [¹¹c] ch₄ fælde langsomt til 80 °c og transporteres ind i cirkulations enheden med en helium strøm via V10 (udstødnings udgang). Og yderligere kontrollere, om^[11c]_{ch 4} er konverteret til [¹¹c] ch₃i inden for cirkulations enheden, som holder i ca. 3 min og den dannede [¹¹c] ch₃jeg er konstant fanget på [¹¹c] CH₃jeg fælde.
      4. Sørg for, at udstødningsventilen V16 åbnes, og at [¹¹C] LM₃I-fælden opvarmes til 90 °c med en strøm af helium (20 ml · min^-1) via V24. Hermed, mulige biprodukter fjernes og derefter V16 er lukket.
   3. Bekræft, at [¹¹C] ch₃i er klar til at blive frigivet til reaktoren.
   4. Overvåg følgende automatiserede proces: Kontroller, om [¹¹c] ch₃i-fælden opvarmes til 190 °c, og at den dannede [¹¹c] LM₃i frigives i reaktoren via [¹¹c] ch₃OTF Trap (v32 og V33, stadig ved 200 ° C), v7 og V8 under en kontinuerlig helium strøm (10-25 mL · min^-1, V24). Under denne proces skal V21 og v23 (udstødnings udgang) være åbne.
   5. Bekræft, at radioaktiviteten ankom i reaktoren, når mængden af radioaktivitet i reaktoren ikke hæve længere.
   6. Overvågning af følgende automatiserede proces og forberedelse til manuel indgriben, hvis det er nødvendigt
      1. Kontrollér, om v23, V21 og V8 lukkes automatisk, og at reaktionsblandingen opvarmes til 75 °C. Efter 3 min, observere, hvis reaktoren afkøles med flydende nitrogen, indtil temperaturen er under 35 °C. Derefter skal du sørge for, at reaktionsblandingen slukkes med 1,5 mL vand via v2. Under denne proces skal V21 og v23 (udstødnings udgang) være åbne.
      2. Spor, hvis V21 og v23 lukkes, og reaktionsblandingen overføres til HPLC-Indsprøjtnings ventilen ved at passere gennem en væske detektor ind i HPLC-sløjfen (5 mL). Spor, hvis reaktionsblandingen injiceres automatisk på HPLC-søjlen.
   7. Overhold kromatogrammet, og skær manuelt produktets spids ud via knap Pens spids start. Tryk på peak end , når produktets topsignal falder til under ca. 400 CPS efter en retentions tid på ca. 8-10 min (flow: 5 ml · min^-1, figur 3).
   8. Tænd en ekstra helium strøm for at accelerere pæren tømning.
   9. Overvåg, om pæren er tømt og overhold affaldsflasken: Kontroller, om pæren tømmes via v11, spe-patronen og V12 i affaldet med en helium strøm via v19 og en ekstra helium linje, og hvis produktet beholder på spe-patronen.
   10. Bekræft, at pæren er helt tom.
   11. Overvågning af den automatiserede proces med SPE-rensning og Produktoverførsel
       1. Kontrollér, om SPE-patronen vaskes med 10 mL vand via V6, v11 og V12 i affaldet, og om ethanol elutter produktet i PCV via V5, v11 og V12. Endelig skal du observere, om 0,9% NaCl tilsættes til PCV via v4, v11 og V12 for at fortynde produktet.
       2. Sørg for, at produkt opløsningen overføres via v13 og et sterilt filter i hætteglasset med slutproduktet med en helium strøm via V20.
   12. Bekræft, at produktet er blevet fuldstændig overført.

3. kvalitetskontrol (QC)

Bemærk: kvalitetskontrollen af radioaktive lægemidler omfatter måling af følgende parametre:

• Radiokemisk renhed og molær aktivitet (RP-HPLC)
• Rest opløsningsmidler (gaskromatografi, GC)
• Osmolalitet (damptryk osmometer)
• pH-værdi (pH-meter)
• γ spektrum/radionukleid renhed (γ-spektrometer)
• Halveringstid/radionukleid renhed (dosis kalibrator)

Alle fysisk-kemiske parametre bestemmes inden frigivelsen af produktet, og værdierne skal være i det definerede kvalitetsparameter område.

1. Klargøring af kvalitetskontrol udstyret
   1. Start præparatet 30 min før slutningen af syntesen.
   2. Forbered et konisk hætteglas i en blyafskærmet beholder og en afskærmet 1 mL sprøjte med påsat nål.
   3. Forbered en referencestandard opløsning af SNAP-7941 (10 μg · mL^-1) i vand til HPLC.
   4. Tænd for pH-måleren, gaskromatografen og de anvendte gasser, osmometer og alle komponenter i HPLC.
   5. Tænd for HPLC-styringssoftwaren, og vælg den dedikerede kolonne og den respektive metode til [¹¹C] SNAP-7941 (mobil fase: (vand/eddikesyre 97,5/2,5 v/v; 2,5 g. L^-1 ammonium acetat; pH 3.5)/acetonitril 70/30 v/v; flow: 1 ml · min ^-1) og skrive en prøve liste med to målinger (standard og produkt). Start metoden til konditionering af kolonnen.
   6. Injicer 20 μL af SNAP-7941-referenceopløsningen med en Hamilton-sprøjte efter 10 minutters konditionering, og start analysen.
   7. Vask Hamilton-sprøjten to gange med acetonitril og vand efter injektion.
   8. Start GC-styringssoftwaren, og skriv eksempel listen.
2. Udførelse af kvalitetskontrol
   1. Måle det absolutte radioaktive udbytte af produktet efter afslutningen af syntesen og overføre 100 μL af produktet til et reaktionshætteglas med den forberedte blyafskærmede sprøjte til kvalitetskontrol.
      Bemærk: alle data, der indhentes fra kvalitetskontrollen, skal dokumenteres i overensstemmelse med de nationale regler.
   2. Analytisk HPLC: mål den radiokemiske renhed og kemisk renhed, og Informer straks den ansvarlige person for cellekultur forsøgene.
      1. Tegn 40 μL af QC-prøven, og Injicer til HPLC. Start kørslen ved at flytte armen af Indsprøjtnings ventilen fra belastning til injektion (figur 3).
         Bemærk: under kørslen (8 min), kan andre målinger af protokollen udføres for at undgå så meget forfald som muligt.
      2. Åbn kromatogrammet, og Integrer alle toppe i radioaktivitets kanalen. Sammenlign Opbevaringstiden for produktet (5,0-7,0 min) med Opbevaringstiden for reference standarden. Sammenlign arealet under kurven i procent af alle integrerede toppe. Produktets højdepunkt skal være mere end 95% (radiokemisk renhed) af de samlede integrerede områder (radiokanal).
      3. Integrer signalet i UV-kanalen for at bestemme kemisk renhed. Den vigtigste urenhed er normalt forløberen SNAP syre på 2,8-3,5 min. Koncentrationen af [^natC] SNAP-7941 beregnes ud fra kalibreringskurven efter integrationen. Beregn koncentrationen af SNAP-7941 i μmol · mL^-1 , og bestem molær aktiviteten ved hjælp af følgende ligning:
         
   3. Til gaskromatografi overføres 20 μL af kvalitetskontrol prøven i et dedikeret hætteglas. Placer den i Autosampler, og Start målingen. Når målingen er færdig, åbnes kromatogrammet og nedskrives antallet af automatisk integrerede toppe. Prøven må ikke indeholde mere end 410 ppm acetonitril og 10% ethanol.
   4. Osmolalitet: sæt en papir prøve skive på den dedikerede hule og Påfør 10 μL af prøven. Tryk på knappen Close (Luk ) for at måle osmolaliteten. Efter 3 min, enheden viser osmolalitet, der skal være i en række 190-500 mosm · kg^-1.
   5. pH: vask elektroden med vand. PH måles ved at sætte elektroden i prøven. PH-værdien skal være i et interval på 5,0-8,5. Elektroden igen vaskes efter måling og Placer elektroden i reference-pH-opløsningen.
   6. γ-spektrum: sæt QC-prøven i γ-spektrometer, Åbn den kontrollerende software og Start målingen. Stop målingen og Nedskriv den målte energi, der skal være 511 keV (interval 420-520 keV). Åbn menuen filer og sikre filen med det respektive batchnummer. Recall det gemte spektrum i den dedikerede software og udskrive spektret.
   7. Half-Life: mål aktiviteten af QC prøve to gange ved hjælp af dosis kalibrator. Nedskrive de respektive tider og beregne halveringstiden for eksponentiel.
3. Frigivelse
   1. Når alle parametre er afprøvet, og resultaterne er i overensstemmelse med de østrigske myndigheders retningslinjer, skal radio traceren frigives. Operatøren skal underskrive rigtigheden af dataene.

4. evaluering af vekselvirkninger mod P-GP-transporter

1. Cellekultur
   1. Start den laminerede luftstrøm (LAF) på arbejdsbænken, og rengør bænken mindst 15 minutter, før du begynder at arbejde.
   2. Bland cellekultur mediet under sterile forhold i LAF med 10% af FCS (50 mL) og 0,5% af antibiotika (2,5 mL) med en steril volumetrisk pipette ved hjælp af en automatiseret pipette Rings støtte.
   3. Tø MDCKII-hMDR1 og MDCKII-WT celler og dyrke i en T75 eller T175 cellekultur kolbe 10-14 dage forud for forsøg under aseptiske forhold (LAF).
   4. Skift mediet den næste dag for at fjerne alle ikke-vedlige og apoptotiske celler.
   5. Hver tredje dag udskiftes mediet med et nyt (12 mL for henholdsvis T75 og 23 mL for den T175 celle dyrknings kolbe).
   6. Opdel cellerne i henhold til tidsplanen for eksperimenter til friske kolber eller til cellekultur retter ved en sammenløbet på 80% for at undgå, at der vokser en tolags.
2. Celle forberedelse til eksperimenter
   1. Cellerne opdeles to dage før eksperimenter og frø i en koncentration på 2,5 x 10⁵ celler pr. 2 ml i et skråtstillet plan af en cellekultur skål (figur 4). Brug en automatisk Cell Counter enhed eller en Neubauer tælle kammer til at tælle cellerne og beregne den passende opdeling ratio.
   2. Fjern mediet en dag før eksperimenter, vask cellerne på dyrknings skålen med 4 mL DPBS og tilsæt friske 5 mL cellekulturmedium. Placer skålen vandret i inkubator.
   3. Cellerne vaskes med DPBS mindst 0,5 h før eksperimenter og udskiftes med 2 mL FBS Free medium. Undersøg sammenløbet og cellens morfologi med et mikroskop.
3. Udførelse af eksperimenter i tre forskellige opsætninger.
   1. Brug Petri skålen til de eksperimenter, der er beskrevet i 4.2.3.
   2. Cellerne behandles i 0,5 h før eksperimenter med 10 μM (±)-verapamilhydrochlorid.
   3. Tilsæt 0,98 μL verapamil stamopløsning (20,4 mM (±)-verapamil hydrochlorid i DMSO). Endelige DMSO-indhold er ≤ 0,05% under behandlingen.
   4. Cellerne inkubates i 0,5 h med køretøjets kontrol (DMSO). Brug den samme mængde, som anvendes til behandling af lægemidlet.
4. Eksperimenter af real-time assay (for alle tre opsætninger)
   1. Tænd enheden, computeren, og sørg for, at de er korrekt tilsluttet, og Åbn derefter kontrol softwaren.
   2. Vælg indstillingen én destination , lås skabelonen op, og Juster følgende indstilling:
      Antal stillinger: 2 (to)
      Detekterings tidspunkt (sek.): 3 (tre)
      Detekterings forsinkelses tidspunkt (-er): 2 (to)
      Navn på første fase: oprindelig plan
   3. Indsæt cellekultur skålen i den skrå støtte af enheden, og sørg for, at celle stangen er på den nederste side og dækket med cellekulturmedium.
   4. Start knappen Kør via Start . Systemet beder om at gemme filen. Vælg et filnavn og en gemme kurve. Kontrolcenteret dukker op, og den oprindelige måling begynder (understøttelse af cellekultur skålen begynder at rotere).
   5. Vælg under andre indstillinger:
      Tidsskala: minutter
      Nuclide-korrektion: Carbon-11
   6. Kontroller alle boksene under kurver i graf (baggrund (rød), mål (blå) og mål minus baggrund (sort)).
   7. Opnå kvalitetskontrol parametre: molær aktivitet [GBq. μmol^-1] og aktivitetskoncentration [MBq.ml^-1] ved slutningen af syntesen.
   8. Den respektive spor volumen beregnes for 15 nM af [^natC] SNAP-7941 i analyse volumenet på 2 ml.
      
      
   9. Klargør pipetten til det respektive volumen og en alikvot af [¹¹C] SNAP-7941-produktet i en blyafskærmning.
   10. Klik på Afbryd kørsel i vinduet kontrolcenter. Vent, indtil parabol rotationen stopper, og sidebjælken med titlen afbrudt og næste fase opstår.
   11. Åbn låget på den kinetiske enhed i realtid. Drej kultur skålen understøtter 90 ° til venstre. Tilføj den beregnede volumen af Tracer og drej tilbage til den oprindelige position. Luk derefter låget på enheden. Tryk straks på knappen Fortsæt for at starte eksperimentet.
   12. Afslut eksperimentet efter 20 minutter ved at vælge pause og derefter afslutte kørslen (tryk på end Run i sidebjælken).
5. Data analyse og-behandling ved hjælp af en statistisk software
   1. Åbn softwaren til realtidskontrol. Klik på åbne filer for at huske den nødvendige kinetik. Kinetikken illustreres i kontrolcenter vinduet.
   2. Vælg ved at højreklikke direkte på kinetik eksport kurver. Gem den tekstfil, der indeholder de rå data. Åbn statistik programmet, og Indsæt RAW-datafilen i eksperimenter i realtid.
   3. Start med tiden (x-aksen) ved tilsætning af radiotracer (udelukke baggrunds måling) og normalisere til procent signal af de maksimale CPS (tæller per sekund).
   4. Indlæs alle normaliserede data til en ny GraphPad Prism-fil.
   5. Beregn middelværdier og standardafvigelse.
   6. Illustrer de opnåede data som graf, der viser afvigelsen (stigningstakten) for optagelsen af sporingen af alle tre opsætninger.

Representative Results

Den fuldt automatiserede radio syntese af [¹¹c] SNAP-7941 gav 5,7 ± 2,5 gbq (4,6 ± 2,0% ved eob, 14,9 ± 5,9% baseret på [¹¹c] ch₃OTF; n = 10) af formuleret produkt. Den samlede syntese varede omkring 40 min, hvor 15 min var påkrævet til fremstilling af [¹¹C] ch₃OTF via gasfasen metode, yderligere 5 min var nødvendige for radioaktiv mærkning af forløberen, efterfulgt af 10 min semi-preparative RP-HPLC rensning og 10 min for C18 cylinderampul solid fase ekstraktion og formulering. Derefter blev der leveret en lille alikvot (ca. 100-200 μL) til den person, der var ansvarlig for kvalitetskontrollen, hvorimod det originale hætteglas med brugsklar Tracer blev videregivet til eksperimententer af den kinetiske analyse i realtid.

Kvalitetskontrol blev afsluttet inden for 10 minutter efter afslutningen af syntesen. Molær aktiviteten lå i en rækkevidde på 72 ± 41 GBq/μmol (n = 10), og den radiokemiske renhed var altid > 95%. Alle andre parametre (pH, osmolalitet, rest opløsningsmidler) opfyldte frigivelseskriterierne. For realtids kinetisk analyse blev der valgt tre forskellige eksperimentelle opsætninger: (A) behandlede og ikke-behandlede (køretøjer) MDCKII-WT-celler, (B) ikke-behandlede eller behandlet med køretøjets MDCKII-hMDR1-celler og (C) den sidste cellelinje med blokering før realtid kinetisk analyse af transportøren ved hjælp af (±)-verapamil. Anvendelse af [¹¹C] snap-7941 til dværg Cell line mdckii-WT (p-GP ikke-ekspanderende) og mdckii-hMDR1 (p-GP udtrykker) viser en anden kinetisk adfærd, da der er en hurtig akkumulering til dværg celle linjen, hvorimod ingen akkumulering blev observeret for MDCKII-hMDR1-cellerne. Blokering af P-GP effluks transporter inmdckii-hMDR1 celler med (±)-verapamil førte imidlertid til en sammenlignelig realtids kinetisk som allerede set for dværg-celle linjen (figur 5).

Figur 1: oversigt over arbejdsforløbet. Arbejde-flow af radio syntese, kvalitetskontrol, og udførelse af real-time kinetiske måling af [¹¹C] snap-7941. De sorte pile indikerer transportmåden for radioaktiviteten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: den automatiserede synthesizers radio syntetiske skema. Koblings kredsløb for den automatiserede synthesizer, begyndende med cirkulations enheden for [¹¹c] ch₃I/[¹¹c] ch₃OTF produktion, reaktor til INDFØRING af aktiviteten i forstadiet opløsning og spe rensning (SPE = solid fase ekstraktion; PCV = hætteglas med produkt samling). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: repræsentative kromatogrammer af den fuldt automatiserede radio syntese af [¹¹C] snap-7841. Den semi-preparative RP-HPLC kromatogrammet er illustreret i toppen og analytisk en efter rensning på bunden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: forberedelse af cellekultur parabol til real-time eksperimenter. Trin 1 omfatter såning af 2,5 x 10⁵ op til 1 x 10⁶ afhængigt af celletype og deres vækstrate. Derefter anbringes dyrknings skålen i et skråplan (ca. 30-45 °). Derfor kan det medfølgende metal apparat eller låget på en cellekultur parabol anvendes i inkubator til at stabilisere den skrå position af skålen. Dagen efter (24 timer) skålen justeres vandret, og frisk cellekulturmedium tilsættes for helt at dække cellens overflade. På forsøgs dagen undersøges cellens levedygtighed og sammenløbet. Ifølge forsøgsprotokollen vaskes cellerne med DPBS, mediet erstattes af serumfrit medium (2 mL), og kultur skålen flyttes til en skrå position indtil starten af eksperimenter. Herefter kan cellerne behandles med inhibitor eller køretøj. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: kinetiske målinger i realtid af [¹¹C] SNAP-7941. Repræsentative realtids kinetik af [¹¹C] snap-7941 vises i tre forskellige opsætninger: brug af mdckii-WT-celler; MDCKII-hMDR1 celler præ-blokeret med (±)-verapamil som P-GP-hæmmer og MDCKII-hMDR1 celler uden blokering. Y-aksen illustrerer stigningstakten i de præ-blokerede MDCKII-hMDR1-og WT-celler sammenlignet med resultaterne af henholdsvis de ubehandlede eller køretøjs behandlede MDCKII-MDR1-celler (ingen optagelse, 0%). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Radio syntesen af [¹¹C] SNAP-7941 blev etableret på et kommercielt syntese modul. På grund af muligheden for fuldt ud at automatisere forberedelses proceduren, den røntgen syntese sikret at være pålidelige, og forbedringer med hensyn til strålingsbeskyttelse af operatøren blev opnået. Fremstillingen af synthesizeren har en enorm indvirkning på kvaliteten af radiotracer, især med hensyn til molær aktivitet. Det er derfor vigtigt konstant at arbejde under inaktive forhold (f. eks. helium atmosfære) og at skylle alle linjer, der er placeret før reaktionsbeholderen (mållinje, [¹¹C] ch₃I-produktionscyklussen og-reaktoren (Se figur 2)). Desuden opvarmning af de respektive fælder og ovne før starten af syntesen til at fjerne fugt og atmosfærisk kulstof øger molær aktivitet fordelagtigt. Især AgOTf kolonnen, imprægneret med grafitiseret kulstof, er ekstremt følsom over for fugt. Selv mindre mængder af enhver kilde til fugt forstyrre omdannelsen af [¹¹c] ch₃i til [¹¹c] ch₃OTF. Før syntesen påbegyndes, skal [¹¹c] co₂ -fælden og [¹¹c] LM₃i-fælden afkøles til stuetemperatur igen for at muliggøre efterfølgende diffusering. Desuden anbefales det at opløse forstadiet kort før start af syntesen og tilføje basen direkte i forstadiet opløsning.

Kvalitetskontrollen af Carbon-11 aktive skal være rationelt konstrueret til en kontinuerlig og hurtig arbejdsgang. Men de vigtigste parametre for cellekultur undersøgelser er radiokemisk renhed og molær aktivitet for at opnå gyldige resultater. Korrekt evaluering af molær aktiviteten kræver en robust analytisk HPLC-metode, og kalibreringskurven skal dække det færdige produkts koncentrationsområde. Den udfordrende del for aktive er at opnå en koncentration over kvantificeringsgrænsen (LOQ) på grund af små mængder, som produceres under radio syntese. Derfor er kunsten at finde balancen mellem høje molære aktiviteter for at undgå receptor mætning og høj nok koncentrationer til stadig at kunne kvantificere det ikke-radioaktive signal.

[¹¹C] SNAP-7941 blev bekræftet at være et potent substrat af human P-GP-transporter, da der ikke blev observeret nogen akkumulering i de ubehandlede eller køretøjs behandlede MDCKII-hMDR1-celler på grund af Rapid efflux. I modsætning hertil leverede både eksperimentelle opsætninger (MDCKII-WT eller præ-blokerede MDCKII-hMDR1-celler) lignende resultater (akkumulering af [¹¹C] SNAP-7941), hvilket understøtter alsidigheden i denne in vitro-analyse. MDCKII-hMDR1 celler er meget velegnede til LigandTracer eksperimenter på grund af deres stabile transfection, hurtig vækst og vedholdende mod forskydnings stress forårsaget af den roterende cellekultur skål. Manglen på [¹¹C] snap-7941 optagelse i rotter og mus hjernen kan derfor opstå forårsaget af effluks gennem P-GP transporter. På grund af transfektering af hunde nyreceller med human multi drug resistens protein 1 (hmdr-1, P-GP), den forudsigende værdi af denne metode for effluks transporter binding i mennesker er høj, hvilket er gunstigt i form af en fremtidig klinisk anvendelse. Indtil videre er selektiviteten mod andre effluks-transporter imidlertid ikke blevet verificeret. Derfor kan andre cellelinjer anvendes, der udtrykker forskellige prominente effluks transportører som brystkræft resistens protein (bcrp) eller multiple resistens protein-1 (MRP-1), at studere interaktioner mod disse transportører. Metoden er i forhold til klassiske ophobning eller transport assays meget enkel og giver straks kvalitative resultater. Desuden er den største fordel, at denne teknologi muliggør evaluering af direkte interaktion mellem PET-Tracer og målet i realtid, i modsætning til det konventionelle eksperiment ved hjælp af indirekte kvantificering (for det meste forskydning). Desuden giver real-time radioassay software eksperimentel fleksibilitet (f. eks. nuklid henfalds korrektion, måling af tid og positioner osv.) og derfor høj frihed for brugerne. På den anden side, begrænsninger af metoden omfatter en lav prøve gennemløb, da kun én celle parabol kan måles ad gangen. Desuden bør der tages hensyn til et par andre tekniske og driftsmæssige spørgsmål: den beskrevne teknologi er meget følsom over for baggrundsstråling; strålings kilderne bør således holdes på afstand, og der bør lægges vægt på baggrunds målingen forud for forsøget. Et andet spørgsmål vedrørende eksperimenter ved højere temperaturer end stuetemperatur, er opvarmning af skrå støtte: fordampning af cellekulturmedium kan påvirke detektoren. I stedet for opvarmning, hele enheden er fortrinsvis placeret i inkubator. Desuden er metoden begrænset til vedlige cellelinjer. Gennem rotation af cellekulturen parabol, shear stress følsomme celler kan løsne sig fra skålen, hvilket kan føre til ugyldige resultater.

Ikke desto mindre, hvis eksperimententer er opmærksomme på disse mindre ulemper metoden leverer hurtige og pålidelige resultater for analysen af den kinetiske opførsel af prækliniske PET-Tracers.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)