Summary
여기서, 우리는[11C]SNAP-7941의 완전 자동화된 방사성 라벨링 및 P-gp 발현 및 비발현 세포에 대한 이 PET-추적자의 실시간 역학의 분석을 위한 프로토콜을 나타낸다.
Abstract
양전자 방출 단층 촬영 (PET)는 통로에 통찰력을 제공하고 생체 내 조사를 위해 특정 표적으로 한 radioligands를 사용하는 필수적인 분자 화상 진찰 기술입니다. 이 프로토콜 내에서,[11C]SNAP-7941의 강력하고 신뢰할 수 있는 원격 제어 방사성 합성, 멜라닌 집중 호르몬 수용체 1에 대한 길항제, 설명된다. 방사성 합성은 사이클로트론 생산[11C]CO2로 시작하여 이후에 [11C]CH3OTf로의 기체 상 전이를 통해 추가로 반응한다. 이어서, 이러한 반응성 중간체는 전구체 용액에 도입되고 각각의 방사성 추적자를 형성한다. 방사성 화학적 순도뿐만 아니라 방사성 의약품 품질 관리 프로세스에서 일상적으로 구현되는 RP-HPLC에 의해 결정됩니다. 추가적으로, 어금니 활동은 다음 실시간 운동 조사를 위한 필수품이기 때문에 계산됩니다. 더욱이,[11C]SNAP-7941은 세포 축적에 대한 P-당단백질(P-gp) 발현의 영향을 평가하기 위한 MDCKII-WT 및 MDCKII-hMDR1 세포에 적용된다. 이러한 이유로, P-gp 발현 세포주(MDCKII-hMDR1)는 P-gp 기질(±)-베라파밀을 이에 의해 실험 전에 차단하지 않고 또는 차단과 함께 사용되며 그 결과는 야생형 세포에 대해 관찰된 것들과 비교된다. 전반적인 실험 접근법은 탄소 11(반감기: 20분)과 같은 단기 핵종으로 표지된 PET 추적기를 사용하여 모든 전임상 및 임상 연구에 필수적인 정확한 시간 관리의 중요성을 보여줍니다.
Introduction
【11C 】 SNAP-7941은 멜라닌 농축 호르몬 수용체 1(MCHR1)을 표적으로 하는 최초의 양전자 방출 단층 촬영(PET)-추적자로서 진화되었다- 주로 식욕및 음식 섭취량의 중앙 조절에 관여하는 수용체1. SNAP-7941의 탄소 11 라벨링, 잘 특성화 된 MCHR1 길항제, 본격적인 PET추적자 2,3,4,5를산출했다. 그러나, 완전 자동화된 방사성 합성은 20 분 6의 반감기를 제공하는 단명한 방사성 핵종 탄소 11로시간 효험 및 재현성 면에서 매우 도전적이다. 전체 합성 시간은 최소한으로 유지되어야하며, 엄지 손가락의 규칙으로 2-3 반감기 (즉, 탄소 11의 경우 약 40-60 분)를 초과해서는 안됩니다7. 특히, 낮은 발현 밀도를 가진 수용체 시스템을 표적으로 하는 방사성 추적자에 대한 합성 절차는 충분한수율및 결과적으로 높은 몰 활성을 얻기 위해 광범위하게 최적화되어야 한다 8. 합성 전략은 종종 사이클로트론 내의 방사성 핵종 생산을 따르고[11C]CO2를 신디사이저로 방출한다. [11C]CO2는 먼저 [11C]CH4로 감소되고 이어서 요오드와 반응하여[11 C]CH3 I를 기체상 방법9,10을 통해 수율로 하였다. 실버 트라이플랫 수율[11C]CH3OTf를 직접 온라인처리. 그 후, 이러한 반응성 탄소-11 표지된 중간체는 전구체 분자를 함유하는 용액내로 도입된다. 자동화된 방사성 합성은 또한 전임상 및 임상 연구에 적합한 제품의 후속 제형을 포함하여 반준비 RP-HPLC를 가진 정화 과정을 관련시킵니다.
방사성 핵종의 반감기와 방사성 합성의 시간 노력에 관계없이, 방사성 의약품의 약물 동력학은 PET-추적자 개발 중에 평가해야 할 가장 중요한 부분입니다. 신경 이미징의 관점에서, PET 추적자의 뇌 입력은 주요 전제 조건입니다. 그러나, 혈액 뇌 장벽 (BBB), 뇌의 "보안 국경", 높은 작은 분자를 언로드 할 수있는 유출 수송을 표현 (예를 들어, PET 추적자) 효율적으로 자신의 적용을 방해.
전임상 평가 동안 큰 단점은 이러한 유출 수송기를 향한 예기치 않은 상호 작용이며, 이는 시험관 내 실험에서 종종 인식되지 않으며[11C]SNAP-7941에 대해 관찰된 바와 같이 생체 내 PET-추적자의 실패로 이어진다. μPET 화상 진찰은 P-gp 억제제 tariquidar11의투여 후에 극적으로 증가한 낮은 두뇌 축적을 입증했습니다. 이러한 데이터는[11C]SNAP-7941이 중앙 MCHR1에 결합하는 리간드를 방해하는 이러한 유출 수송시스템의 기판임을 시사한다. 불행하게도, 트레이서 개발의 초기 단계에서 BBB 침투의 예측을 가능하게 하는 적절한 시험관 내 모델의 부족은 여전히 존재한다.
여기서, 우리는 탄소11메틸화를 위한 신디사이저를 사용하여 [11 C]SNAP-7941의 자동 합성을 기술한다. 이 작업의 강조는 매우 수명이 짧은 핵종 탄소 11을 사용하여 자동화 된 합성, 품질 관리뿐만 아니라 연속적인 체외 평가를 포함한 연속적인 실험 접근법을 구성하는 방법에 대한 개요를 제공하는 것입니다.
첫째, 최소한의 시간 지출과 최대 수율로 성공적인 방합성을 위한 주요 단계가 설명되어 있습니다. 이어서, 신뢰할 수 있는 품질 관리 절차는 잠재적인 임상 연구에 사용할 수 있는 방사선 추적자를 설치하고 유럽 약전12의기준을 충족합니다. 어금니 농도의 정량화 및 각 어금니 활성의 계산은 연속적인 운동 측정을 위한 필수 요건이다.
마지막으로,[11C]SNAP-7941의 유출 수송기, P-gp(hMDR1)를 향한 상호작용을 평가하는 새롭고 간단한 시험관 내 방법이 제시된다. 제안된 운동 모델은 즉각적인 데이터 해석을 허용하고 최소한의 세포 배양 노력이 필요한 다루기 쉬운 장치를 사용합니다13.
Protocol
주의: 다음 프로토콜에는 방사능의 취급 및 조작이 필요한 여러 단계가 관련되어 있습니다. 모든 단계는 연구소의 방사선 안전 부서와 각 국가 입법부와 합의하는 것이 중요합니다. ALARA("합리적으로 달성 가능한 최저") 원칙에 따라 관련 작업자의 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하는 것이 필수적입니다.
1. 실험의 시간 관리 및 계획
참고: 탄소 11의 짧은 반감기는 방사능 손실을 최소화하기 위해정확한 시간 관리가 필요합니다(그림 1). 관련된 모든 사람이 자신의 책임 영역과 각 행동의 시점을 아는 것이 중요합니다. [11C]SNAP-7941의 실시간역학 실험을 설정하기 위해서는 원활한 공정을 위해 약 4명이 필요하다.
- [11C]SNAP-7941에 대한 생산자를 구성합니다.
- 합성 시작 시간의 사양 평가, 질량 농도 및 어금니 활성의 계산을 수행하는 품질 관리 운영자에게 알립니다.
- 희석 계산및 실험을 수행하기 위해 실시간 운동 실험기를 준비한다.
- 주자에게 방사능을 각각의 시점에서 각각의 장소로 전송하도록 지시한다.
2. 전임상 용[11C]SNAP-7941의 자동 합성
- 신디사이저의 제조(도 2).
- 신디사이저, 필요한 기술 가스 (헬륨 및 수소) 및 신디사이저 제어 소프트웨어 Tracerlab을켭니다. 각각의 합성 시퀀스 스냅을 선택합니다.
- V1-V3를 물로 한 번 세척하고 반응기와 HPLC 밸브를 통해 아세톤으로 두 번 세척하거나 루프 폐기물 병에 위치를 주입하십시오.
- V18을 통해 연속적인 헬륨 흐름이 활성화된 사출 밸브를 통해 반응기 안팎으로 모든 관련 라인을 건조시면 됩니다.
- [11C]CH3I 트랩뿐만 아니라 분리된 반응기로 V24, V25, V29, V15, V9, V17 및 V33을 통해 100 mL의 헬륨 스트림 하에서 최대 200°C까지의[11C]CH3OTf 트랩을 가열한다.
- 100 mL의 헬륨 흐름 (부착 된 반응기)에 대한 동일한경로를 확인하십시오 .1. 흐름이 4 mL 이하의 경우 압박감이 보장됩니다./min-1.
- HPLC 펌프(5-10 mL·min-1)를 켜고 HPLC 라인과 분사 밸브를 아세토니트릴/물(50/50, v/v)으로 세척하고 V14를 경유하는 HPLC 용매가 있는 HPLC 라인을 전구로 세척합니다.
- V11 및 V12를 통해 전구를 V19를 통해 헬륨 스트림으로 폐병에 비웁힙합니다. V11 및 V12를 통해 V6의 물로 각 라인을 V18을 통해 헬륨 스트림으로 다시 세척합니다.
- V11과 V12를 통해 물로 V5를 세척하고 V18을 통해 헬륨 스트림을 사용하여 제품 수집 바이알 (PCV)에, 다음 V20을 통해 헬륨 스트림으로 폐병에 V13을 통해 PCV를 비웁니다.
- HPLC 펌프를 끄고 합성을 위해 용매로 전환하십시오((수성 암모늄 아세테이트(2.5 g·· L-1)/아세트산 97.5/2.5 v/v; pH 3.5)/아세토니트릴 75/25 v/v), 반준비 HPLC 컬럼을 부착하고 컬럼을 평형화한다(5 mL·min-1의 흐름).
- 합성 및 정화를 위한 시약을 채웁니다: 물 1.5 mL (V2), 4.5 mL 의 0.9% NaCl (V4), 0.5 mL 의 96% 에탄올 (V5), 10 mL의 물 (V6), 및 90 mL의 물 (전구).
- 새로운 루프 폐기물 바이알을 부착; V13 및 액체 질소에 제품 바이알 (표시 및 폭기 바늘 장착)
- 96% 에탄올과 20 mL의 물로 SPE (고체 상 추출) 카트리지를 사전 조건화하고 V11과 V12 사이에 부착하십시오.
- 합성을 시작하기 20분 전에 사전 실행 순서를 시작하고,[11C]CO2 트랩을 400°C로 가열하고 V27(2분)을경유하여 50 mL·min-1의 헬륨 스트림으로 트랩을 플러싱하는 것으로 구성된다. 이어서, 수소 가스(120 mL·min-1)로 3분 동안 [11C]CO2 트랩을 미리 플러시하고 마침내 40°C 이하로 식힙니다.
- 아세토니트릴 400 μL(DNA 합성, < 10 H2O)에 전구체 1 mg을 용해시키고 반응에 용액을 옮기고 TBAH 5.5 μL(메탄올264 mg·mL-1)을 첨가합니다. 반응기를 해당 위치에 부착합니다.
- 핫 셀을 닫고 핫 셀의 압력을 켭니다.
- 액체 질소를 -75°C까지 사용하여CH4 트랩의 냉각 공정의 시작을 확인합니다.
- 온도에 도달하면 방사능을 해제합니다.
- 【11C]CO2의 사이클로트론 생산
참고: 단계 2.2.1-2.2.4는 방사성 합성 모듈의 제조를 위해 동시에 수행된다(도 1참조).- 사이클로트론의 자석을 켭니다.
- 대상 11 C-CO2를 선택하고 빔 65 μA를시작합니다.
- 버튼을 눌러 조사 시작 조사 시작
- 빔을 중지하고 버튼을 눌러 신디사이저에 방사능의 방출을 확인 전달, 방사능의 원하는 양에 도달 한 후 (약. 120 30 분 후 GBq).
- 완전 자동화 된 방사선 합성의 실행
- 시스템이 방사능을 수신하고 자동화된 프로세스를 시작할 준비가 되어 있는지 확인합니다.
- 다음과 같은 자동화된 프로세스를 모니터링합니다.
- [11C]CO2가 V26(약 4분)을 통해 사이클로트론에서 합성 부로 자동 이송되고 [11C]CO2가 촉매로서 니켈로 함침된 분자 체에 갇혀 있는지 확인한다([ 11세 C]CO2 트랩)을 실온에서.
- [11C]CO2 트랩이 헬륨(50 mL·min-1)으로먼저 플러시되고 수소 가스(120 mL·min-1)로 자동 플러시되는지 추적합니다. 이어서, V27 및 V25가 폐쇄되고 수소 가스를 포함하는 [11C]CO2가 400°C로 가열되고 형성된 [11C]CH4가 더 냉각된[11 C]CH4로 수송되는 것을 관찰한다. 함정과 거기에 갇혀.
- V10이 닫힌 것을 모니터하고, V9가 열리고(요오드 기둥쪽으로) [11C]CH4 트랩을 80°C로 천천히 가열하여 다시 방출되고 헬륨 스트림을 통해 순환 장치로 이송 V10(배기 출구). 그리고[11C]CH4가 순환 유닛 내에서[11C]CH 3I로 변환되는 경우, 약 3분 동안 지속되고 형성된 [11C]CH3I는[11C]에 지속적으로 갇혀 있는지 확인한다. CH3나는 함정.
- 배기 밸브 V16이 열리고[11C]CH3 I 트랩이 V24를 통해 헬륨(20 mL·min-1)의 스트림으로 90°C로 가열되는지 확인한다. 따라서 가능한 부산물이 제거된 다음 V16이 닫힙됩니다.
- [11C]CH3 내가반응기로 방출될 준비가 되어 있는지 확인한다.
- 다음 의 자동화 된 과정을 모니터링 :[11C]CH3I 트랩이 190 °C로 가열되고 형성된[11C]CH3나는[11C]CH3OTf 트랩 (V32 및 V33, 여전히 200 °에서)을 통해 반응기로 방출되는지 확인하십시오. C), V7, 및 V8 연속 헬륨 스트림하에서 (10-25 mL·min-1,V24). 이 과정에서 V21 및 V23(배기 출구)을 열어야 합니다.
- 원자로의 방사능 양이 더 이상 증가하지 않으면 원자로에 방사능이 도착했습니다.
- 다음과 같은 자동화된 프로세스를 모니터링하고 필요한 경우 수동 개입 준비
- V23, V21 및 V8이 자동으로 닫혀 있고 반응 혼합물이 75°C로 가열되었는지 확인합니다. 3분 후, 온도가 35°C 이하가 될 때까지 반응기가 액체 질소로 냉각되는지 관찰한다. 이어서, 반응 혼합물이 V2를 통해 1.5 mL의 물로 담금질되는지 확인하십시오. 이 과정에서 V21 및 V23(배기 출구)을 열어야 합니다.
- V21 및 V23이 닫혀 있고 반응 혼합물이 유체 검출기를 통해 HPLC 루프(5 mL)로 전달됨으로써 HPLC 주입 밸브로 이송되는지 추적합니다. 반응 혼합물이 HPLC 컬럼에 자동으로 주입되는지 추적합니다.
- 크로마토그램을 관찰하고 피크 시작버튼을 통해 수동으로 제품 피크를 잘라. 제품 피크 신호가 약 8-10 분의 체류 시간 후에 약 400 cps 이하로 떨어질 때 피크 종료를 누르십시오 (흐름 : 5 mL ·min-1, 도3).
- 헬륨 스트림을 추가로 켜서 전구 비우기를 가속화합니다.
- 전구가 비워지고 있는지 모니터링하고 폐병을 관찰합니다: V11, SPE 카트리지 및 V12를 통해 전구가 V19및 추가 헬륨 라인을 통해 폐기물로 비워졌는지 확인하고 제품이 SPE 카트리지에 보관되어 있는지 확인합니다.
- 전구가 완전히 비어 있는지 확인합니다.
- SPE 정제 및 제품 전송의 자동화된 프로세스 모니터링
- SPE 카트리지가 V6, V11 및 V12를 통해 10mL의 물로 세척되었는지 확인하고 에탄올이 V5, V11 및 V12를 통해 제품을 PCV에 용해하는지 확인합니다. 마지막으로, 제품을 희석하기 위해 V4, V11 및 V12를 통해 0.9 % NaCl이 PCV에 추가되는지 관찰하십시오.
- 제품 솔루션이 V13및 멸균 필터를 통해 V20을 통해 헬륨 스트림을 통해 최종 제품 바이알로 전달되는지 확인하십시오.
- 제품이 완전히 전송되었는지 확인합니다.
3. 품질 관리 (QC)
참고: 방사성 의약품의 품질 관리에는 다음과 같은 매개 변수 측정이 포함됩니다.
- 방사성 화학적 순도 및 어금니 활성 (RP-HPLC)
- 잔류 용매 (가스 크로마토그래피, GC)
- 삼투압 (증기 압 삼합계)
- pH (pH-미터)
- γ 스펙트럼/방사성 핵종 순도(γ-분광계)
- 반감기/방사성 핵종 순도(용량 교정기)
모든 물리 화학 적 매개 변수는 제품의 방출 전에 결정되며 값은 정의 된 품질 매개 변수 범위에 있어야합니다.
- 품질 관리 장비의 준비
- 합성이 끝나기 30분 전에 준비를 시작한다.
- 납 차폐 용기에 원유병을 준비하고 부착 된 바늘로 차폐 된 1 mL 주사기를 준비하십시오.
- HPLC용 물에 SNAP-7941(10 μg·mL-1)의 기준 표준 용액을 준비합니다.
- pH 측정기, 가스 크로마토그래프 및 사용된 가스, 삼각계 및 HPLC의 모든 구성 요소를 켭니다.
- HPLC 제어 소프트웨어를 켜고[11C]SNAP-7941(이동 상: 물/아세트산 97.5/2.5 v/v; 2.5 g.L-1 암모늄 아세테이트, pH 3.5)/아세토니트릴 70/30 v/v 흐름; 1mL -1) 두 가지 측정값(표준 및 제품)으로 샘플 목록을 작성합니다. 열의 컨디셔닝 방법을 시작합니다.
- 10분 컨디셔닝 후 해밀턴 주사기로 SNAP-7941 기준 용액의 20 μL을 주입하고 분석 실행을 시작합니다.
- 주입 후 아세트니트릴과 물로 해밀턴 주사기를 두 번 씻으소서.
- GC 제어 소프트웨어를 시작하고 샘플 목록을 작성합니다.
- 품질 관리 수행
- 합성 종료 후 제품의 절대 방사성 수율을 측정하고 품질 관리를 위해 제조 된 납 차폐 주사기로 제품의 100 μL을 반응 바이알로 옮김.
참고: 품질 관리에서 얻은 모든 데이터는 국가 규정에 따라 문서화되어야 합니다. - 분석 적 HPLC: 방사성 화학적 순도 및 화학적 순도를 측정하고 결과 즉시 세포 배양 실험을 담당하는 사람에게 알립니다.
- QC 샘플의 40 μL을 그리고 HPLC에 주입한다. 사출 밸브의 팔을 부하에서 주입으로 이동하여 실행을 시작합니다(그림 3).
참고: 실행(8분) 동안 가능한 한 많은 부패를 방지하기 위해 프로토콜의 다른 측정을 수행할 수 있습니다. - 크로마토그램을 열고 방사능 채널의 모든 피크를 통합합니다. 제품의 보존 시간(5.0-7.0분)과 기준 표준의 보존 시간을 비교합니다. 모든 통합 피크의 백분율로 곡선 아래의 면적을 비교합니다. 제품 피크는 총 통합 영역(무선 채널)의 95% 이상(방사성 화학적 순도)이어야 합니다.
- UV 채널에 신호를 통합하여 화학적 순도를 결정합니다. 주요 불순물은 일반적으로 2.8-3.5 분의 전구체 SNAP 산입니다. [natC]SNAP-7941의 농도는 통합 후 캘리브레이션 곡선으로부터 계산됩니다. μmol·mL-1에서 SNAP-7941의 농도를 계산하고 다음 방정식을 사용하여 어금니 활성을 결정합니다.
- QC 샘플의 40 μL을 그리고 HPLC에 주입한다. 사출 밸브의 팔을 부하에서 주입으로 이동하여 실행을 시작합니다(그림 3).
- 가스 크로마토그래피의 경우, 전용 유리 바이알에 품질 관리 샘플의 20 μL을 전달합니다. 자동 샘플러에 놓고 측정을 시작합니다. 측정이 끝나면 크로마토그램을 열고 자동으로 통합된 피크 수를 적어 둡니다. 샘플은 410 ppm 아세토니트릴 및 10% 에탄올을 함유해서는 안 된다.
- Osmolality: 종이 샘플 디스크를 전용 중공에 놓고 샘플의 10 μL을 적용합니다. 삼투압을 측정하기 위해 닫기 버튼을 누릅니다. 3 분 후, 장치는 190-500 mosm ·kg-1의범위에 있어야 하는 삼투압을 표시합니다.
- pH: 전극을 물로 씻으세요. 샘플에 전극을 넣어 pH를 측정합니다. pH는 5.0-8.5의 범위에 있어야 한다. 측정 후 전극을 다시 세척하고 전극을 기준 pH 용액에 놓습니다.
- γ 스펙트럼: QC 샘플을 γ-분광기에 넣고 제어 소프트웨어를 열고 측정을 시작합니다. 측정을 중지하고 511 keV(범위 420-520 keV)여야 하는 측정된 에너지를 적어 둡니다. 파일 메뉴를 열고 해당 일괄 처리 번호로 파일을 안전하게 보호합니다. 전용 소프트웨어에서 저장된 스펙트럼을 기억하고 스펙트럼을 인쇄합니다.
- 반감기: 용량 교정기를 사용하여 QC 샘플의 활성을 2회 측정합니다. 각 시간을 기록하고 지수의 반감기를 계산합니다.
- 합성 종료 후 제품의 절대 방사성 수율을 측정하고 품질 관리를 위해 제조 된 납 차폐 주사기로 제품의 100 μL을 반응 바이알로 옮김.
- 릴리스
- 모든 매개 변수를 테스트하고 결과가 오스트리아 당국의 지침에 따라, 방사선 추적자를 해제 한 후. 운영자는 데이터의 정확성에 서명해야 합니다.
4. P-gp 수송기를 향한 상호 작용의 평가
- 세포 배양
- 작업대의 라미나 공기 흐름(LAF)을 시작하고 작업을 시작하기 전에 최소 15분 동안 벤치를 청소하십시오.
- LAF의 멸균 조건 하에서 세포 배양 배지를 FCS(50 mL)의 10% 및 항생제 0.5%(2.5 mL)와 자동 파이펫팅 보조를 사용하여 멸균 체적 파이펫과 혼합합니다.
- MDCKII-hMDR1 및 MDCKII-WT 세포를 해동하고 T75 또는 T175 세포 배양 플라스크에서 배양하여 무균 조건 하에서 실험하기 10-14일 전에(LAF).
- 다음날 배지를 변경하여 부착되지 않은 세포와 세포 사멸 세포를 모두 제거합니다.
- 매 3일마다 배지를 신선한 것으로 교체합니다(T75의 경우 12 mL, T175 세포 배양 플라스크의 경우 23 mL).
- 이중층 성장을 피하기 위해 80%의 합류 시 신선한 플라스크 또는 세포 배양 요리에 대한 실험의 시간 일정에 따라 세포를 분할한다.
- 실험을 위한 세포 준비
- 실험 2일 전에 세포를 분할하고 종자 2.5 x 105 세포당 2 mL의 농도로 세포 배양 접시의 경사평면으로 분할한다(도 4). 자동 셀 카운터 장치 또는 Neubauer 계수 챔버를 사용하여 셀을 계산하고 적절한 분할 비율을 계산합니다.
- 실험 1일 전에 배지를 제거하고, 배양 접시에 세포를 DPBS 4 mL로 세척하고 신선한 5 mL의 세포 배양 배지를 첨가하였다. 접시를 인큐베이터에 수평으로 놓습니다.
- 실험 전에 적어도 0.5 시간 동안 DPBS로 세포를 세척하고 FBS 자유 배지 2 mL로 교체하십시오. 현미경으로 합류 및 세포 형태를 검사합니다.
- 세 가지 다른 설정에서 실험을 수행합니다.
- 4.2.3에 기재된 바와 같이 페트리 접시를 실험에 사용한다.
- 10 μM (±)-베라파밀 염산염으로 실험하기 전에 세포를 0.5 시간 동안 치료하십시오.
- 0.98 μL의 베라파밀 스톡 용액(20.4mM(±)-DMSO에 베라파밀 염산염)을 첨가합니다. 최종 DMSO 함량은 치료 중 ≤0.05%이다.
- 비히클 제어(DMSO)로 세포를 0.5시간 동안 배양합니다. 약물 치료에 사용되는 것과 동일한 부피를 사용하십시오.
- 실시간 분석 실험(세 가지 설정 모두에 대해)
- 장치, 컴퓨터를 켜고 올바르게 연결되어 있는지 확인한 다음 제어 소프트웨어를 엽니다.
- 하나의 대상 옵션을 선택하고 템플릿의 잠금을 해제하고 다음 설정을 조정합니다.
위치 수: 2 (2)
감지 시간(초): 3 (3)
감지 지연 시간(들): 2 (2)
첫 번째 단계의 이름: 기준선 - 세포 배양 접시를 장치의 기울어진 지지체에 삽입하여 세포 극이 하단에 있고 세포 배양 배지로 덮여 있는지 확인하십시오.
- 시작 버튼을 통해 실행을 시작합니다. 시스템에서 파일을 저장하라는 요청이 있습니다. 파일 이름과 저장 경로를 선택합니다. 제어 센터가 팝업되고 기준선 측정이 시작됩니다(세포 배양 접시 지지가 회전하기 시작합니다).
- 다른 옵션에서선택 :
시간 규모: 분
핵종 보정: 탄소 11 - 그래프(배경),대상(파란색) 및 대상 에서 빼기 배경(검은색)의 곡선 아래의 모든 확인란을 선택합니다.
- 품질 관리 매개 변수를 획득: 어금니활성 [GBq.μmol-1] 및 활성 농도 [MBq.mL-1] 합성의 끝에.
- 2 mL의 분석 부피에서[natC]SNAP-7941의 15 nM에 대한 각각의 트레이서 볼륨을 계산합니다.
- [11C]SNAP-7941 제품의 각각부와 별표에 대한 파이펫을 리드 차폐에 준비한다.
- 제어 센터 창에서 일시 중지 실행을 클릭합니다. 접시 회전이 중지되고 제목이 일시 중지되고 다음 단계가 발생할때까지 기다립니다.
- 실시간 운동 장치의 뚜껑을 엽니다. 배양 접시 를 왼쪽으로 90°로 돌립니다. 계산된 추적자 볼륨을 추가하고 초기 위치로 돌아갑니다. 그런 다음 장치의 뚜껑을 닫습니다. 실험을 시작하기 위해 계속 버튼을 즉시 누릅니다.
- 20분 후에 실험을 종료하고 일시 중지를 선택한 후 실행을 종료합니다(사이드 바에서 실행을 종료합니다).
- 통계 소프트웨어를 사용한 데이터 분석 및 처리
- 실시간 제어 소프트웨어를 엽니다. 파일 열기를 클릭하여 필요한 역학을 회수합니다. 역학은 제어 센터 창에 도시되어 있습니다.
- 역학 내보내기곡선에서 직접 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 선택합니다. 원시 데이터가 포함된 텍스트 파일을 저장합니다. 통계 프로그램을 열고 실시간 실험의 원시 데이터 파일을 붙여넣습니다.
- 라디오 트레이서추가 시간(x축)으로 시작하여(배경 측정 제외) 최대 CPS의 백분율 신호(초당 카운트)로 정규화합니다.
- 정규화된 모든 데이터를 새 GraphPad 프리즘 파일에 로드합니다.
- 평균 값과 표준 편차를 계산합니다.
- 세 가지 셋업 모두의 트레이서 섭취량의 편차(증가율)를 보여주는 그래프로 얻은 데이터를 보여 줍니다.
Representative Results
[11C]SNAP-7941의 완전 자동화된 방사성 합성은 제형화 생성물의 [11C]CH3 OTf; n=10)에 기초하여 5.7±2.5GBq(EOB에서 4.6±2.0%, 14.9±5.9%)를 산출하였다. 전체 합성은 약 40 분 지속, 여기서 15 분 은 [11 C]CH 3 OTf의 준비를 위해 필요했다[11C]CH3OTf 가스 상 방법을 통해, 또 다른 5 분은 전구체의 방사성 라벨링에 필요했다, 반 준비의 10 분 다음 Rp-HPLC 정제 및 C18 카트리지 고체 상 추출 및 제형을 위한 10분. 이어서, 작은 aliquot(약 100-200 μL)를 품질 관리를 담당하는 사람에게 전달하였고, 반면 에 기성 사용 트레이서를 함유한 본래의 제품 바이알은 실시간 운동 분석의 실험자에게 전달되었다.
품질 관리는 합성 종료 후 10 분 이내에 완료되었습니다. 어금니 활성은 72±41 GBq/μmol(n=10)의 범위였고 방사성 화학적 순도는 항상 > 95%였다. 다른 모든 파라미터(pH, 삼투압, 잔류 용매)는 방출 기준을 충족시켰다. 실시간 운동 분석의 경우, 3개의 상이한 실험 설정이 선택되었다: (A) 처리 및 비처리(비히클) MDCKII-WT 세포, (B) 비처리 또는 비기MDCKII-hMDR1 세포로 처리된 후자의 세포주 및 (C) 후자의 세포주를 사전에 차단하여 실시간 차단 (±)-베라파밀을 사용하는 수송기의 운동 분석. [11C]SNAP-7941을 야생형 세포주 MDCKII-WT(P-gp 비발현) 및 MDCKII-hMDR1(P-gp 발현)에 적용하면 야생형 세포주에 빠른 축적이 있는 반면, 축적은 관찰되지 않은 다른 운동적 거동을 나타낸다. MDCKII-hMDR1 세포에 대해 그러나, P-gp 유출 수송기(±)-verapamil을 가진 P-gp 유출 수송기(±)를 차단하는 것은 야생형 세포주에서 이미 본바와 같이 유사한 실시간 역학으로 이어졌다(도 5).
그림 1: 작업 흐름의 개요입니다. [11C]SNAP-7941의 실시간 역학 측정의 방사능,품질 관리 및 성능의 작업 흐름. 검은 색 화살표는 방사능의 전송 방법을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 자동화된 신디사이저의 방사성 합성 방식. [11C]CH3 I/[11C]CH3 OTf 생산, 전구체 용액및 SPE 정제에 대한 활성의 도입을 위한 반응기용 순환 장치로 시작하여 자동 신디사이저의 스위칭 회로(SPE = 고체 상 추출; PCV = 제품 수집 바이알). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: [11C]SNAP-7841의 완전 자동화된 방사성 합성의 대표적인 크로마토그램. 반준비 RP-HPLC 크로마토그램은 하단에 정제 된 후 상단 및 분석 하나에 예시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 실시간 실험을 위한 세포 배양 접시 준비. 1단계는 세포 유형 및 이들의 성장 속도에 따라 2.5 x 105 최대 1 x 106의 시드를 포함한다. 그 후, 배양 접시는 경사 면 (약 30-45 °)에 배치됩니다. 따라서, 제공된 금속 장치 또는 세포 배양 접시의 뚜껑은 접시의 기울어진 위치를 안정화시키기 위해 인큐베이터에 사용될 수 있다. 다음날 (24 시간) 접시를 수평으로 조정하고, 신선한 세포 배양 배지가 세포 표면을 완전히 덮도록 첨가된다. 실험 당일, 세포 생존력과 합류도 검사됩니다. 실험 프로토콜에 따르면, 세포는 DPBS로 세척되고, 배지는 무혈청 배지(2 mL)로 대체되고, 배양 접시는 실험이 시작될 때까지 경사 위치로 재배치된다. 이제부터, 세포는 억제제 또는 비차량으로 치료될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: [11C]SNAP-7941의 실시간 운동 측정. [11C]SNAP-7941의 대표적인 실시간 역학은 3개의 상이한 셋업으로 도시된다: MDCKII-WT 세포를 사용하여; MDCKII-hMDR1 세포는 차단 없이 P-gp 억제제 및 MDCKII-hMDR1 세포로서 (±)-verapamil으로 미리 차단하였다. y축은 치료되지 않은 MDCKII-MDR1 세포의 결과와 비교하여 미리 차단된 MDCKII-hMDR1 및 WT 세포의 증가율을 각각 나타낸다(섭취 없음, 0%). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
[11C]SNAP-7941의 방사성 합성은 상용 합성 모듈상에 확립되었다. 준비 절차를 완전히 자동화 할 수있는 가능성으로 인해 방사성 합성이 신뢰할 수 있다는 것을 증명하고 작업자의 방사선 보호에 관한 개선이 이루어졌습니다. 신디사이저의 준비는 특히 어금니 활성의 측면에서, 방사선 추적기의 품질에 엄청난 영향을 미친다. 따라서, 불활성 조건(예를 들어, 헬륨 대기)에서 지속적으로 작업하고 반응 용기(타겟 라인,[11C]CH3 I생산 주기 및 반응기)에 앞서 위치한 모든 라인을 플러시하는 것이 필수적이다(도 2참조). 더욱이, 합성이 시작되기 전에 각각의 트랩과 오븐을 가열하여 수분과 대기 탄소를 제거하여 어금니 활성을 유리하게 증가시킨다. 특히 흑연화 탄소가 함침 된 AgOTf 컬럼은 습도에 매우 민감합니다. 임의의 수분 공급원조차도[11C]CH3I의 변환을 방해[11 C]CH3 OTf. 합성을 시작하기 전에,[11C]CO2 트랩과 [11C]CH3 I 트랩은 후속 트래핑을 가능하게 하기 위해 다시 실온으로 냉각되어야 한다. 또한 합성을 시작하기 직전에 전구체를 용해시키고 베이스를 전구체 용액에 직접 추가하는 것이 좋습니다.
카본 11 방사성 추적기의 품질 관리는 지속적이고 빠른 워크플로우를 위해 합리적으로 설계되어야 합니다. 그러나, 세포 배양 연구를 위한 가장 중요한 매개변수는 유효한 결과를 얻기 위하여 방사성 화학적 순도 및 대구치 활성입니다. 어금니 활성의 정확한 평가는 견고한 분석 HPLC 방법을 필요로 하며 교정 곡선은 최종 생성물의 농도 범위를 커버해야 한다. 방사성 추적기의 도전적인 부분은 방사성 합성 중에 생성되는 소량으로 인해 정량화(LOQ)의 한계를 초과하는 농도를 달성하는 것입니다. 따라서, 본 래치활동은 수용체 포화를 피하기 위해 높은 어금니 활동과 비방사성 신호를 정량화할 수 있을 만큼 충분히 높은 농도 사이의 균형을 찾는 것이다.
【11C 】 SNAP-7941은 급속한 유출로 인한 미처리 또는 비히클 처리된 MDCKII-hMDR1 세포에서 축적이 관찰되지 않음으로 인간 P-gp 수송기의 강력한 기질인 것으로 확인되었다. 대조적으로, 두 실험 설정(MDCKII-WT 또는 미리 차단된 MDCKII-hMDR1 세포)은유사한 결과([11 C]SNAP-7941의 축적)를 제공하여, 이러한 시험관내 분석의 다양성을 뒷받침한다. MDCKII-hMDR1 세포는 회전 하는 세포 배양 접시에 의해 발생 하는 전단 스트레스에 대 한 그들의 안정적인 형질 감염, 빠른 성장 및 지속적인 리간트 트레이서 실험에 매우 적합 하다. [11C]SNAP-7941 쥐와 쥐 두뇌에 있는 섭취의 부족은 그러므로 P-gp 수송기를 통해 유출에 기인할 수 있습니다. 인간 다중 약물 내성 단백질 1(hMDR-1, P-gp)을 이용한 개 신장 세포의 형질감염으로 인해, 인간에서 의한 유출 수송체 결합에 대한 이 방법의 예측 값은 높으며, 이는 향후 임상 적용 측면에서 유리하다. 그러나, 지금까지, 다른 유출 수송에 대한 선택성은 확인되지 않았다. 따라서, 다른 세포주들은 유방암 내성 단백질(BCRP) 또는 다중 저항 단백질-1(MRP-1)으로서 다른 저명한 유출 수송기를 발현하여, 이들 수송기를 향한 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 고전적인 축적 또는 수송 검사에 비해 매우 간단하고 즉시 질적 결과를 제공합니다. 더욱이, 가장 큰 장점은 이 기술이 간접 정량화(대부분 변위)를 이용한 종래의 실험과는 달리 PET 트레이서와 대상의 직접 상호 작용을 실시간으로 평가할 수 있다는 것이다. 또한 실시간 방사선 분석 소프트웨어는 실험적 유연성(예: 핵종 붕괴 보정, 측정 시간 및 위치 등)을 제공하므로 사용자에게 높은 자유도를 제공합니다. 다른 측면에서, 방법의 한계는 한 번에 하나의 셀 접시만 측정 할 수 있기 때문에 낮은 샘플 처리량을 포함한다. 또한, 몇 가지 다른 기술 및 운영 문제를 고려해야한다 : 설명 된 기술은 배경 방사선에 매우 민감하다; 따라서 방사선 원은 거리에서 유지되어야하며 실험 전에 배경 측정에 중점을 두어야합니다. 실온보다 더 높은 온도에서의 실험에 관한 또 다른 문제는 기울어진 지지체의 가열입니다: 세포 배양 배지의 증발은 검출기에 영향을 미칠 수 있습니다. 가열 대신에, 전체 장치는 바람직하게는 인큐베이터에 배치된다. 더욱이, 상기 방법은 부착 세포주로 제한된다. 세포 배양 접시의 회전을 통해, 전단 스트레스에 민감한 세포는 접시에서 분리 될 수 있습니다, 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다.
그럼에도 불구하고, 실험자가 이러한 사소한 단점에 주의를 기울이면 이 방법은 전임상 PET-추적자의 운동 적 행동의 분석을 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 결과를 제공한다.
Disclosures
우리는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 오스트리아 과학 기금 (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser)에 의해 지원되었다. 우리는 T. 젠즈와 A. Krcal의 기술 지원에 감사드립니다. 또한, 우리는 전구체를 배포에 대한 AgOTf와 H. Spreitzer의 준비에 대한 K. Pallitsch 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
| Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
| Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
| Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
| Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
| NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
| Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
| Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
| Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
| Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
| Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
| Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
| PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| [11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
| TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
| Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
| Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
| NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
| Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
| 430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
| Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
| Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
| g-spectrometer | g-spectrometer | ||
| Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
| Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
| Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
| HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
| inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| In vitro experiments | |||
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| (±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
| DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
| Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
| LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
| Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
| Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |
References
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![[11C]SNAP-7941의 자동 합성<sup></sup>및 실시간 역학 평가의 기술적 측면](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/59557.jpg)
