Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [¹¹C]SNAP-7941

Summary

Qui, rappresentiamo un protocollo per la radioetichettatura completamente automatizzata di [¹¹C]SNAP-7941 e l'analisi della cinetica in tempo reale di questo PET-tracer su P-gp che esprime e non esprime.

Abstract

La tomografia a emissione di positroni (PET) è una tecnica essenziale di imaging molecolare che fornisce informazioni sui percorsi e utilizza specifici radioligandi mirati per le indagini in vivo. All'interno di questo protocollo, viene descritta una radiosintesi telecomandata robusta e affidabile di [¹¹C]SNAP-7941, un antagonista del recettore dell'ormone che concentra la melanina 1. La radiosintesi inizia con il ciclotrone prodotto [¹¹C]CO₂ che viene successivamente ulteriormente reagito attraverso una transizione gas-fase a [¹¹C]CH₃OTf. Quindi, questo intermedio reattivo viene introdotto alla soluzione precursore e forma il rispettivo radiotracer. La purezza chimica e radiochimica sono determinate da RP-HPLC, regolarmente implementati nel processo di controllo della qualità radiofarmaceutico. Inoltre, l'attività molare viene calcolata in quanto è una necessità per le seguenti indagini cinetiche in tempo reale. Inoltre, [¹¹C]SNAP-7941 viene applicato alle cellule MDCKII-WT e MDCKII-hMDR1 per valutare l'impatto dell'espressione P-glicoproteina (P-gp) sull'accumulo di cellule. Per questo motivo, il P-gp esprimente linea cellulare (MDCKII-hMDR1) viene utilizzato senza o con il blocco prima degli esperimenti per mezzo del substrato P-gp (-)-verapamil e i risultati vengono confrontati con quelli osservati per le cellule wildtype. L'approccio sperimentale generale dimostra l'importanza di una gestione precisa del tempo che è essenziale per ogni studio preclinico e clinico utilizzando traccianti PET radioetichettati con nuclidi di breve durata, come il carbonio-11 (emivita: 20 min).

Introduction

[¹¹C] SNAP-7941 si è evoluto come il primo tomografia a emissione di positroni (PET)-tracciante mirato al recettore dell'ormone concentrato di melanina 1 (MCHR1) - un recettore coinvolto principalmente nella regolazione centrale dell'appetito e dell'assunzione di cibo¹. L'etichettatura Carbon-11 di SNAP-7941, un antagonista MCHR1 ben caratterizzato, ha prodotto l'autentico PET-tracer^2,3,4,5. Tuttavia, la radiosintesi completamente automatizzata è molto impegnativa in termini di efficacia del tempo e riproducibilità con il radionuclide di breve durata carbon-11 che offre un'emivita di 20 min⁶. Il tempo complessivo di sintesi deve essere ridotto al minimo e, come regola generale, non deve superare le emivite 2-3 (cioè circa 40-60 min per il carbonio-11)⁷. In particolare, le procedure di sintesi per i radiotracciatori che prendono di mira i sistemi di recettori con densità a bassa espressione devono essere ampiamente ottimizzate per ottenere rese sufficienti e di conseguenza un'elevata attività molare⁸. La strategia sintetica segue spesso la produzione di radionuclidi all'interno di un ciclotrone e il rilascio di [¹¹C]CO₂ al sintetizzatore. Lì, [¹¹C]CO₂ viene prima ridotto a [¹¹C]CH₄ e successivamente ha reagito con iodio per produrre [¹¹C]CH₃I attraverso il metodo di fase^gas9,10. Ulteriore trattamento con rese triflate d'argento [¹¹C]CH₃OTf direttamente on-line. Successivamente, questo carbonio-11 reattivo etichettato come intermedio viene introdotto in una soluzione contenente la molecola precursore. Una radiosintesi automatizzata comporta inoltre un processo di purificazione con RP-HPLC semi-preparativo che include la successiva formulazione del prodotto adatto per studi preclinici e clinici.

Indipendentemente dall'emivita del radionuclide e dallo sforzo temporale della radiosintesi, la farmacocinetica di un radiofarmaceutico è la parte più critica da valutare durante lo sviluppo del PET-tracer. In termini di neuroimaging, l'ingresso cerebrale del PET-tracer è il prerequisito principale. Tuttavia, la barriera ematoencefalica (BBB), un "confine di sicurezza" del cervello, esprime altamente trasportatori di efflusso che possono scaricare piccole molecole (ad esempio, pet-traccianti) e ostacolarne in modo efficiente l'applicabilità.

Un enorme inconveniente durante la valutazione preclinica sono le interazioni inaspettate verso questi trasportatori di efflusso, che spesso non sono riconosciuti negli esperimenti in vitro e che portano al fallimento del PET-tracer in vivo, come osservato per [¹¹C]SNAP-7941. L'imaging di sPET nei ratti ha dimostrato un basso accumulo cerebrale, che è aumentato drammaticamente dopo la somministrazione dell'inibitore P-gp tariquidar¹¹. Questi dati hanno suggerito che^[11C]SNAP-7941 è un substrato di questo sistema trasportatore efflux che impedisce il legame dei ligandi al centro MCHR1. Purtroppo, mancano ancora modelli in vitro adeguati che consentano di prevedere la penetrazione di BBB in una fase iniziale dello sviluppo del tracciante.

Qui, descriviamo la sintesi automatica di [¹¹C]SNAP-7941 utilizzando un sintetizzatore per metilazioni di carbonio-11. L'enfasi di questo lavoro è quella di dare una panoramica su come organizzare un approccio sperimentale consecutivo che comprenda la sintesi automatizzata, il controllo di qualità e la successiva valutazione in vitro con il nuclide carbon-11 di breve durata.

In primo luogo, vengono descritti i passi chiave per una radiosintesi di successo con un dispendio di tempo minimo e una resa massima. Quindi, viene istituita una procedura di controllo di qualità affidabile che rende il radiotracciatore disponibile per potenziali studi clinici e soddisfa i criteri della Farmacola europea¹². La quantificazione della concentrazione molare e il calcolo della rispettiva attività molare è un requisito essenziale per le successive misurazioni cinetiche.

Infine, viene presentato un nuovo e diretto metodo in vitro che valuta le interazioni di [¹¹C]SNAP-7941 verso il trasportatore efflux, P-gp (hMDR1). Il modello cinetico proposto utilizza un dispositivo facile da gestire che consente un'interpretazione immediata dei dati e richiede uno sforzo minimo di coltura cellulare¹³.

Protocol

AVVISO: Nel protocollo seguente sono coinvolti più passaggi che richiedono la gestione e la manipolazione della radioattività. È importante che ogni passo sia in accordo con il Dipartimento per la sicurezza delle radiazioni dell'istituto e con il rispettivo legislatore nazionale. È obbligatorio ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti per gli operatori coinvolti secondo il principio ALARA ("As Low As Reasonably Achievable").

1. Gestione del tempo e pianificazione dell'esperimento

NOTA: la breve emivita del carbonio-11 richiede una gestione accurata del tempo per ridurre al minimo la perdita di radioattività (Figura 1). È importante che ogni persona coinvolta conosca la propria area di responsabilità e il punto temporale della rispettiva azione. Per l'impostazione di un esperimento cinetico in tempo reale di [¹¹C]SNAP-7941, circa quattro persone sono necessarie per un processo regolare.

1. Organizzare un produttore per [¹¹C]SNAP-7941.
2. Informare l'operatore di controllo qualità eseguendo la valutazione delle specifiche, il calcolo della concentrazione di massa e l'attività molare dell'ora di inizio della sintesi.
3. Tieni lo sperimentatore cinetico in tempo reale pronto per il calcolo della diluizione e l'esecuzione dell'esperimento.
4. Indicare al corridore il trasferimento della radioattività nel rispettivo luogo al rispettivo punto temporale.

2. Sintesi automatica di [¹¹C]SNAP-7941 per uso preclinico

1. Preparazione del sintetizzatore (Figura 2).
   1. Accendere il sintetizzatore, i gas tecnici necessari (elio e idrogeno) e il software di controllo del sintetizzatore Tracerlab. Selezionare lo snapdella sequenza di sintesi rispettiva.
   2. Lavare V1-V3 una volta con acqua e due volte con acetone tramite il reattore e la valvola HPLC al carico o iniettare la posizione nella bottiglia di rifiuti loop.
   3. Asciugare tutte le linee associate all'esterno e all'esterno del reattore tramite la valvola di iniezione con un flusso continuo di elio attivato tramite V18.
   4. Riscaldare la trap [¹¹C]CH₃i e la trappola [¹¹C]CH₃OTf sotto un flusso di elio di 100 mL-min^-1 fino a 200 c attraverso V24, V25, V29, V15, V9, V17 e V32/V33 con reattore staccato.
   5. Controllare la stessa via per le perdite (con reattore collegato) con un flusso di elio di 100 ml^-1. La tenuta è garantita quando il flusso scende al di sotto di 4 ml-min^-1.
   6. Accendere la pompa HPLC (5-10 mL^-1) e lavare le linee HPLC e la valvola di iniezione con acetonitrile/acqua (50/50, v/v) e le linee HPLC con il solvente HPLC via V14 nella lampadina.
   7. Svuotare la lampadina tramite V11 e V12 nella bottiglia di scarto con un flusso di elio via V19. Lavare nuovamente le rispettive linee con acqua del V6 via V11 e V12 con un flusso di elio via V18.
   8. Lavare V5 con etanolo e V4 con acqua tramite V11 e V12 nella fiala della collezione di prodotti (PCV) utilizzando un flusso di elio via V18, quindi svuotare il PCV via V13 nella bottiglia di scarto con un flusso di elio via V20.
   9. Spegnere la pompa HPLC, passare al solvente per la sintesi ((acetato di ammonio acquoso (2,5 g L^-1)/acido acetico 97,5/2,5 v/v; pH 3.5)/acetonitrile 75/25 v/v), collegare la colonna HPLC semi-preparativa e l'equilibrate della colonna (flusso di 5 mL^-1).
   10. Riempire i reagenti per la sintesi e la purificazione: 1,5 mL di acqua (V2), 4,5 mL di 0,9% NaCl (V4), 0,5 mL di 96% etanolo (V5), 10 mL di acqua (V6) e 90 mL di acqua (bulbo).
   11. Attaccare una nuova fiala di scarto loop; una fiala di prodotto (etichettata e dotata di ago ad aerazione) a V13 e all'azoto liquido.
   12. Precondizionare una cartuccia SPE (estrazione di fase solida) con 10 mL del 96% e 20 mL di acqua e attaccarla tra V11 e V12.
   13. Avviare la sequenza pre-corsa 20 min prima di iniziare la sintesi, consistente nel riscaldare la trappola [¹¹C]CO₂ a 400 gradi centigradi e svuotare la trappola con un flusso di elio di 50 mL-min^-1via V27 (2 min). Quindi, pre-flush la trappola [¹¹C]CO₂ per 3 min con gas di idrogeno (120 mL^-1)e infine raffreddare fino a sotto i 40 gradi centigradi.
   14. Sciogliere 1 mg di precursore in 400 o L di acetonitrile (per la sintesi del DNA, < 10 H₂O), trasferire la soluzione alla reazione e aggiungere 5,5 L di TBAH (264 mg-mL^-1 nel metanolo). Attaccare il reattore alla rispettiva posizione.
   15. Chiudere la cella calda e attivare la sotto pressione della cella calda.
   16. Confermare l'inizio del processo di raffreddamento della trappola CH₄ con azoto liquido a -75 gradi centigradi.
   17. Rilasciare la radioattività quando viene raggiunta la temperatura.
2. Produzione di ciclotroni di^[11C]CO₂
   NOTA: i passaggi 2.2.1-2.2.4 vengono eseguiti simultaneamente alla preparazione del modulo di radiosintesi (vedere anche Figura 1).
   1. Accendere il magnete del ciclotrone.
   2. Selezionare il bersaglio ¹¹C-CO₂ e avviare il fascio 65 .
   3. Confermare l'inizio dell'irradiazione premendo il pulsante Avvia irradiazione
   4. Fermare il fascio e confermare il rilascio di radioattività nel sintetizzatore premendo il pulsante Consegna, dopo aver raggiunto la quantità desiderata di radioattività (circa 120 GBq dopo 30 min).
3. Esecuzione della radiosintesi completamente automatizzata
   1. Verificare che il sistema sia pronto a ricevere la radioattività e avviare il processo automatizzato
   2. Monitoraggio del seguente processo automatizzato.
      1. Controllare se [¹¹C]CO₂ viene trasferito automaticamente dal ciclotrone nell'unità di sintesi tramite V26 (circa 4 min) e che il [¹¹C]CO₂ è intrappolato sul setaccio molecolare impastato di nichel come catalizzatore ([ ^{11 Del} sistema di C]CO₂ trappola) a temperatura ambiente.
      2. Tracciare se l'intrappolamento [¹¹C]CO₂ viene lavato automaticamente prima con l'elio (50 mL^{-min -1}) e quindi con il gas di idrogeno (120 mL^-1). Quindi, osservare che V27 e V25 sono chiusi e il vifatto [¹¹C]CO₂ compreso il gas idrogeno viene riscaldato a 400 s C e che la formazione [¹¹C]CH₄ viene ulteriormente trasportata al pre-raffreddato [¹¹C]CH₄ trappola e intrappolato lì.
      3. Monitorare che V10 è chiuso, V9 aperto (verso la colonna di iodio) e [¹¹C]CH₄ viene nuovamente rilasciato riscaldando la trappola [¹¹C]CH₄ lentamente a 80 s e trasportato nell'unità di circolazione con un flusso di elio via V10 (uscita di scarico). E controllare ulteriormente se [¹¹C]CH₄ viene convertito in [¹¹C]CH₃I all'interno dell'unità di circolazione, che dura per circa 3 min e la forma [¹¹C]CH₃I è continuamente intrappolato sul [¹¹C] CH₃I trappola.
      4. Assicurarsi che la valvola di scarico V16 sia aperta e che la trappola [¹¹C]CH₃I sia riscaldata a 90 gradi con un flusso di elio (20 mL^-1)tramite V24. Con questo, i sottoprodotti possibili vengono rimossi e quindi V16 viene chiuso.
   3. Confermate che il [¹¹C]CH₃I è pronto per essere rilasciato nel reattore.
   4. Monitorare il seguente processo automatizzato: Controllare se la trappola [¹¹C]CH₃I è riscaldata a 190 c e la formata [¹¹C]CH₃I viene rilasciata nel reattore tramite la trappola [¹¹C]CH₃OTf (V32 e V33, ancora a 200 C), V7 e V8 sotto un flusso di elio continuo (10-25 mL^{-min -1}, V24). Durante questo processo, V21 e V23 (uscita di scarico) devono essere aperti.
   5. Confermate che la radioattività è arrivata nel reattore, una volta che la quantità di radioattività nel reattore non aumenta più.
   6. Monitoraggio del seguente processo automatizzato e preparazione per l'intervento manuale, se necessario
      1. Controllare se V23, V21 e V8 vengono chiusi automaticamente e la miscela di reazione viene riscaldata a 75 gradi centigradi. Dopo 3 min, osservare se il reattore viene raffreddato con azoto liquido fino a quando la temperatura è al di sotto dei 35 gradi centigradi. Successivamente, assicurarsi che la miscela di reazione venga spenta con 1,5 mL di acqua tramite V2. Durante questo processo, V21 e V23 (uscita di scarico) devono essere aperti.
      2. Tracciare se V21 e V23 sono chiusi e la miscela di reazione viene trasferita alla valvola di iniezione HPLC passando attraverso un rilevatore di fluidi nel circuito HPLC (5 mL). Tracciare se la miscela di reazione viene iniettata automaticamente sulla colonna HPLC.
   7. Osservare il cromatogramma e tagliare manualmente il picco del prodotto tramite il pulsante Picco inizio. Premere Peak end quando il segnale di picco del prodotto scende al di sotto di circa 400 cps dopo un tempo di ritenzione di circa 8-10 min (flusso: 5 mL^-1, Figura 3).
   8. Accendere un flusso di elio aggiuntivo per accelerare lo svuotamento della lampadina.
   9. Monitorare se la lampadina si sta svuotando e osservare la bottiglia di scarto: Controllare se la lampadina viene svuotata tramite V11, la cartuccia SPE e V12 nei rifiuti con un flusso di elio tramite V19 e una linea di elio aggiuntiva e se il prodotto viene trattenuto sulla cartuccia SPE.
   10. Verificare che la lampadina sia completamente vuota.
   11. Monitoraggio del processo automatizzato di purificazione e trasferimento dei prodotti SPE
       1. Controllare se la cartuccia SPE viene lavata con 10 mL di acqua tramite V6, V11 e V12 nei rifiuti e se l'etanolo eluisce il prodotto nel PCV tramite V5, V11 e V12. Infine, osservare se 0.9% NaCl viene aggiunto nel PCV tramite V4, V11 e V12 per diluire il prodotto.
       2. Assicurarsi che la soluzione del prodotto venga trasferita tramite V13 e un filtro sterile nella fiala del prodotto finale con un flusso di elio tramite V20.
   12. Verificare che il prodotto sia stato completamente trasferito.

3. Controllo qualità (QC)

NOTA: il controllo qualità dei prodotti radiofarmaceutici comprende la misurazione dei seguenti parametri:

• Purezza radiochimica e attività molare (RP-HPLC)
• Solventi residui (cromatografia a gas, GC)
• Osmolalità (osmometro a pressione del vapore)
• pH (pH-metro)
• z spettro/radionuclide (z-spettrometro)
• Purezza di mezza età/radionuclide (calibratore della dose)

Tutti i parametri fisico-chimici sono determinati prima del rilascio del prodotto e i valori devono essere compresi nell'intervallo di parametri di qualità definito.

1. Preparazione delle apparecchiature di controllo qualità
   1. Iniziare la preparazione 30 min prima della fine della sintesi.
   2. Preparare una fiala conica in un contenitore schermato di piombo e una siringa schermata da 1 mL con un ago attaccato.
   3. Preparare in acqua una soluzione standard di riferimento di SNAP-7941 (10 g-mL^-1)per l'HPLC.
   4. Accendere il misuratore di pH, il cromatografo a gas e i gas usati, l'osmometro e tutti i componenti dell'HPLC.
   5. Accendere il software di controllo HPLC e selezionare la colonna dedicata e il rispettivo metodo per [¹¹C]SNAP-7941 (fase mobile: (acqua/acido acetico 97.5/ 2.5 v/v; 2.5 g.L^-1 acetato di ammonio; pH 3.5)/acetonitrile 70/30 v/v; flusso: 1 mL-min ^-1) e scrivere un elenco di esempi con due misure (standard e prodotto). Avviare il metodo per il condizionamento della colonna.
   6. Iniettare 20 l della soluzione di riferimento SNAP-7941 con una siringa Hamilton dopo 10 min di condizionamento e avviare l'analisi.
   7. Lavare la siringa Hamilton due volte con acetonitrile e acqua dopo l'iniezione.
   8. Avviare il software di controllo GC e scrivere l'elenco di esempio.
2. Esecuzione del controllo qualità
   1. Misurare la resa radioattiva assoluta del prodotto dopo la fine della sintesi e trasferire 100 l del prodotto in una fiala di reazione con la siringa schermata dal piombo preparata per il controllo della qualità.
      NOTA: Tutti i dati ottenuti dal controllo qualità devono essere documentati in conformità con le normative nazionali.
   2. HPLC analitico: Misurare la purezza radiochimica e la purezza chimica e informare immediatamente la persona incaricata degli esperimenti di coltura cellulare immediatamente dei risultati.
      1. Disegnare 40 - L del campione QC e iniettare all'HPLC. Avviare la corsa spostando il braccio della valvola di iniezione da Carico a Inietta (Figura 3).
         NOTA: Durante l'esecuzione (8 min), è possibile eseguire altre misurazioni del protocollo per evitare il maggior decadimento possibile.
      2. Aprire il cromatogramma e integrare tutti i picchi nel canale di radioattività. Confrontare il tempo di conservazione del prodotto (5.0-7.0 min) con il tempo di conservazione dello standard di riferimento. Confrontare l'area sotto la curva in percentuale di tutti i picchi integrati. Il picco del prodotto deve essere superiore al 95% (purezza radiochimica) delle aree integrate totali (canale radio).
      3. Integrare il segnale nel canale UV per determinare la purezza chimica. L'impurità principale è di solito l'acido SNAP precursore a 2,8-3,5 min. La concentrazionedi [nat C]SNAP-7941 viene calcolata dalla curva di calibrazione dopo l'integrazione. Calcolare la concentrazione di SNAP-7941 in mol-mL^-1 e determinare l'attività molare mediante la seguente equazione:
         
   3. Per la cromatografia a gas, trasferire 20 - L del campione di controllo di qualità in una fiala di vetro dedicata. Posizionarlo nell'autocampionatore e avviare la misurazione. Al termine della misurazione, aprire il cromatogramma e annotare il numero di picchi integrati automaticamente. Il campione non deve contenere più di 410 ppm acetonitrile e 10% di etanolo.
   4. Osmolalità: Mettere un disco campione di carta sulla cavità dedicata e applicare 10 l del campione. Premere il pulsante Chiudi per misurare l'osmolalità. Dopo 3 min, il dispositivo visualizza l'osmolalità che deve essere in una gamma di 190-500 mosm-kg^-1.
   5. pH: Lavare l'elettrodo con acqua. Misurare il pH mettendo l'elettrodo nel campione. Il pH deve essere compreso tra 5,0 e 8,5. Lavare nuovamente l'elettrodo dopo la misurazione e posizionarlo nella soluzione di pH di riferimento.
   6. z-spectrum: Mettere il campione QC nello spettrometro z, aprire il software di controllo e avviare la misurazione. Interrompere la misurazione e annotare l'energia misurata che deve essere 511 keV (gamma 420-520 keV). Aprire il menu dei file e consicuro il file con il rispettivo numero batch. Richiamare lo spettro salvato nel software dedicato e stampare lo spettro.
   7. Emivita: Misurare l'attività del campione QC due volte utilizzando il calibratore della dose. Annotare i rispettivi tempi e calcolare l'emivita dell'esponenziale.
3. liberare
   1. Dopo che tutti i parametri sono stati testati e i risultati sono conformi alle linee guida delle autorità austriache, rilasciare il radiotracciatore. L'operatore deve firmare la correttezza dei dati.

4. Valutazione delle interazioni verso il trasportatore P-gp

1. Cultura cellulare
   1. Avviare il flusso d'aria laminare (LAF) del banco di lavoro e pulire la panca almeno 15 min prima di iniziare a lavorare.
   2. Mescolare il mezzo di coltura cellulare in condizioni sterili nel LAF con il 10% di FCS (50 mL) e lo 0,5% degli antibiotici (2,5 mL) con una pipetta volumetrica sterile utilizzando un aiuto di pipettatura automatizzata.
   3. Scongelare le cellule MDCKII-hMDR1 e MDCKII-WT e coltivare in un fiaschetta di coltura cellulare T75 o T175 10-14 giorni prima di esperimenti in condizioni asettiche (LAF).
   4. Cambiare il mezzo il giorno successivo per rimuovere tutte le cellule non aderenti e apoptotiche.
   5. Sostituire ogni tre giorni il mezzo con uno fresco (12 mL per il T75 e 23 mL per il flacone di coltura cellulare T175, rispettivamente).
   6. Dividere le cellule secondo il calendario degli esperimenti a flaconi freschi o ai piatti di coltura cellulare su una confluenza dell'80% per evitare la coltivazione del bistrato.
2. Preparazione cellulare per esperimenti
   1. Dividere le cellule due giorni prima degli esperimenti e dei semi in una concentrazione di 2,5 x 10⁵ celle per 2 mL in un piano obliquo di un piatto di coltura cellulare (Figura 4). Utilizzare un dispositivo contatore cellulare automatico o una camera di conteggio Neubauer per contare le celle e calcolare il rapporto di divisione appropriato.
   2. Rimuovere il mezzo un giorno prima degli esperimenti, lavare le cellule sul piatto di coltura con 4 mL di DPBS e aggiungere nuovi 5 mL di mezzo di coltura cellulare. Collocare il piatto orizzontalmente nell'incubatrice.
   3. Lavare le cellule con DPBS almeno 0,5 h prima degli esperimenti e sostituirle con 2 mL di mezzo libero FBS. Esaminare la confluenza e la morfologia cellulare con un microscopio.
3. Esecuzione degli esperimenti in tre diverse configurazioni.
   1. Utilizzare il piatto Petri per gli esperimenti come descritto in 4.2.3.
   2. Trattare le cellule per 0,5 h prima di sperimentare con 10 clorguido di verapamil m - verapamil.
   3. Aggiungete in DMSO 0,98 di verapamil di benpamil di benpamil di benuniversale (20,4 mm) di idrocloruro di verapamil). Il contenuto DMSO finale è dello 0,05% durante il trattamento.
   4. Incubare le cellule per 0,5 h con il controllo del veicolo (DMSO). Utilizzare lo stesso volume utilizzato per il trattamento farmacologico.
4. Esperimenti del saggio in tempo reale (per tutte e tre le configurazioni)
   1. Accendere il dispositivo, il computer e assicurarsi che siano collegati correttamente, quindi aprire il software di controllo.
   2. Scegliere l'opzione Un target, sbloccare il modello e regolare l'impostazione seguente:
      Numero di posizioni: 2 (due)
      Tempo di rilevamento (sec): 3 (tre)
      Tempo di ritardo rilevamento (s): 2 (due)
      Nome della prima fase: linea di base
   3. Inserire la parabola di coltura cellulare nel supporto inclinato del dispositivo, assicurandosi che il polo della cella sia sul lato inferiore e coperto con il mezzo di coltura cellulare.
   4. Avviare la corsa tramite il pulsante Start. Il sistema sta chiedendo di salvare il file. Scegliere un nome file e un percorso di salvataggio. Il centro di controllo si apre e inizia la misurazione della linea di base (il supporto del piatto di coltura cellulare inizia a ruotare).
   5. Selezionare in Altre opzioni:
      Scala temporale: minuti
      Correzione del nuclide: carbonio-11
   6. Selezionare tutte le caselle in Curve nel grafico (sfondo), destinazione (blu) e destinazione meno sfondo (nero)).
   7. Ottenere i parametri di controllo della qualità: attività molare [GBq.-mol^-1] e concentrazione di attività [MBq.mL^-1] alla fine della sintesi.
   8. Calcolare il rispettivo volume di tracciante per 15 nM di [^natC]SNAP-7941 nel volume di analisi di 2 mL.
      
      
   9. Preparare la pipetta al rispettivo volume e un prodotto [¹¹C]SNAP-7941 in una schermatura di piombo.
   10. Fare clic su Sospendi esecuzione nella finestra del centro di controllo. Attendere che la rotazione del piatto si fermi e la barra laterale con il titolo In pausa e la fase successiva si verificano.
   11. Aprire il coperchio del dispositivo cinetico in tempo reale. Girare il supporto piatto di coltura di 90 gradi a sinistra. Aggiungere il volume calcolato del tracciante e tornare alla posizione iniziale. Quindi, chiudere il coperchio del dispositivo. Premere immediatamente il pulsante Continua per avviare l'esperimento.
   12. Terminare l'esperimento dopo 20 min selezionando pausa e successivamente terminare la corsa (premere Fine esecuzione nella barra laterale).
5. Analisi ed elaborazione dei dati mediante un software statistico
   1. Apri il software di controllo in tempo reale. Fare clic su Apri file per richiamare la cinetica richiesta. La cinetica è illustrata nella finestra del centro di controllo.
   2. Scegliere facendo clic con il pulsante destro del mouse direttamente sulla cinetica Esporta curve. Salvare il file di testo contenente i dati non elaborati. Aprire il programma di statistiche e incollare il file di dati non elaborati degli esperimenti in tempo reale.
   3. Iniziare con il tempo (asse x) all'aggiunta del radiotracer (escludere la misurazione dello sfondo) e normalizzare al segnale percentuale del CPS massimo (conteggi al secondo).
   4. Caricare tutti i dati normalizzati in un nuovo file GraphPad Prism.
   5. Calcolare i valori medi e la deviazione standard.
   6. Illustrare i dati ottenuti come grafico che mostra la deviazione (tasso di aumento) dell'assorbimento dei traccianti di tutti e tre i set up.

Representative Results

La radiosintesi completamente automatizzata di [¹¹C]SNAP-7941 ha prodotto 5,7 x 2,5 GBq (4,6 x 2,0% a EOB, 14,9 x 5,9% sulla base di [¹¹C]CH₃OTf; n - 10) del prodotto formulato. La sintesi complessiva è durata circa 40 min, dove sono stati necessari 15 min per la preparazione di [¹¹C]CH₃OTf attraverso il metodo della fase gassosa, altri 5 min sono stati necessari per la radioetichettatura del precursore, seguiti da 10 min di semi-preparativo Purificazione RP-HPLC e 10 min per l'estrazione e la formulazione della fase solida della cartuccia C18. Poi, una piccola aliquota (circa 100-200 l) è stata consegnata alla persona responsabile del controllo di qualità, mentre la fiala del prodotto originale contenente il tracciante pronto all'uso è stata passata allo sperimentatore dell'analisi cinetica in tempo reale.

Il controllo di qualità è stato completato entro 10 min dopo la fine della sintesi. L'attività molare era di 72 - 41 GBq/ smol (n - 10) e la purezza radiochimica era sempre > 95%. Tutti gli altri parametri (pH, osmolalità, solventi residui) soddisfacevano i criteri di rilascio. Per il saggio cinetico in tempo reale, sono state scelte tre diverse configurazioni sperimentali: (A) cellule MDCKII-WT trattate e non trattate (veicolo), (B) non trattate o trattate con celle MDCKII-hMDR1 del veicolo e (C) quest'ultima linea cellulare con blocco prima del tempo reale saggio cinetico del trasportatore utilizzando il ( ) -verapamil. L'applicazione di [¹¹C]SNAP-7941 alla linea cellulare wildtype MDCKII-WT (P-gp non-expressing) e MDCKII-hMDR1 (Espressione P-gp) mostra un comportamento cinetico diverso, in quanto vi è un rapido accumulo alla linea cellulare wildtype, mentre non è stato osservato alcun accumulo per le cellule MDCKII-hMDR1. Tuttavia, il blocco del trasportatore P-gp efflux nelle celle MDCKII-hMDR1 con il loro valore è stato registrato in tempo reale, come già osservato per la linea cellulare wildtype (Figura 5).

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro. Flusso di lavoro della radiosintesi, controllo qualità e prestazioni della misurazione cinetica in tempo reale di [¹¹C]SNAP-7941. Le frecce nere indicano la via di trasporto della radioattività. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Schema radiosintetico del sintetizzatore automatizzato. Circuito di commutazione del sintetizzatore automatizzato, a partire dall'unità di circolazione per [¹¹C]CH₃I/[¹¹C]CH₃OTf produzione, reattore per l'introduzione dell'attività nella soluzione precursore e la purificazione SPE (SPE estrazione di fase solida; PCV - fiala da collezione di prodotti). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: cromatogrammi rappresentativi della radiosintesi completamente automatizzata di [¹¹C]SNAP-7841. Il cromatogramma semi-preparativo RP-HPLC è illustrato nella parte superiore e quello analitico dopo la purificazione sul fondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Preparazione della parabola di coltura cellulare per esperimenti in tempo reale. Passo 1 include la semina di 2,5 x 10⁵ fino a 1 x 10⁶ a seconda del tipo di cellula e il loro tasso di crescita. Successivamente, il piatto di coltura viene posto in un piano obliquo (circa 30-45 gradi). Pertanto, l'apparato metallico fornito o il coperchio di un piatto di coltura cellulare può essere utilizzato nell'incubatrice per stabilizzare la posizione ollare del piatto. Il giorno dopo (24 h) il piatto viene regolato orizzontalmente e il mezzo di coltura delle cellule fresche viene aggiunto per coprire completamente la superficie cellulare. Il giorno dell'esperimento, vengono esaminate la vitalità e la confluenza delle cellule. Secondo il protocollo sperimentale, le cellule vengono lavate con DPBS, il mezzo viene sostituito da un mezzo senza siero (2 mL), e il piatto di coltura viene riposizionato in una posizione obliqui fino all'inizio degli esperimenti. D'ora in poi, le cellule possono essere trattate con l'inibitore o il veicolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Misurazioni cinetiche in tempo reale di [¹¹C]SNAP-7941. La cinetica rappresentativa in tempo reale di [¹¹C]SNAP-7941 è mostrata in tre diverse impostazioni: utilizzando le cellule MDCKII-WT; Cellule MDCKII-hMDR1 pre-bloccate con (o-verapamil come inibitore P-gp) e cellule MDCKII-hMDR1 senza blocco. L'asse y illustra il tasso di aumento delle celle MDCKII-hMDR1 e WT prebloccate rispetto ai risultati delle cellule MDCKII-MDR1 non trattate o trattate con il veicolo, rispettivamente (nessuna assorbimento, 0%). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La radiosintesi di [¹¹C]SNAP-7941 è stata stabilita su un modulo di sintesi commerciale. A causa della possibilità di automatizzare completamente la procedura di preparazione, la radiosintesi ha cercato di essere affidabile e sono stati raggiunti miglioramenti per quanto riguarda la protezione dalle radiazioni dell'operatore. La preparazione del sintetizzatore ha un enorme impatto sulla qualità del radiotracer, soprattutto in termini di attività molare. Pertanto, è essenziale lavorare costantemente in condizioni inerti (ad esempio, atmosfera di elio) e lavare tutte le linee posizionate prima della nave di reazione (linea bersaglio, [¹¹C]CH₃I ciclo di produzione e reattore (vedi Figura 2)). Inoltre, riscaldare le rispettive trappole e forni prima dell'inizio della sintesi per rimuovere l'umidità e il carbonio atmosferico aumenta l'attività molare in modo vantaggioso. Soprattutto la colonna AgOTf, impregnata di carbonio grafitizzato, è estremamente sensibile all'umidità. Anche piccole quantità di qualsiasi fonte di umidità disturbano la conversione di [¹¹C]CH₃I a [¹¹C]CH₃OTf. Prima di iniziare la sintesi, la trappola^[11C]CO₂ e la trappola [¹¹C]CH₃I devono essere raffreddate di nuovo a temperatura ambiente per consentire l'intrappolamento successivo. Inoltre, si raccomanda di sciogliere il precursore poco prima di iniziare la sintesi e di aggiungere la base direttamente nella soluzione precursore.

Il controllo di qualità per i radiotracciatori carbonio-11 deve essere progettato razionalmente per un flusso di lavoro continuo e veloce. Tuttavia, i parametri più importanti per gli studi di coltura cellulare sono la purezza radiochimica e l'attività molare per ottenere risultati validi. Una corretta valutazione dell'attività molare richiede un robusto metodo HPLC analitico e la curva di calibrazione deve coprire la gamma di concentrazione del prodotto finale. La parte difficile per i radiotracciatori è quella di ottenere una concentrazione superiore al limite di quantificazione (LOQ) a causa di piccole quantità, che vengono prodotte durante la radiosintesi. Quindi, l'arte è quella di trovare l'equilibrio tra attività molare elevate per evitare la saturazione del recettore e concentrazioni abbastanza elevate per essere ancora in grado di quantificare il segnale non radioattivo.

[¹¹C] SNAP-7941 è stato confermato essere un potente substrato del trasportatore umano P-gp, in quanto non è stato osservato alcun accumulo nelle cellule MDCKII-hMDR1 non trattate o trattate con il veicolo a causa del rapido efflusso. Al contrario, entrambi i set up sperimentali (MDCKII-WT o cellule MDCKII-hMDR1 pre-bloccate) hanno fornito risultati simili (accumulazione di [¹¹C]SNAP-7941), supportando la versatilità di questo saggio in vitro. Le cellule MDCKII-hMDR1 sono altamente adatte per gli esperimenti LigandTracer a causa della loro trasfezione stabile, della rapida crescita e della persistente contro lo stress da taglio causato dal piatto di coltura cellulare rotante. La mancanza di [¹¹C]SNAP-7941 assorbimento nel cervello di ratti e topi potrebbe quindi verificarsi causata da efflusso attraverso il trasportatore P-gp. A causa della trasfezione delle cellule renali canine con la proteina di resistenza multifarmaco umano 1 (hMDR-1, P-gp), il valore predittivo di questo metodo per il legame trasportatore di efflusso negli esseri umani è elevato, il che è favorevole in termini di una futura applicazione clinica. Tuttavia, finora, la selettività contro altri trasportatori di efflusso non è stata verificata. Pertanto, altre linee cellulari possono essere utilizzate, esprimendo diversi trasportatori di efflusso prominente come la proteina di resistenza al cancro al seno (BCRP) o proteina di resistenza multipla-1 (MRP-1), per studiare le interazioni verso questi trasportatori. Il metodo è in confronto ai saggi di accumulo o di trasporto classici molto semplici e dà risultati immediatamente qualitativi. Inoltre, il più grande vantaggio è che questa tecnologia consente di valutare l'interazione diretta del tracciante PET e dell'obiettivo in tempo reale, a differenza dell'esperimento convenzionale che utilizza la quantificazione indiretta (per lo più spostamento). Inoltre, il software di radioasposition in tempo reale fornisce flessibilità sperimentale (ad esempio, correzione del decadimento al nuclide, misurazione del tempo e delle posizioni, ecc.) e quindi un'elevata libertà per gli utenti. Dall'altro lato, le limitazioni del metodo includono una bassa velocità effettiva del campione, poiché è possibile misurare una sola parabola cellulare alla volta. Inoltre, si dovrebbero prendere in considerazione alcune altre questioni tecniche e operative: la tecnologia descritta è molto sensibile alle radiazioni di fondo; pertanto, le sorgenti di radiazione devono essere mantenute a distanza e l'enfasi deve essere posta sulla misurazione dello sfondo prima dell'esperimento. Un altro problema riguardante gli esperimenti a temperature più elevate rispetto alla temperatura ambiente, è il riscaldamento del supporto inclinato: l'evaporazione del mezzo di coltura cellulare potrebbe influenzare il rivelatore. Invece di riscaldare, l'intero dispositivo è preferibilmente collocato nell'incubatrice. Inoltre, il metodo è limitato alle linee cellulari aderenti. Attraverso la rotazione del piatto di coltura cellulare, le cellule sensibili allo stress da taglio potrebbero staccarsi dal piatto, il che può portare a risultati non validi.

Tuttavia, se lo sperimentatore presta attenzione a questi piccoli inconvenienti, il metodo fornisce risultati rapidi e affidabili per l'analisi del comportamento cinetico dei traccianti PET preclinici.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)