Summary
Мы оптимизировали протокол для изоляции и очистки курино-сердечных перицитов для фундаментальных исследований и исследования их биологии и терапевтического потенциала.
Abstract
Перициты, периваскулярные клетки микрососудов и капилляров, как известно, играют определенную роль в ангиогенезе, стабилизации сосудов и эндотелиальной барьерной целостности. Тем не менее, их ткани конкретных функций в сердце не очень хорошо понимают. Кроме того, в настоящее время нет протокола, в который используются легкодоступные материалы для изоляции и очистки перицитов сердечного происхождения. Наш протокол фокусируется на использовании широко используемой модели млекопитающих, мыши, в качестве нашего источника клеток. Используя ферментативное пищеварение и механическую диссоциацию тканей сердца, мы получили сырую клеточную смесь, которая была дополнительно очищена флуоресценцией активации клеточной сортировки (FACS) множеством маркеров. Поскольку нет единого однозначного маркера для перицитов, мы закрыты для клеток, которые были CD31-CD34-CD45-CD140bиNG2иCD146. После очистки, эти первичные клетки были культивированы и проходили несколько раз без каких-либо изменений в морфологии и выражении маркера. С возможностью регулярно получать первичные перициты сердца морин с помощью нашего протокола, мы надеемся еще больше понять роль перицитов в сердечно-сосудистой физиологии и их терапевтический потенциал.
Introduction
Перисосудистые клетки, известные как перициты, окружаютмикрососуды и капилляры сосудистого дерева 1,2. Физиологически, они, как известно, содействовать и играть роль в ангиогенезе, увеличение барьер целостности из-за их тесной связи с эндотелиальными клетками, а также стабилизации и зрелых сосудов1,2. Кроме того, дисфункция и / или потеря этих клеток были вовлечены в таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера2,3 и различных сердечно-сосудистых заболеваний4. Эти клетки находятся по всему телу, но номера клеток зависят от тканей. Перициты наиболее заметно изучены в головном мозге из-за высокой васкуляризации гематоэнцефалического барьера1,2. Однако в сердце недостаточно изучена биология перицитов.
В последнее время, Есть повышенный интерес в области сердечных перицитов, но в настоящее время нет обтекаемого протокола для их изоляции от одного из наиболее часто используемых инструментов в биологии - мыши. Есть протоколы в литературе по изоляции перицитов из мозга5,сетчатки6,плаценты7,и скелетной мышцы8,9; однако, несколько протоколов находятся на изоляции перицитов от сердца. Есть несколько групп, которые изолировали сердечные перициты. Nees et al. смогли изолировать обильное количество сердечных перицитов от нескольких видов, включая мышь; однако, их методы использовали специфическое встроенное оборудование которое уменьшает reproducibility10. Avolio et al.11, Chen et al.12, и Baily et al.13 также успешно изолировали сердечные перициты из тканей сердца человека, но человеческие ткани не всегда доступны и трудно получить для некоторых исследователей. Здесь мы разработали метод изоляции для получения сердечных перицитов от моделей мыши для исследователей для дальнейшего изучения их биологии с легкодоступными материалами.
Используя ферментативное пищеварение и флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS) с известными ключевыми маркерами перицита14, наш протокол позволяет изолировать и очистить популяцию перицитов, которые характеризуются CD31-CD34-CD45- CD140b-NG2-CD146. Наша панель маркеров содержит как маркеры включения, так и исключения. CD45 используется в качестве маркера для исключения гематопоитических клеток. CD31 используется в качестве маркера для исключения эндотелиальных клеток. CD34 используется в качестве маркера для исключения как гематопоитических, так и эндотелиальных клеток-прародителей. CD146 является маркером периваскулярных клеток. Наконец, NG2 и CD140b (также известный как тромбоциты производных рецепторов роста рецепторбета бета - PDGFR) оба приняты маркеры для перицитов14. Полученная первичная культура может быть культивирована и пронизана несколько раз без каких-либо изменений в морфологии или выражении маркера. Кроме того, эти клетки могут быть совместно культивированы с эндотелиальными клетками для изучения их взаимодействия и перекрестного разговора друг с другом. Этот метод изоляции клеток позволит следователям изучить биологию и патофизиологию сердечных перицитов от дикого типа, болезни и генетически вариант мыши моделей.
Protocol
Все животные были размещены и использованы в Ассоциации по оценке и аккредитации лаборатории животных Уход Международной (AAALAC) аккредитованных объекта и все работы животных была проведена под соответствующим ветеринарным надзором и под институциональным животных Комитет по уходу и использованию (IACUC) утвердил протокол Amgen Inc.
1. Подготовка инструментов и культуры СМИ
- Автоклав хирургические 9 см прямой кончик тонкой точки ножницы и 10 см угловой зубчатые щипцы.
- Добавьте 25 мл 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 5 мл 1% пенициллина стрептомицина (P/S) в 500 мл бутылки магния кальция бесплатно Dulbecco в фосфат-буферный солен (CMF-DPBS). Поместите раствор в ледяную ванну, чтобы убедиться, что будет холодно во время использования. Aliquot 50 мл в 50 мл конической трубки для изоляции сердца. Добавьте в 250 единиц/мл раствора гепарина натрия в аликот 50 мл. Это будет называться гепаринацией CMF-DPBS.
- Добавьте 20% FBS (100 мл) и 1% P/S (5 мл) в бутылку 500 мл с высоким содержанием глюкозы Dulbecco в модифицированной среде орла (DMEM). Это будет называться фермент-свободной культуры средств массовой информации. Аликот 20 мл DMEM 20% FBS и 1% P/S и добавить в 500 мкг/мл коллагеназы B. Это будет называться ферментным раствором. Держите как без ферментов культуры средств массовой информации и ферментного раствора теплопри 37 градусов по Цельсию в инкубаторе или водяной бане.
2. Подготовка животных и закупка сердечной ткани
- Интраперитонеально вводят мышь с 250 единицами раствора гепарина натрия со шприцем 31 G. Затем подождите 10–15 минут, пока мышь останется активной в своей домашней клетке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные в этом исследовании были получены от 4-месячного самца C57BL/6 мыши. Тем не менее, этот протокол может быть использован на любой мыши, независимо от напряжения, возраста, пола, веса и т.д. - Анестезируйка мыши с 5% изолюран. Проверьте глубину анестезии мыши с помощью щепотку рефлекса.
- Поместите обезопаживающую мышь в положение на спине и засунитесь на передние конечности. Тщательно откройте грудную полость и канюль нисходящего аорты с помощью 25 G иглы бабочки.
- Сделайте ник в правом предсердии и наполнить сердце, по крайней мере 20 мл 250 единиц / мл гепаринизированных CMF-DPBS на 2 мл / мин с переменной поток перистальтический насос. Когда PBS выходит из правого притязания чистой, перфузия завершена.
- Вырежьте сердце на аорте и поместите его в ледяной CMF-DPBS.
3. Диссоциация тканей сердца
- Перенесите сердце в чашку Петри высотой 15 см х 15 см. Разрежьте сердце на крошечные кусочки (1 мм/кусок) с помощью пружинных ножниц и тонких точечных щипцы с достаточным ферментным раствором, чтобы покрыть кусочки (10-15 мл).
- Перенесите кусочки и раствор в коническую трубку мощностью 50 мл, уплотните парафиновой пластиковой пленкой и инкубинуприт при 37 градусах Цельсия на орбитальном шейкере при 120 об/мин в течение 75 мин.
- После коллагенеза пищеварения с ферментным раствором, decant жидкости через 100 мкм ячейки ситечко в новую трубку 50 мл, но оставить достаточное решение, чтобы убедиться, что куски не высохнут.
- Используя тонкие щипточки, выньте ткань от пробки и уместите немного частей на слайде микроскопа. Затем измельчить ткани между двумя слайдами микроскопа, чтобы разбить ткани. Промыть слайды с ферментом свободной культуры средств массовой информации в новый 50 мл конической трубки.
- Повторите шаг 3.4 до тех пор, пока все части ткани не будут разобщены.
- Объедините растворы со ступеней 3,3–3,5 в одну трубку. Процедить полученную подвеску через 100 мкм-ситечко в новую коническую трубку мощностью 50 мл.
- Центрифуга при 220 х г,4 кв. м, в течение 5 мин. Аспирируйте предыдущее решение и аккуратно resuspend клеточные гранулы в свежих ферментов свободных культуры средств массовой информации.
- Подсчитайте ячейки и проверьте жизнеспособность с помощью счетчика клеток. Разбавлять клетки до 1 х 106/мл с холодным окрашиванием FACS буфера, содержащего 500 мл DPBS и 10-25 мл 2-5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Клетки готовы к окрашиванию и сортировке.
4. Очистка перицитов от сырой смесии с использованием FACS
- Подготовка и маркировка 5 мл трубки FACS для всех элементов управления и образцов клеток. Aliquot из клеток (1 мл клеток на трубку) для неокрашенных образца, флуоресценция минус один (FMO) контроля, и изотип-соответствующие управления. Используйте оставшиеся ячейки для такого рода. Все элементы управления и образцы могут быть подготовлены и окрашены в то же время.
Примечание:В общей сложности 13 мл при 0,5 x 106клетки/мл использовались для репрезентативного сортировки из одного сердца. Тем не менее, объем зависит от того, сколько клеток следователь получает от их изоляции, сколько сердец они используют, и насколько хорошо сердечная ткань переваривается; размер каждого сердца также является переменной, которая может изменить громкость.- Используйте компенсационные бусы(Таблица материалов) для оптимизации контроля компенсации флуоресценции. Подготовьте один контроль компенсации для каждого фторхрома в эксперименте в с пометкой 5 мл трубки FACS. Для этого эксперимента, подготовить в общей сложности 9 компенсационных элементов управления - 2 вида неокрашенных бусин плюс 7 различных флюорохромов из маркерной панели, включая NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, и жизнеспособность клеток-APC-Cy7 ( Таблица материалов).
- Добавьте одну каплю компенсационных бусин (50 л) из флакона выжать в каждую трубку. Затем добавьте в бисер 1 кл.л. антитела. Повторите для каждого антитела от маркера панели. Смешайте энергично импульс-вихрь. Инкубировать в течение 30 минут при температуре 4 градусов по Цельсию, защищенном от света, за исключением шариков жизнеспособности клеток, которые можно оставить при комнатной температуре, защищенной от света.
- Затем добавьте 3 мл буфера окрашивания FACS к каждой трубке и центрифугу при 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Присвоить раствор и присвоить каждый бис гранулы в 400 л faCS окрашивания буфера. Контроль компенсации готов к использованию. Продолжайте на льду.
- Используйте элементы управления FMO для оптимизации фонового окрашивания из-за спектрального перекрытия.
- Подготовка FMO управления с помощью 1 мл клеток, которые были aliquoted из раздела 4.1 в 5 мл FACS трубки и добавления во всех антител из маркера панели описаны в шаге 4.1.1 на 1:100 разбавления, но за исключением одного антитела. Например, подготовить NG2-AF488 FMO, включив антитела для CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, красителя жизнеспособности клеток, но не антитела NG2-AF48. Смешайте осторожно путем пульс-вихря. Повторите для каждого антитела в общей сложности 7 элементов управления. Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию, защищенного от света.
- Затем добавьте 3 мл буфера окрашивания FACS к каждой трубке и центрифугу при 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Призадыхайся от раствора и приостановите каждую клетку гранулы в 400 л faCS окрашивая буфер. Элементы управления FMO готовы к использованию. Продолжайте на льду.
- Используйте изотип-сопоставленные антитела управления(Таблица материалов) для неспецифического окрашивать.
- Подготовка изотипа управления путем добавления изотип-соответствует контрольных антител (Таблица материалов) до 1 мл образца клеток, подготовленных из раздела 4.1 в 1:100 разбавления каждый в 5 мл ТРУБКи FACS. Смешайте осторожно путем пульс-вихря. Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию, защищенного от света.
- Затем добавьте 3 мл буфера окрашивания FACS к каждой трубке и центрифугу при 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Призадыхайся от раствора и приостановите каждую клетку гранулы в 400 л faCS окрашивая буфер. Элементы управления изотипом готовы к использованию. Продолжайте на льду.
- Подготовка клеток для сортировки путем добавления антитела коктейль для свежеизолированных клеток.
- Подготовка образец ячейки из раздела 4.1, добавив в антитела коктейль, содержащий анти-мышь NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 в 1:100 разбавления каждого и жизнеспособности клеток краситель в 1:1,000 разбавления. Аккуратно вихрь для смешивания. Инкубировать образцы при 4 градусах по Цельсию в течение 30 минут, защищенных от света.
- После окрашивания, мыть клетки с FACS окрашивая буфер центрифугирование на 300 х г в течение 5 мин 4 кв. C. Приготовьте раствор и resuspend клеточные гранулы в FACS окрашивая буфер до 0,5 х 106 ячеек/мл.
- Использование новых труб FACS, которые имеют 35 мкм фильтр вершины, pipette окрашенных образцов клеток на крышки и гравитации фильтратом для получения одной ячейки суспензии. Продолжайте на льду.
- Используйте компенсационные бусы(Таблица материалов) для оптимизации контроля компенсации флуоресценции. Подготовьте один контроль компенсации для каждого фторхрома в эксперименте в с пометкой 5 мл трубки FACS. Для этого эксперимента, подготовить в общей сложности 9 компенсационных элементов управления - 2 вида неокрашенных бусин плюс 7 различных флюорохромов из маркерной панели, включая NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, и жизнеспособность клеток-APC-Cy7 ( Таблица материалов).
- Используйте сортировку клеток для очистки клеток.
- Запустите неокрашенные ячейки на сортирующем сортере ячейки, чтобы установить напряжение и исправить фоновый сигнал (например, установите напряжение для переднего рассеяния до 490–560 и для бокового рассеяния до 180–250).
- Запустите каждый одноцветный образец компенсации по одному, чтобы настроить напряжение для каждого канала и настроить ворота для положительного сигнала. Сбор данных. Используйте программное обеспечение для расчета для спектрального перекрытия путем расчета матрицы компенсации. Все напряжения готовы и установлены.
- Выполнить каждый изоттип управления по одному, и эти данные могут быть использованы для настройки ворот для неспецифических связывания, если таковые имеются.
- Запустите каждый образец FMO по одному в то время и настроить напряжение для каждого канала, чтобы исправить для спектрального кровотечения через из-за многоцветной панели.
- Запустите образцы окрашенных клеток в сортировке клеток и соберите клетки в 10 мл без ферментов культуры носителей (DMEM 20% FBS и 1% P / S) в 15 мл конической трубки сбора. Используйте следующую стратегию gating: ворота для одиночных ячеек, ворота для живых ячеек, ворота для CD45 отрицательных ячеек, ворота для CD34 и CD31 отрицательных ячеек, ворота для положительных клеток NG2, и окончательно шлюпки для cd146 и CD140b положительных клеток.
5. Культивирование перицитов
- Пальто 24-хорошо пластины с 0,2% желатин на 5 мин и аспирированный с желатин раствором. Семена свежеполученных клеток со ступени 4.2.5 в DMEM и 20% FBS - 1% P/S до 2 х 104 ячеек/см2. Культурные клетки в клеточном инкубаторе установлены на уровне 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 и 95% O2.
- Пропуск перицитов
- После того, как клетки 95% сливаются, мыть клетки с теплой 1x DPBS, и поднять клетки с 200 зл 0,1% трипсин в каждом колодце при комнатной температуре в течение 3'5 минут.
- Аккуратно коснитесь пластины, чтобы ослабить клетки.
- Нейтрализовать трипсин с 3,5x количество культуры средств массовой информации (700 Л L DMEM 20% FBS 1% P / S) и семян прохода двух (P2) клетки на непокрытую 6-хорошо пластины на 2 х 10 104 клетки / см2.
- Каждая скважина, при слиянии, может быть перемещена в одну колбу Т-75 в виде ячеек P3, которые затем могут быть разделены в соотношении 1:6.
6. Характеристика перицитов
-
Анализ цитометрии потока
- Используйте тот же протокол окрашивания FACS и стратегию gating, как ранее описано в разделе 4.
- Выполнить элементы управления и окрашенные образцы на цитометр потока. Сбор данных и анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа(Таблица материалов).
- Для сбора ярких изображений, растут клетки в колбе в клеточном инкубаторе, установленном на уровне 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 и 95% O2. Захват изображений на микроскоп после клетки прикрепляются к поверхности.
-
Иммуноцитохимия
- Выращивайте клетки в 96-хорошей пластине до 90% слияния. Вымойте клетки с теплым 1x DPBS и исправить с 4% параформальдегида в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Вымойте клетки 3x с 1x DPBS и permeabilize с 0,1% моющего средства в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Инкубировать клетки с блокирующим буфером на 1 ч при комнатной температуре. После блокирования, добавить первичные антитела (один антитела на хорошо) разбавленной 1:100 в блокирующем буфере и инкубировать при 4 градусах Цельсия в одночасье. Первичные антитела: анти-NG2, анти-CD140b, анти-CD31, анти-виментин, анти-десмин, и анти-альфа гладкий мышечный актин.
- На следующий день, мыть клетки 3x с мытьем буфера (Таблица материалов). Добавьте вторичные антитела, разбавленные 1:1,000 в блокирующий буфер и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. Вторичные антитела анти-кролика сопряжены с FITC.
- Вымойте клетки 3x с мытьем буфера. Добавьте 300 мкм ядерного пятна, разбавленного при температуре в 1:1 000 в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Вымойте клетки 3x с 1x DPBS и монтировать с монтажом средств.
- Изображения клеток с конфокальный микроскоп.
Representative Results
После ферментативного пищеварения и диссоциации всего сердца и до FACS очистки клеток, клетки сырой смеси, которая содержит много различных типов клеток от сердца (Рисунок 1A). После очистки и культивирования FACS клетки однородны. Они одноядерные, довольно плоские, и имеют типичный перицит ромбоидной морфологии(рисунок 1B).
Используя FACS, клетки очищаются до однородства. Неокрашенный образец контрольной ячейки используется для отображения стратегии gating(рисунок 2). Во-первых, мусор и дублеты были закрыты на основе передних и боковых распределений рассеяния. Затем мертвые клетки были закрыты из-за их амин реакции с красителем, который производит сигнал больше и более интенсивным, чем живые клетки. Из живых клеток, гематопоиэтики были закрыты, будучи CD45. Для дальнейшего удаления гематопогетических и эндотелиальных клеток, клеткиCD34 и CD31 были закрыты. Наконец, были выбраныклетки NG2и CD140b/CD146 для того, чтобы быть периваскулярными клетками с выражением типичных перицитных маркеров (рисунок3). Маркерпанели также тестировали на коронарных эндотелиальных клетках мыши в качестве элемента управления(Дополнительная диаграмма 1). Только около 1% сырой клеточной смеси состояло из перицитов после сортировки.
Чтобы подтвердить, что клетки действительно перициты, мы прошли клетки для дальнейшей характеристики. Клетки быстро росли, как только они достигли P3 в Т-75 колбы без изменений в жизнеспособности, как они стали старше(Дополнительный рисунок 2). По сравнению с перицитами человеческого мозга, клетки имели аналогичную морфологию(рисунок 4A). По сравнению с мышью и человеческими гладкими мышечными клетками, клетки имели различную морфологию(рисунок 4A). Существовали также не наблюдается изменений в морфологии или маркер выражения на P7, когда immunostained или по потоку цитометрии анализа после прохождения(Рисунок 4B,C).
Рисунок 1 : Сырые клетки против очищенных клеток. (A) Яркое поле изображение сырой смеси клеток после всего сердца ферментативного пищеварения и диссоциации, которая была культивируется в t25 колбу в течение 14 дней. (B) Яркое поле изображение однородной популяции сердечных перицитов после сортировки и культивирования после 14 дней. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Репрезентативные изображения АНАЛИЗА FACS неокрашенных клеток. Схематическое представление стратегии gating, используемой для очистки сырой клеточной смеси. Ворота для ячеек, которые являются однозначными, жить, CD45-, CD31-, CD34-, NG2,CD146 , и CD140b. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Репрезентативные изображения FACS анализа сырых клеток. Схематическое представление сортировки, используемой для получения однородной популяции сердечных перицитов. Примерно 1% сырых клеток CD31-CD34-CD45-CD140b-NG2иCD146. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Характеристика первичных изолированных сердечных перицитов (A) Брайтфилд изображения культивированных клеток из человеческого мозга (hPC) и мыши сердца (mPC) показывают аналогичные морфологии перицитных клеток, но различные морфологии от человека гладкие мышечные клетки hSMC) и мыши гладкие мышечные клетки (mSMC). Шкала бар 100 мкм. (B) Фенотипическая характеристика клеток на P7 иммуноцитохимии для перицитных маркеров. Шкала бар 100 мкм. (C) Анализ потока цитометрии перицитов на P7, где они были закрыты для отрицательных маркеров CD31, CD34, CD45 и положительные маркеры NG2, CD140b, и CD146. Население остается однородным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Репрезентативные изображения цитометрии потока анализа эндотелиальных клеток с помощью маркерной панели. В качестве контроля для связывающей специфичности маркеров использовалась коронарная эндотелиальная клеточная линия мыши. Используя ту же стратегию gating, которая была использована в сорте, за исключением положительных ворот для CD31 вместо отрицательных ворот, эндотелиальные клетки были отрицательными для CD45, CD34, NG2, CD140b и CD146, но положительные для CD31, как ожидалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная рисунок 2: Репрезентативные изображения цитометрии потока анализа различных проходов mPC. Первичные изолированные сердечные перициты были культивированы и проходили до прохода 12. Клетки были окрашены йодидом пропидий и проанализированы на цитометр потока. Контроль наячки представляет собой смесь мертвых клеток и живых клеток. Существенных различий в количестве жизнеспособных клеток между проходами не наблюдалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Discussion
Поскольку исследования на сердечных перицитах являются относительно новыми, роль перицитов в сердечно-сосудистой физиологии и патофизиологии еще предстоит определить. В других органах, они были показаны, чтобы играть ключевую роль в гомеостаза сосуда и перфузии1,2. По сравнению с литературой перицитов из других органов, таких как мозг, Есть значительно меньше публикаций на сердечных перицитов. Изоляция сердечных перицитов имеет решающее значение для понимания их функциональных характеристик и сигнальных механизмов. Таким образом, этот протокол предоставит следователям более простой способ получить доступ к сердечным перицитам из более легкодоступного источника ткани и продвигать исследования по их биологии. Это поможет ответить на вопросы о том, как сердечные перициты способствуют сердечного гомеостаза и патофизиологии, а также исследовать их терапевтический потенциал.
Популяция перицитов, изолированная от сердца мурина и характеризующаяся CD31-CD34-CD45-CD140b-NG2иCD146, была пройдена несколько раз (до P12 и все еще шла сильна), что не снижение жизнеспособности и распространяется быстро(Дополнительная рисунок 2). Клетки также были криозаморожены и восстановлены с по крайней мере 95% жизнеспособности. Тем не менее, мы предпочитаем использовать клетки P7 или моложе для наших экспериментов. Сравнивая яркие изображения наших перицитов с перицитами человеческого мозга, две клеточные линии имеют сопоставимую морфологию клеток(рисунок 4A),в то время как они отличаются в морфологии от гладких мышечных клеток (рисунок4A). Наши клетки P7 были охарактеризованы иммуноцитохимией для перицитных маркеров, некоторые из нашей панели FACS (NG2 и CD140b), а некоторые не в панели (vimentin, desmin, ЗСМА), и мы обнаружили, что клетки выразили перицитные маркеры гомогенно(рисунок 4B). Кроме того, наши p7 клетки были проанализированы поток цитометрии снова с той же маркерной панели для оценки изменений в выражении маркера из-за прохождения, и мы обнаружили, что не было никаких изменений (Рисунок 4C). Поэтому, как фенотипически, так и морфологически, наши клетки являются перицитами.
Исследования Nees et al.10,Avolio et al.11,Chen et al.12,и Baily et al.13 показали успешные изоляции сердечного перицита. Тем не менее, использование в доме пользовательских построенное оборудование, чтобы отделить перицитов от микросудов Nees et al.10 участие двух камер с насосами, которые проникнуты protease решение туда и обратно через сетку сетки стек, который было трудно повторить, как они не предоставили схематику и/или картину аппарата и того, как он был построен. Хотя Nees et al.10 успешно изолировали сердечные перициты многих видов, мы так и не смогли воспроизвести их метод. Наш шаг отряда перицитов в нашем протоколе просто использует орбитальный шейкер (чтобы разъединить все клетки), который доступен в большинстве, если не во всех лабораториях, с тканью и ферментным раствором в конической трубке, за которым следует механический шаг диссоциации. Существует не требуется пользовательский аппарат. Во-вторых, остальные протоколы включают в себя использование человеческих тканей и, таким образом, закупка человеческих тканей ограничивает следователей. Наш протокол представляет собой модификацию иоптимизацию текущих протоколов 9,12 с использованием моделей мыши (дикий тип, генетически модифицированные, больные) и материалов, которые легко доступны для всех исследователей.
Поскольку периваскулярные клетки в целом чувствительны, жизнеспособность клеток имеет решающее значение для получения хорошей урожайности. Во время закупок сердечной ткани и окрашивания клеток, ткани / клетки должны быть сохранены ледяной. Во-вторых, ферментативное пищеварение тканей может потребовать оптимизации на индивидуальной основе. В зависимости от единиц активности на флаконах ферментов, концентрация и время пищеварения, возможно, потребуется оптимизировать. Убедитесь, что ферментативное решение готовится свежим каждый раз, иначе урожайность будет уменьшаться. В-третьих, сырая смесь содержит много клеток, некоторые мертвые и / или умирают, лучше всего снизить концентрацию FBS в окрашивание буфера от 5% до 2%. Если у вас возникли проблемы с клетками засорения сопла во время рода, обогатить клетки сначала с помощью комплекта удаления мертвых клеток. Вы также можете добавить буфер EDTA/HEPES или лечение DNase к предварительной сортировке клетки, чтобы предотвратить слипание клеток. Наконец, потому что наша панель антител довольно велика и использует много флюорофоров, убедитесь, что ваши fMO контроля и компенсации контроля сделано правильно.
Одним из ограничений этого метода является количество сердечных перицитов, которые могут быть получены на сердце. В нашем случае, только 1,1% нашей сырой смеси из одной мыши сердце были перициты, которые сопоставимы с процентом в изоляции человеческого сердца, но количество клеток значительно меньше из-за количества сердечной ткани мыши обеспечивает. Поскольку начальное число клеток настолько низко после FACS, было бы лучше, чтобы изолировать от нескольких сердец одновременно. Тем не менее, проблема заключается в огромном количестве ячеек, которые необходимо разобрать за один день. Если у вас есть более 30 миллионов клеток, это будет трудно пройти через сорт, не влияя на жизнеспособность клеток. Если бы у следователя было несколько сортчиков клеток, изоляция от нескольких сердец в день была бы выполнима. Другое ограничение заключается в том, что, поскольку мы не знаем, если Есть субпопуляции перицитов в сердце, как есть скелетные мышцы15,16, мы не знаем, если мы устраняем подтип в нашей стратегии gating. Мы находимся в процессе характеристики наших сердечных перицитов и до сих пор в наших неопубликованных данных, они функционально, как и другие перициты в литературе.
Наш протокол позволит следователям ответить на вопросы о сердечных свойствах перицита, характеристиках, функциональности и других аспектах, которые помогут определить их вклад в сердечный гомеостаз и гемодинамику. Эти клетки могут иметь терапевтический потенциал для сердечно-сосудистых заболеваний, как только их биология лучше понять.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Amgen Flow Cytometry Core за их помощь в разработке флюорофорных панелей, устранении неполадок и сортировке клеток.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
| 100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
| 15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| 25 G butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
| 31 G needle syringe | FisherSci | B328446 | |
| 50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
| ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
| Brightfield Microscope | camera attached | ||
| CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Centrifuge | eppendorf | ||
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
| Confocal Microscope | |||
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
| DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
| Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
| Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| FACSAria software | BD | ||
| Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
| Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
| Fine scissors | FST | 14060-09 | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | ||
| Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
| Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
| Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
| Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
| Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
| Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
| Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
| NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
| Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
| Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
| Pipette and tips | |||
| ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
| Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
| Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody - FITC |
| Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody - APC |
| Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody - BV421 |
| Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody - BV605 |
| Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody - PE |
| Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody - PE-Cy7 |
| SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
| T75 | ThermoFisher | 156499 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
| UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
| ViCell Cell counter | Beckman | ||
| Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |
References
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C.
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Sengillo, J. D., et al. Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease. Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).
- Avolio, E., Madeddu, P. Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease. Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).
- Dore-Duffy, P. Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes. Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).
- Bryan, B. A., D'Amore, P. A. Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models. Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. Perivascular cells for regenerative medicine. Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Avolio, E., et al. Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease. Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043 (2015).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Baily, J. E., et al. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. Journal of Visualized Experiments. (116), e54252 (2016).
- Murray, I. R., et al. Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
