Summary
Здесь мы представляем протокол для полностью автоматизированной радиомаркировкиNo 11C'SNAP-7941 и анализа кинетики в реальном времени этого ПЭТ-трассировщика на P-gp выражении и невыразительных клетках.
Abstract
Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) является важным методом молекулярной визуализации, обеспечивающим понимание путей и использование конкретных целевых радиолигандов для исследований in vivo. В рамках этого протокола описан надежный и надежный дистанционно управляемый радиосинтезNo 11C'SNAP-7941, антагонист к рецептору гормона, концентрирующего меланин 1. Радиосинтез начинается с циклотрона, произведенногоNo 11C'CO 2, который впоследствии дополнительно реагирует с помощью газофазного перехода кNo 11C'CH3OTf. Затем этот реактивный промежуточный вводится в раствор-предшественник и формирует соответствующий радиотрейстер. Химическая, а также радиохимическая чистота определяются с помощью RP-HPLC, регулярно внедряемого в процессе контроля качества радиофармацевтических препаратов. Кроме того, активность моляра рассчитывается так как она является необходимостью для следующих кинетарных исследований в реальном времени. Кроме того, для оценки влияния Экспрессии P-гликопротеинов (P-gp) на накопление клеток применяется11C'SNAP-7941. По этой причине, P-gp экспрессии клеточной линии (MDCKII-hMDR1) либо используется без или с блокированием до экспериментов с помощью P-gp субстрата (я)-вераполила и результаты сравниваются с теми, наблюдается для клеток дикого типа. Общий экспериментальный подход демонстрирует важность точного тайм-менеджмента, который необходим для каждого доклинического и клинического исследования с использованием ПЭТ-трассировок, оснащенных недолговечными нуклидами, такими как углерод-11 (половина жизни: 20 мин).
Introduction
11С. SNAP-7941 был разработан в качестве первого позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)-трассировщик ориентации меланина концентрации гормона рецептора 1 (MCHR1) - рецептор в основном участвует в центральной регуляции аппетита и потребление пищи1. Углерод-11 маркировки SNAP-7941, хорошо характеризуется MCHR1 антагонист, дали подлинный ПЭТ-трейсер2,3,4,5. Тем не менее, полностью автоматизированный радиосинтез является весьма сложной задачей с точки зрения эффективности времени и воспроизводимости с недолговечной радионуклид углерода-11 предлагает период полураспада 20 мин6. Общее время синтеза должно быть сведено к минимуму, и, как правило, не должно превышать 2-3 период ыполудения (т.е. около 40-60 мин для углерода-11)7. Особенно, процедуры синтеза для радиотрейсеров ориентации рецепторных систем с низкой плотностью экспрессии должны быть широко оптимизированы для получения достаточной урожайности и, следовательно, высокой молярной активности8. Синтетическая стратегия часто следует за продукцией радионуклида внутри циклотрон и отпускомNo 11C'CO2 к синтезатору. Там,No 11C'CO2 сначала сводится к11C CH 4, а затем отреагировал ийодом, чтобы дать11C'CH3Я с помощью газофазного метода9,10. Дальнейшая обработка серебряным трифлом дает11C'CH3OTf непосредственно в режиме он-лайн. После этого реактивный углерод-11 помечены промежуточные вводится в раствор, содержащий молекулы-предшественника. Автоматизированный радиосинтез дополнительно включает в себя процесс очистки с полу-подготовкой RP-HPLC, включая последующую разработку продукта, пригодного для доклинических и клинических исследований.
Независимо от период полураспада радионуклида и времени усилия радиосинтеза, фармакокинетическая радиофармацевтической является наиболее важной частью для оценки во время развития ПЭТ-трассировки. С точки зрения нейровизуализации, ввод мозга ПЭТ-трекер является основным условием. Тем не менее, гематоэнцефалический барьер (BBB), "граница безопасности" мозга, высоко выражает efflux транспортеров, которые могут выгрузить небольшие молекулы (например, ПЭТ-трассы) и эффективно препятствовать их применимости.
Огромным недостатком во время доклинической оценки являются неожиданные взаимодействия с этими транспортерами efflux, которые часто не распознаются вэкспериментах in vitro и приводят к сбою ПЭТ-трасса in vivo, как это наблюдается в 11 C'SNAP-7941. Изображение ПЕТ у крыс продемонстрировало низкое накопление мозга, которое резко возросло после введения ингибитора P-gp tariquidar11. Эти данные свидетельствуют о том, чтоNo 11C'SNAP-7941 является субстратом этой системы транспортера efflux, препятствующей связыванию лиганда к центральному MCHR1. К сожалению, по-прежнему отсутствует адекватные модели in vitro, позволяющие прогнозировать проникновение BBB на ранней стадии развития трассировщика.
Здесь мы описываем автоматизированный синтезNo 11C'SNAP-7941 с использованием синтезатора для метилирования углерода-11. Основное внимание в этой работе, чтобы дать обзор о том, как организовать последовательный экспериментальный подход, включая автоматизированный синтез, контроль качества, а также последовательные в пробирке оценки с очень недолго нуклид углерода-11.
Во-первых, описаны ключевые шаги для успешного радиосинтеза с минимальными затратами времени и максимаальной урожайностью. Затем, надежная процедура контроля качества устанавливается сделать радиотрейстер доступны для потенциальных клинических исследований и отвечают критериям Европейской Pharmacopoeia12. Количественная оценка концентрации моляров и расчет соответствующей молярной активности является необходимым требованием для последовательных кинетических измерений.
Наконец, представлен новый и простой метод in vitro, оценивающий взаимодействие11C'SNAP-7941 с транспортером эффлюкса, P-gp (hMDR1). Предлагаемая кинетическая модель использует простое в обращении устройство, которое позволяет немедленную интерпретацию данных и требует минимальных усилий по культуре клеток13.
Protocol
ВНИМАНИЕ: В следующем протоколе участвуют несколько этапов, которые требуют обработки и манипуляции радиоактивностью. Важно, чтобы каждый шаг был согласован с Департаментом радиационной безопасности института и соответствующим национальным законодательным органом. Необходимо свести к минимуму воздействие ионизирующего излучения для операторов, участвующих в этом проекте по принципу ALARA ("Как мало, как разумно достижимый").
1. Управление временем и планирование эксперимента
ПРИМЕЧАНИЕ: Короткий период полураспада углерода-11 требует точного управления временем, чтобы свести к минимуму потерю радиоактивности (рисунок 1). Важно, чтобы любое лицо, о котором идет речь, знало свою область ответственности и сроки соответствующего действия. Для создания кинетической эксперимента в режиме реального времени, состоящего из11C'SNAP-7941, необходимо около четырех человек для плавного процесса.
- Организуйте производителя для11C'SNAP-7941.
- Сообщите оператору контроля качества, выполняя оценку спецификации, расчет концентрации массы и молярной активности времени начала синтеза.
- Держите кинетического экспериментатора в реальном времени готового к расчету разбавления и выполнению эксперимента.
- Проинструктируйте бегуна о переносе радиоактивности в соответствующее место в соответствующем временном пункте.
2. Автоматизированный синтезNo 11C'SNAP-7941 для доклинического использования
- Приготовление синтезатора (рисунок 2).
- Включите синтезатор, необходимые технические газы (гелий и водород) и программное обеспечение для управления синтезатором Tracerlab. Выберите соответствующую последовательность синтеза оснастки .
- Вымойте V1-V3 один раз с водой и дважды с ацетоном через реактор и клапан HPLC либо на нагрузку или впрыснуть положение в бутылку отходов цикла.
- Сухие все связанные линии в и из реактора через инъекционный клапан с непрерывным потоком гелия, активированным через V18.
- Нагрейте ловушку No11C'CH 3, а также ловушкуNo 11C'CH3OTf под гелиевым потоком 100 мл.мин-1 до 200 градусов по Цельсию через V24, V25, V29, V15, V9, V17 и V32/V33 с отсоединителем.
- Проверьте тот же путь на наличие утечек (с прикрепленным реактором) с гелиевым потоком 100 мл-мин-1. Герметичность гарантируется, когда поток опускается ниже 4 мл.мин-1.
- Включите насос HPLC (5-10 мл-мин-1) и промойте линии HPLC и инъекционный клапан ацетонитрилом/водой (50/50, v/v), а также линии HPLC с растворителем HPLC через V14 в лампочку.
- Опустошить луковицу через V11 и V12 в бутылку отходов с гелием поток через V19. Вымойте соответствующие линии с водой из V6 снова через V11 и V12 с гелиевым потоком через V18.
- Вымойте V5 с этанолом и V4 с водой через V11 и V12 в флакон коллекции продукции (PCV) с помощью гелия поток через V18, а затем опорожнить PCV через V13 в бутылку отходов с гелием поток через V20.
- Выключите насос HPLC, переключитесь на растворитель для синтеза ((ацетат аммония (2,5 г) L-1)/уксусная кислота 97.5/2.5 v/v; pH 3.5)/ацетонитрил 75/25 v/v), прикрепите полупрепаративную колонку HPLC и уравновесите столбец (поток 5 мл.мин-1).
- Заполните реагенты для синтеза и очистки: 1,5 мл воды (V2), 4,5 мл 0,9% NaCl (V4), 0,5 мл 96% этанола (V5), 10 мл воды (V6), и 90 мл воды (луковица).
- Прикрепите новый флакон отходов цикла; продукт флакон (помечены и оснащены аэрации иглы) на V13 и жидкого азота.
- Предварительно езкомыт картридж SPE (твердая фаза извлечения) с 10 мл 96% этанола и 20 мл воды и прикрепить его между V11 и V12.
- Начните предзапуск последовательности 20 мин перед началом синтеза, состоящий из нагрева ловушкиNo 11C'CO2 до 400 градусов по Цельсию и промывки ловушки с гелием поток 50 мл'мин-1через V27 (2 мин). Затем предварительно промойте ловушкуNo 11C'CO2 в течение 3 мин с водородным газом (120 мл.м.,-1) и, наконец, остыть до уровня ниже 40 градусов по Цельсию.
- Растворите 1 мг прекурсора в 400 л ацетонитрила (для синтеза ДНК, lt; 10 H2O), перенесите раствор на реакцию и добавьте 5,5 л TBAH (264 мг/мл-1 в метаноле). Прикрепите реактор к соответствующей позиции.
- Закройте горячую ячейку и включите под давлением горячей ячейки.
- Подтвердите начало процесса охлаждения ловушки CH4 с жидким азотом до -75 градусов по Цельсию.
- Отпустите радиоактивность при температуре.
- Производство циклотроновNo 11C'CO2
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.2.1-2.2.4 проводятся одновременно с подготовкой модуля радиосинтеза (см. также рисунок1).- Включите магнит циклотрон.
- Выберите цель 11C-CO2 и начните луч 65 ЗА.
- Подтвердите начало облучения, нажав кнопку Начало облучения
- Остановите луч и подтвердите высвобождение радиоактивности в синтезатор, нажав кнопку Доставка,после достижения желаемого количества радиоактивности (около 120 ГБК после 30 мин).
- Выполнение полностью автоматизированного радиосинтеза
- Подтвердите, что система готова к приему радиоактивности и запуску автоматизированного процесса
- Мониторинг следующего автоматизированного процесса.
- Проверить, если11 C'CO2 автоматически передается из циклотрона в единицу синтеза через V26 (около 4 мин) и что11C'CO2 в ловушке на молекулярном сито пропитанник никеля в качестве катализатора ( 11 Год Ловушка C'CO2 при комнатной температуре.
- Отслеживайте, если ловушка No11C'CO2 автоматически промывается сначала гелием (50 мл., тосводородным газом (120 мл-мин-1). Затем заметьте, что V27 и V25 закрыты, а захваченные11C'CO 2, включая водородный газ, нагреваются до 400 градусов по Цельсию и что сформированныйNo 11C-CH4 дополнительно транспортируется в предварительно охлажденный No11C ловушки и в ловушке там.
- Монитор, что V10 закрыт, V9 открыт (в сторону йодной колонки) иNo 11C CH4 снова освобождается путем нагрева ловушкиNo 11C CH4 медленно до 80 градусов по Цельсию и транспортируется в блок циркуляции с гелиевым потоком через V10 (выход из выхлопных газов). И далее проверить, если11C CH4 преобразуется вNo 11C CH3Я в циркуляции единицы, которая длится около 3 мин, и формируется11C CH3Я постоянно в ловушке на11C CH3I ловушка.
- Убедитесь, что выхлопной клапан V16 открыт, а ловушка No11C'CH3I нагревается до 90 градусов по Цельсию с потоком гелия (20 мл-мин-1) через V24. Таким образом, возможные побочные продукты удаляются, а затем V16 закрывается.
- Подтвердите, чтоNo 11C CH3я готов к выпуску в реактор.
- Мониторинг следующего автоматизированного процесса: Проверьте, если ловушка No11C'CH3Я нагревается до 190 градусов по Цельсию, а сформированная 11 C'CH3Я выпущена в реактор через ловушку No11C'CH3OTf (V32 и V33, еще на 200 C), V7 и V8 под непрерывным гелиевым потоком (10-25 мЛ-мин-1, V24). Во время этого процесса, V21 и V23 (выход из выхлопных газов) должны быть открыты.
- Подтвердите, что радиоактивность прибыла в реактор, как только количество радиоактивности в реакторе больше не повышается.
- Мониторинг следующего автоматизированного процесса и подготовка к ручному вмешательству, если это необходимо
- Проверьте, автоматически ли автоматически закрываются V23, V21 и V8, а реакционная смесь нагревается до 75 градусов по Цельсию. После 3 мин, наблюдать, если реактор охлаждается жидким азотом, пока температура не будет ниже 35 градусов по Цельсию. Впоследствии убедитесь, что реакционная смесь затушена 1,5 мл воды через V2. Во время этого процесса, V21 и V23 (выход из выхлопных газов) должны быть открыты.
- Отслеживайте, если V21 и V23 закрыты и реакционная смесь передается в инъекционный клапан HPLC, проходя через детектор жидкости в петлю HPLC (5 мл). Отслеживайте, если реакционная смесь автоматически вводится в столбец HPLC.
- Наблюдайте хроматограмму и отрежьте вручную пик продукта через стартпик кнопки. Нажмите Пик конца, когда продукт пиковый сигнал падает ниже примерно 400 cps после времени удержания около 8-10 мин (поток: 5 мЛ мин-1, Рисунок 3).
- Включите дополнительный поток гелия для ускорения опорожнения лампы.
- Монитор ли лампа опорожнения и наблюдать за отходами бутылку: Проверьте, если лампа опорожняется через V11, картридж SPE и V12 в отходы с гелием поток через V19 и дополнительной линии гелия, и если продукт сохраняет на картридже SPE.
- Подтвердите, что лампочка полностью пуста.
- Мониторинг автоматизированного процесса очистки SPE и передачи продукции
- Проверьте, если картридж SPE промывают с 10 мл воды через V6, V11, и V12 в отходы, и если этанол elutes продукт в PCV через V5, V11, и V12. Наконец, обратите внимание, если 0,9% NaCl добавляется в PCV через V4, V11 и V12, чтобы разбавить продукт.
- Убедитесь, что решение продукта передается через V13 и стерильный фильтр в флакон конечного продукта с гелиевым потоком через V20.
- Подтвердите, что продукт был полностью передан.
3. Контроль качества (КК)
ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль качества радиофармацевтических препаратов включает в себя измерение следующих параметров:
- Радиохимическая чистота и моляровая активность (RP-HPLC)
- Остаточные растворители (газовая хроматография, ГК)
- Осмолальность (осмометр давления пара)
- рН (рН-метр)
- Чистота спектра/радионуклида (з-спектрометр)
- Полураспада / радионуклид чистоты (доза калибратора)
Все физико-химические параметры определяются до выпуска продукта, а значения должны быть в определенном параметре качества.
- Подготовка оборудования для контроля качества
- Начните подготовку за 30 минут до окончания синтеза.
- Приготовьте конический флакон в свинцовом защищенном контейнере и защищенный шприц объемом 1 мл с прикрепленной иглой.
- Подготовьте эталонное стандартное решение SNAP-7941 (10 мкгл-1) в воде для HPLC.
- Включите счетчик рН, газовый хроматограф и использованные газы, осмометр и все компоненты HPLC.
- Включите программное обеспечение управления HPLC и выберите выделенную колонку и соответствующий метод дляNo 11C'SNAP-7941 (мобильная фаза: (вода/ацетика 97,5/ 2,5 v/v; 2,5 г.Л.л.1 аммоний ацетат; рН 3,5)/ацетонитрий 70/30 v/v; поток: 1 мл/мин -1) и написать список образцов с двумя измерениями (стандарт и продукт). Запустите метод кондиционирования столбца.
- Введите 20 злиц референтного раствора SNAP-7941 со шприцем Hamilton после 10 мин кондиционирования и начните аналитический запуск.
- Вымойте шприц Гамильтона два раза с ацетонитрилом и водой после инъекции.
- Запустите программное обеспечение управления GC и напишите список примеров.
- Выполнение контроля качества
- Измерьте абсолютный радиоактивный выход продукта после окончания синтеза и перенесите 100 л продукта в реакционный флакон с подготовленным шприцем для контроля качества.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные, полученные в ходе контроля качества, должны быть задокументированы в соответствии с национальными правилами. - Аналитический HPLC: Измерьте радиохимическую чистоту и химическую чистоту и сообщите персоне ответственному для экспериментов культуры клетки немедленно результатов.
- Нарисуйте 40 зл и вводят в HPLC 40 qL образца КК. Начните пробег, перемещая руку инъекционного клапана от нагрузки к inject (рисунок3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время бега (8 минут), другие измерения протокола могут быть выполнены, чтобы избежать как можно больше распада, как это возможно. - Откройте хроматограмму и интегрируйте все пики в канал радиоактивности. Сравните время хранения продукта (5.0-7.0 мин) с временем удержания эталонного стандарта. Сравните область под кривой в процентах от всех интегрированных пиков. Пик продукта должен составить более 95% (радиохимическая чистота) от общего интегрированного участка (радиоканала).
- Интегрируйте сигнал в УФ-канал для определения химической чистоты. Основной примеси, как правило, предшественник SNAP кислоты на 2,8-3,5 мин. КонцентрациянатC'SNAP-7941 рассчитывается из кривой калибровки после интеграции. Рассчитайте концентрацию SNAP-7941 в «мололимл-1» и определите активность моляра с помощью следующего уравнения:
- Нарисуйте 40 зл и вводят в HPLC 40 qL образца КК. Начните пробег, перемещая руку инъекционного клапана от нагрузки к inject (рисунок3).
- Для газовой хроматографии перенесите 20 зл и контроля качества в специальный стеклянный флакон. Поместите его в автосэмпере и начните измерение. После завершения измерения откройте хроматограмму и запишите числа автоматически интегрированных пиков. Образец не должен содержать более 410 ppm ацетонитрила и 10% этанола.
- Осмолальность: Положите бумажный образец диска на выделенную полость и нанесите 10 зл и на образец. Нажмите кнопку "Закрыть" для измерения осмолальности. После 3 мин, устройство отображает осмолинность, которая должна быть в диапазоне 190-500 мхм кг-1.
- рН: Вымойте электрод водой. Измерьте рН, поставив электрод в образец. РН должен быть в диапазоне 5,0-8,5. Вымойте электрод снова после измерения и поместите электрод в референтный раствор рН.
- В-спектр: Поместите образец КК в спектрометр, откройте программное обеспечение для управления и начните измерение. Остановите измерение и запишите измеренную энергию, которая должна быть 511 кеВ (диапазон 420-520 кеВ). Откройте меню файла и обезопасите файл с соответствующим номером партии. Вспомните сохраненный спектр в специальном программном обеспечении и распечатайте спектр.
- Период полураспада: Измерьте активность образца КК два раза с помощью калибратора дозы. Запишите соответствующие времена и вычислите период полураспада экспоненциального.
- Измерьте абсолютный радиоактивный выход продукта после окончания синтеза и перенесите 100 л продукта в реакционный флакон с подготовленным шприцем для контроля качества.
- Выпуска
- После того, как все параметры были проверены и результаты в соответствии с руководящими принципами австрийских властей, освободить radiotracer. Оператор должен подписать правильность данных.
4. Оценка взаимодействия с транспортером P-gp
- Культура сотовой связи
- Начните ламинарный поток воздуха (LAF) рабочей скамьи и очистите скамейку не менее 15 минут, прежде чем приступить к работе.
- Смешайте среднюю среду клеточной культуры в стерильных условиях в LAF с 10% FCS (50 мл) и 0,5% антибиотиков (2,5 мл) со стерильной объемной пипеткой с помощью автоматизированной помощи пипетки.
- Оттепель MDCKII-hMDR1 и MDCKII-WT клетки и культивировать в T75 или T175 клеточной культуры колбу 10-14 дней до экспериментов в асептических условиях (LAF).
- Изменение среды на следующий день, чтобы удалить все не приверженцы и апоптотические клетки.
- Замените каждые три дня среду на свежую (12 мл для T75 и 23 мл для колбы культуры т175, соответственно).
- Разделите клетки в соответствии с графиком экспериментов на свежие колбы или к посудам клеточной культуры при слиянии 80%, чтобы избежать двуслойности.
- Подготовка клеток к экспериментам
- Разделите клетки за два дня до начала экспериментов и семена в концентрации 2,5 х 105 ячеек на 2 мл в косой плоскости тарелки клеточной культуры (рисунок4). Используйте автоматическое устройство счетчика ячеек или камеру подсчета голосов Neubauer для подсчета ячеек и расчета соответствующего коэффициента расщепления.
- Удалите среду за день до экспериментов, вымойте клетки на культурном блюде с 4 мл DPBS и добавьте свежие 5 мл среды клеточной культуры. Поместите блюдо горизонтально в инкубатор.
- Вымойте клетки с DPBS по крайней мере 0,5 ч до экспериментов и заменить 2 мл FBS свободной среде. Изучите слияние и морфологию клеток с помощью микроскопа.
- Выполнение экспериментов в трех различных установках.
- Используйте чашку Петри для экспериментов, описанных в 4.2.3.
- Лечить клетки в течение 0,5 ч перед экспериментами с 10 мкм (я)-вераполил гидрохлорид.
- Добавьте в ДМСО 0,98 л раствора запасов верапамиля (20,4 мм) -верапамил гидрохлорид в ДМСО). Окончательное содержание DMSO составляет 0,05% во время лечения.
- Инкубировать клетки на 0,5 л с управлением транспортным средством (DMSO). Используйте тот же объем, что и для лечения препарата.
- Эксперименты в режиме реального времени (для всех трех установк)
- Включите устройство, компьютер и убедитесь, что они правильно подключены, а затем открыть программное обеспечение управления.
- Выберите опцию One Target, разблокируйте шаблон и отрегулируйте следующие настройки:
Количество позиций: 2 (два)
Время обнаружения (сек): 3 (три)
Время задержки обнаружения (ы): 2 (два)
Название первого этапа: базовый - Вставьте блюдо культуры клетки в наклонную поддержку прибора, убеждаясь что полюс клетки находится на нижней стороне и покрыно с средой культуры клетки.
- Запустите запуск с помощью кнопки «Пуск». Система просит сохранить файл. Выберите имя файла и путь сохранения. Центр управления всплывает и начинается базовое измерение (поддержка клеточной культуры начинает вращаться).
- Выберите по другим опциям:
Шкала времени: минуты
Коррекция нуклидов: углерод-11 - Проверьте все коробки под кривыми на графике (фон (красный), целевой (синий) и целевой минус фон (черный)).
- Получить параметры контроля качества: моляровская активность «GBq.»mol-1» и концентрация активности »MBq.mL-1» в конце синтеза.
- Рассчитайте соответствующий объем трассировщика на 15 нм отnatC'SNAP-7941 в объеме ассса 2 мл.
- Подготовьте пипетку к соответствующей объему и аликоту продукта No11C'SNAP-7941 в свинцовой защите.
- Нажмите Пауза запустить в окне центра управления. Подождите, пока блюдо вращения останавливается и боковой бар с названием Приостановлено и следующий этап происходят.
- Откройте крышку кинетической устройства в режиме реального времени. Поверните культурный блюдо поддержки 90 "влево. Добавьте рассчитанный объем трассировщика и вернитесь к исходной позиции. Затем закройте крышку устройства. Немедленно нажмите кнопку «Продолжить» для начала эксперимента.
- Завершите эксперимент через 20 минут, выбрав паузу, а затем прекратите запуск (нажмите End Run в боковой панели).
- Анализ и обработка данных с использованием статистического программного обеспечения
- Откройте программное обеспечение для управления в режиме реального времени. Нажмите на Открытые файлы, чтобы напомнить о требуемой кинетике. Кинетика иллюстрируется в окне центра управления.
- Выберите по правому щелчку прямо на кривыхэкспорта кинетики. Сохраните текстовый файл, содержащий необработанные данные. Откройте программу статистики и вставьте необработанный файл данных экспериментов в реальном времени.
- Начните со времени (x-оси) при добавлении радиотрака (исключите фоновое измерение) и нормализуйте до процентного сигнала максимального CPS (рассчитывает в секунду).
- Загрузите все нормализованные данные в новый файл GraphPad Prism.
- Рассчитать средние значения и стандартное отклонение.
- Проиллюстрировать полученные данные в виде графика, показывающего отклонение (скорость увеличения) поглощения трассировщика всех трех установленных исправления.
Representative Results
Полностью автоматизированный радиосинтезNo 11C'SNAP-7941 дал 5,7 и 2,5 ГБК (4,6 и 2,0% в EOB, 14,9 и 5,9% на основе11C'CH3OTf; n - 10) сформулированного продукта. Общий синтез длился около 40 минут, где 15 мин были необходимы для подготовкиNo 11C CH3OTf с помощью метода газовой фазы, еще 5 мин были необходимы для радиомаркировки предшественника, а затем 10 мин полу-препаративного RP-HPLC очистки и 10 мин для c18 картридж твердой фазы извлечения и разработки. Затем, небольшой aliquot (приблизительно 100-200 QL) был доставлен к лицу, ответственному за контроль качества, в то время как оригинальный флакон продукта, содержащий готовый к использованию трассировщик был передан экспериментатору кинетический анализ в реальном времени.
Контроль качества был завершен в течение 10 минут после окончания синтеза. Моляровская активность была в диапазоне 72 и 41 ГБК/моль (н No 10), а радиохимическая чистота всегда была Все остальные параметры (рН, осмолность, остаточные растворители) соответствовали критериям выпуска. Для кинетической ассеии в режиме реального времени были выбраны три различных экспериментальных установки: (A) обработанные и необработанные (транспортные средства) клетки MDCKII-WT, (B) необработанные или обработанные клетками MDCKII-hMDR1 и (C) последней клеточной линией с блокированием до реального времени кинетическое асссис транспортера с использованием (я)-верапамил. Применение No11C'SNAP-7941 к линии клеток дикого типа MDCKII-WT (P-gp non-expressing) и MDCKII-hMDR1 (P-gp expressing) показывает различное кинетическое поведение, так как происходит быстрое накопление линии клеток дикого типа, в то время как накопление не наблюдалось для клеток MDCKII-hMDR1. Тем не менее, блокирование P-gp efflux транспортер в MDCKII-hMDR1 клетки с (я)-verapamil привело к сопоставимым в режиме реального времени кинетические, как уже видели для линии клеток wildtype (Рисунок 5).
Рисунок 1: Обзор рабочего потока. Рабочий поток радиосинтеза, контроль качества и выполнение кинетической измерения в реальном времениNo 11C'SNAP-7941. Черные стрелки указывают транспортный путь радиоактивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Радиосинтетическая схема автоматизированного синтезатора. Переключение цепи автоматизированного синтезатора, начиная с блока циркуляции дляNo 11C CH3I /11C CH3OTf производства, реактора для внедрения деятельности в раствор прекурсора и SPE очистки (SPE твердая фаза извлечения; PCV - флакон для сбора продукции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представительные хроматограммы полностью автоматизированного радиосинтезаNo 11C'SNAP-7841. Полупрепаративная хроматограмма RP-HPLC иллюстрируется в верхней и аналитической после очищения на дне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Подготовка блюда клеточной культуры для экспериментов в реальном времени. Шаг 1 включает в себя посев 2,5 х 105 до 1 х 106 в зависимости от типа ячейки и их темпов роста. Впоследствии, блюдо культуры помещается в косой плоскости (примерно 30-45 " ). Поэтому поставляемый металлический аппарат или крышка блюда клеточной культуры могут быть использованы в инкубаторе для стабилизации наклонного положения блюда. На следующий день после (24 ч) блюдо регулируется горизонтально, и свежая среда культуры клеток добавляется, чтобы полностью покрыть поверхность клетки. В день эксперимента исследуются жизнеспособность и слияние клеток. Согласно экспериментальному протоколу, клетки промывают dPBS, среда заменяется сывороточной средой (2 мл), а культурное блюдо перемещается в косое положение до начала экспериментов. Отныне клетки можно лечить с помощью ингибитора или транспортного средства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Кинетические измерения в реальном времениNo 11C'SNAP-7941. Представительная кинетика в реальном времени No11C'SNAP-7941 показана в трех различных установках: с использованием клеток MDCKII-WT; Клетки MDCKII-hMDR1 предварительно блокируются с помощью (я)-вераполила в виде ингибитора P-gp и mdCKII-hMDR1 без блокировки. Оси y иллюстрирует скорость увеличения предварительно заблокированных клеток MDCKII-hMDR1 и WT по сравнению с результатами необработанных или обработанных транспортными средствами клеток MDCKII-MDR1, соответственно (без поглощения, 0%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Радиосинтез No11C'SNAP-7941 был создан на коммерческом модуле синтеза. Благодаря возможности полной автоматизации процедуры приготовления радиосинтез был надежно надежен, и были достигнуты улучшения в области радиационной защиты оператора. Подготовка синтезатора оказывает огромное влияние на качество радиотрактора, особенно с точки зрения молярной активности. Таким образом, необходимо постоянно работать в инертных условиях (например, атмосфера гелия) и промывка всех линий, расположенных до реакционного сосуда (целевая линия, производственный цикл И реакторnoNo11CCH3I (см. рисунок2).). Кроме того, нагревание соответствующих ловушек и печей перед началом синтеза для удаления влаги и атмосферного углерода выгодно повышает активность моляров. Особенно столбец AgOTf, пропитанный графитным углем, чрезвычайно чувствителен к влажности. Даже незначительные количества любого источника влаги нарушают преобразованиеNo 11C'CH3I в11C'CH3OTf. Перед началом синтеза ловушкаNo 11C'CO2 и ловушкаNo 11C'CH3I должны быть охлаждены до комнатной температуры снова, чтобы обеспечить последующее улавливание. Кроме того, рекомендуется растворить предшественник незадолго до начала синтеза и добавить основание непосредственно в раствор прекурсора.
Контроль качества радиочастот углерода-11 должен быть рационально разработан для непрерывного и быстрого рабочего процесса. Однако наиболее важными параметрами для исследований клеточной культуры являются радиохимическая чистота и моляровая активность для получения достоверных результатов. Правильная оценка молярной активности требует надежного аналитического метода HPLC, а кривая калибровки должна охватывать диапазон концентрации конечного продукта. Сложная часть для радиочастот заключается в достижении концентрации выше предела количественной оценки (ЛОЗ) за счет небольших количеств, которые производятся во время радиосинтеза. Таким образом, искусство заключается в том, чтобы найти баланс между высокой молярной деятельности, чтобы избежать насыщения рецепторов и достаточно высоких концентраций, чтобы все еще быть в состоянии количественно нерадиоактивного сигнала.
11С. SNAP-7941 был подтвержден как мощный субстрат человека P-gp транспортер, как не было обнаружено накопления в необработанных или транспортных средств лечения MDCKII-hMDR1 клеток из-за быстрого efflux. В отличие от этого, оба экспериментальных установки (MDCKII-WT или предварительно заблокированных клеток MDCKII-hMDR1) дали аналогичные результаты (накопление11C'SNAP-7941), поддерживая универсальность этого анализа in vitro. Клетки MDCKII-hMDR1 очень подходят для экспериментов LigandTracer из-за их стабильной трансфекции, быстрого роста и стойких против сдвига стресса, вызванного вращающейся клеточной культуры блюдо. Отсутствие поглощения11C'SNAP-7941 в мозге крыс и мышей может, таким образом, произойти, вызванные efflux через P-gp транспортер. Из-за трансфекции клеток собачьих почек с человеческим мультинаркотической резистентностью белка 1 (hMDR-1, P-gp), прогностического значения этого метода для связывания транспортера эффлюкса у человека высока, что благоприятно с точки зрения будущего клинического применения. Однако до сих пор избирательность по отношению к другим транспортеру эффлюкса не была проверена. Таким образом, другие линии клеток могут быть использованы, выражая различные видные транспортеры efflux как белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP) или многократное сопротивление белка-1 (MRP-1), для изучения взаимодействия с этими транспортерами. Метод по сравнению с классическим накоплением или транспортным анализом очень прост и дает сразу качественные результаты. Кроме того, самым большим преимуществом является то, что эта технология позволяет оценивать прямое взаимодействие ПЭТ-трекера и цели в режиме реального времени, в отличие от обычного эксперимента с использованием косвенной количественной оценки (в основном смещения). Кроме того, программное обеспечение радиоассава в реальном времени обеспечивает экспериментальную гибкость (например, коррекция распада нуклидов, измерение времени и позиций и т.д.) и, следовательно, высокую свободу для пользователей. С другой стороны, ограничения метода включают низкую пропускную стоимость образца, так как одновременно можно измерить только одну клеточную тарелку. Кроме того, следует принять во внимание ряд других технических и оперативных вопросов: описанная технология очень чувствительна к фоновой радиации; таким образом, источники излучения должны храниться на расстоянии, и следует уделять особое внимание фоновым измерениям до проведения эксперимента. Другой вопрос, касающийся экспериментов при более высоких температурах, чем комнатная температура, является нагревание наклонной поддержки: испарение среды клеточной культуры может повлиять на детектор. Вместо нагрева, все устройство предпочтительно помещается в инкубатор. Кроме того, метод ограничен линиями клеток приверженцев. Через вращение тарелки культуры клетки, сдвига чувствительных к стрессу клетки могут отделиться от блюда, что может привести к недействительным результатам.
Тем не менее, если экспериментатор обращает внимание на эти незначительные недостатки, метод дает быстрые и надежные результаты для анализа кинетического поведения доклинических ПЭТ-трассеров.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Австрийским научным фондом (FWF P26502-B24, М. Миттерхаузер). Мы благодарны за техническую поддержку Т. Зенца и А. Кркала. Кроме того, мы благодарим К. Паллича за подготовку Аготфа и Х. Шпрейцера за распространение предшественника.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
| Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
| Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
| Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
| Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
| NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
| Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
| Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
| Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
| Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
| Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
| Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
| PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| [11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
| TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
| Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
| Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
| NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
| Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
| 430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
| Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
| Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
| g-spectrometer | g-spectrometer | ||
| Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
| Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
| Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
| HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
| inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| In vitro experiments | |||
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| (±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
| DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
| Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
| LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
| Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
| Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |
References
- Saito, Y., Maruyama, K. Identification of melanin-concentrating hormone receptor and its impact on drug discovery. Journal of Experimental Zoology. 305, 761-768 (2006).
- Philippe, C., et al. Preclinical in vitro & in vivo evaluation of [11C]SNAP-7941 - the first PET tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1. Nuclear Medicine and Biology. 40, 919-925 (2013).
- Philippe, C., et al. Radiosynthesis of [ 11C]SNAP-7941-the first PET-tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1 (MCHR1). Applied. Radiation and Isotopes. 70, 2287-2294 (2012).
- Philippe, C., et al. SNAPshots of the MCHR1 : a Comparison Between the PET-Tracers [ 18 F ] FE @ SNAP and [ 11 C ] SNAP-7941. Molecular Imaging Biology. , 1-12 (2018).
- Schirmer, E., et al. Syntheses of precursors and reference compounds of the melanin- concentrating hormone receptor 1 (MCHR1) Tracers [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP for positron emission tomography. Molecules. 18, 12119-12143 (2013).
- Miller, P. W., Long, N. J., Vilar, R., Gee, A. D. Synthese von 11C-, 18F-, 15O- und 13N-Radiotracern für die Positronenemissionstomographie. Angewandte Chemie. 120, 9136-9172 (2008).
- Pichler, V., et al. An overview on PET radiochemistry: part 1 - covalent labels - 18 F, 11 C, and 13 N. Journal of Nuclear Medicine. 59, 1350-1354 (2018).
- Pichler, V., et al. Molar activity - The keystone in 11C-radiochemistry: An explorative study using the gas phase method. Nuclear Medicine and Biology. 67, 21-26 (2018).
- Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied Radiation and Isotopes. 48, 153-157 (1997).
- Dahl, K., Halldin, C., Schou, M. New methodologies for the preparation of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals. Clinical and Translational Imaging. 5, 275-289 (2017).
- Raaphorst, R. M., et al. Radiopharmaceuticals for assessing ABC transporters at the blood-brain barrier. Clinical. Pharmacollogy & Therapeutics. 97, 362-371 (2015).
- Nics, L., et al. Speed matters to raise molar radioactivity: Fast HPLC shortens the quality control of C-11 PET-tracers. Nuclear Medicine and Biology. 57, 28-33 (2018).
- Zeilinger, M., et al. New approaches for the reliable in vitro assessment of binding affinity based on high-resolution real-time data acquisition of radioligand-receptor binding kinetics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Research). 7, 22 (2017).
