Summary
SUMO 是一种必需的、高度保守的、类似于泛素的改性剂。在这个协议中, 我们描述了使用一个抗压力重组的 sumo 捕获蛋白 (kmUTAG) 来可视化本地的、未标记的 SUMMO 共轭及其在各种细胞类型中的定位。
Abstract
在这里, 我们提出了一种新的方法来研究蛋白质的超一色化及其亚细胞定位在哺乳动物细胞和线虫卵母细胞。该方法利用重组修饰的 sumo 捕获蛋白片段 kmutag, 来源于抗压性酵母kluyveromyces marxianus的 up1 sumo 蛋白酶。我们调整了 Kumutag 的特性, 以便在不使用抗体的情况下研究各种模型系统中的超酰化。对于 SUMO 的研究, 与基于抗体的方法相比, Kumutag 有几个优点。这种抗压力的 sumo 捕获试剂是重组生产的, 它能识别来自许多物种的原生 sumo 异形, 与市售抗体不同的是, 它显示出对自由、非共轭的 SUMO 的亲和力降低。这里显示的代表性结果包括 SUMO 结合物在哺乳动物组织培养细胞和线虫卵母细胞中的定位。
Introduction
该方法的目的是利用重组的 sumo 捕获 UTAG (uLp 域标记) 蛋白, 促进对 sumo 共轭蛋白的研究和分析。如下文所述, UTAG 可用于替代其他试剂和方法来纯化、检测和可视化 sumo 修饰的蛋白质。根据生长条件, 细胞可能含有数百或数千种蛋白质, 这些蛋白质通过 SUMO 或 SUMO 链进行改性 (审查见 Kerscher 等人, 2006年1和 Kerscher2016 2)。这代表了一个相当大的困难, 具体的 sumo 修饰蛋白的功能分析, 特别是因为只有一小部分的特定的亚模化目标实际上是改性3。除了它们在基本的细胞过程中的作用, 如转录调控, 蛋白质稳态, 对细胞压力的反应, 和染色质重塑有丝分裂和减数分裂;现在已经足够清楚的是, sumo、sumo 修饰蛋白和 sumo 途径成分也有可能成为癌症和神经退行性疾病等疾病的生物标志物4,5,6 ,7。这突出表明, 需要强大、可靠和易于获得的工具和创新方法, 以便在各种细胞和样品中检测和功能分析 summo 修饰的蛋白质。
在许多系统中, sumo 特异性抗体是检测、分离和功能分析 sumo 修饰蛋白8,9的首选试剂。然而, 一些市售的 sumo 特异性抗体价格昂贵, 数量或可用性有限, 容易表现出疯狂的亲和力和交叉反应性,在某些情况下缺乏重现性10。另一种方法是在转化后的细胞和生物体中表达表位标记的 SUMO, 但将表位标记连接到 SUMO 可能会人为地降低其与蛋白质靶标11的共轭。此外, 在评估未转化的细胞或组织时, 表位也没有用处。
Ulp1 是一种保存的 SUMO 蛋白酶, 来自酿酒酵母, 它同时处理 sumo 前体和 desumoylates sumo 共轭蛋白12。我们开发了 UTAG 试剂的基础上的偶然观察, 在 Ulp1 的 SUMO 处理ulp OMAIN (ud) 中催化半胱氨酸 (c80s) 的突变不仅可以防止 sumo 裂解, 而且还可以捕获具有高含量的 sumo 共轭蛋白亲和力12。为了简单起见, 我们将这个盒式端子的 sumoapm 捕获 Ulp1(C580S) 片段称为 UTAG (UD TAG 的缩写)。UTAG 是一种重组的泛 sumo 捕获蛋白, 它是用于分离和检测 sumo 修饰蛋白的抗 sumo 抗体的一种有用替代品。重要的是, 它特别识别本土折叠, 共轭 SUMO, 而不仅仅是一个或几个表位在 SUMO。为了提高 UTAG 的蛋白质稳定性和 SUMO 结合强度, 我们从耐压酵母马夏努斯 (km) 中产生了 UTAG 的变种。Kumutag 紧密地结合了与纳米摩尔亲和力13的 sumo 共轭.此外, kmUTAG 耐高温 (42°c)、还原剂 (5 mM TCEP-Tris(2-羧基乙基) 盐酸磷化氢)、变性剂 (高达 2 M 尿素)、氧化剂 (0.6% 过氧化氢) 和非离子洗涤剂。这种应激耐受在苛刻的净化条件和长时间的孵育时间是有益的, 确保其稳定性和 sumo 捕获活性。然而, 毫不奇怪, KmUTAG 的 Sumo-bapege 活性与半胱氨酸修饰试剂、离子洗涤剂和完全变性的蛋白质提取物不兼容。KmUTAG 的显著亲和力和特性表明, 这种试剂可能成为研究多个物种中的超酰化蛋白质的标准试剂的一部分。
在这里, 我们提供了一个简单的方法来检测哺乳动物细胞和线虫中的 summo 修饰蛋白使用重组荧光 Mcherry-kumutag 融合蛋白 (Kumtag-fl)。
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Protocol
1. 重组 Kumutag-fl 红细胞捕获蛋白在固定组织培养细胞中的 SUMO 检测
- 在6英寸 TC 板的22毫米圆形盖上生长组织培养细胞, 直至 70%-80% 融合。在6孔板中执行步骤1.2–1.8。
- 用 DPBS (Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水) 短暂清洗细胞
- 对于固定, 请制备4% 对甲醛 (PFA) 溶液 (在 DPBS 中稀释) 的新鲜溶液。要修复单元格, 请在 DPBS 中向每口井添加2毫升 4% PFA。在室温下将细胞培养20分钟。注: 使用 PFA 的所有步骤都应在实验室安全罩中执行, PFA 必须正确处置。
- 将固定单元用1毫升 DPBS 清洗 3倍, 同时将盘子洗净5分钟。
- 要使细胞渗透, 在 DPBS 中孵育 15分钟, 用 0.1% Triton X-100 孵育
- 将细胞用1毫升 DPBS 清洗 3倍, 同时将盘子洗净5分钟
- 用 500μl 0.1 m 糖类-hcl (pH 2.0) 将细胞培养 10秒, 然后用500μl 的 10倍 sumo 蛋白酶缓冲剂 (SPB) 立即中和 pH 值。
- 将细胞用1毫升 DPBS 清洗 3倍, 同时将其洗净板, 每次清洗5分钟
- 从井里取下盖板, 放在湿度室里。然后按如下方式在盖板上进行孵化:
- 仅适用于 UTAG-fl 染色: 将 1μg UTAG-fl 与含有 5 mM tcep 的 100Μl SPB 混合在一起, 将混合物移到覆盖液上的细胞上, 并在室温下在湿度室中孵育1小时。
- (可选) 对于 UTACG-FL 和抗 SUM1 抗体共染色, 请执行以下操作:
- 用100μl 阻滞缓冲液混合在管中 1μg utag-fl 和 0.5μl Sumone-8a2 (用于发育研究, 用于杂交瘤银行9号), 将混合液滴到盖板上, 并在室温下孵育1小时。
- 用 200μl DPBS 对盖板上的细胞清洗 3次, 每次清洗5分钟。
- 在管0.5Μl 抗小鼠亚历克莎 Flor 488 共轭抗体与100μl 阻塞缓冲液, 将混合物移液到盖板上, 并在室温下孵育1小时。
- 要清洗盖板, 在每个盖板上清洗液器 200μl DPBS, 并在适当的位置放置 10分钟, 再重复清洗2次。
- 从最后一次清洗中取出盖板, 并将其倒置到预先清洁的显微镜滑块上, 并放置一滴安装介质 (参见材料表)。
- 在显微镜下观察之前, 先将20°C 的冰柜存放在的冰柜中。可视化使用适当的过滤器集的 DAPI (DNA), 德州红 (kmUTAG-fl) 和亚历克莎福陆 488 (如果可选的 sumo2) 进行共染色)。
2. UTAG-fl 固定线虫性腺中的 SUMO 检测
- 将成虫转移到一个8Μl 滴的鸡蛋缓冲液14在加装幻灯片上, 已被涂覆了多-l-赖氨酸。使用 27.5 G 针释放蠕虫的性腺。继续进行抗体标记或 UTAG-fl 标记。
- 对于抗体标记样本, 请按以下步骤操作:
- 冷冻裂纹样品在液氮, 然后固定在-20°c 甲醇在一个科普林罐过夜。
- 此外, 在 Coplin 罐中, 在 1x PBS 中清洗幻灯片 3次, 然后在包含 0.5% BSA 和 0.1% Tween 20 的 PBS 中阻挡20分钟。
- 在覆盖标本的每张幻灯片上加入30μl 抗 sumo 6F2 抗体 (1:10)。在4°C 的湿度室中过夜。
注: SUMO 6F2 是从发育研究杂交瘤银行15获得的。 - 在 Coplin 罐中, 在 1x PBS 中清洗幻灯片 2分钟, 然后在室温下在湿度室中覆盖和孵育 30Μl dylight 488 山羊抗小鼠二级抗体 (1:200) 的标本, 时间为1.5 小时。
- 在 Coplin 罐中, 在 1x PBS 中清洗幻灯片 2分钟, 在 dH20 中执行快速浸渍, 然后使用安装介质安装幻灯片 (请参见材料表)。
- 对于 KmUTAG-fl 标签, 请执行以下操作:
- 要固定细胞, 在样品中加入1个量的 8% PF, 最终浓度为 4% PF. 在湿度室中固定 10分钟, 然后通过将滑块转移到含有 1x PBS 的 Coplin 罐 (0.1 m 甘氨酸) 中淬火, 至少5分钟。
- 在 Coplin 罐中, 在 1x PBS 中清洗细胞 5分钟, 然后在含有0.1% 的 Triton-X 的 1x PBS 中渗透样品10分钟。
- 在 1个 Pbs 中在 coplin 罐中清洗至少 5分钟, 然后在幻灯片上的样品中加入 200Μl 0.1 m 糖类-hcl (pH = 2.0), 持续10秒。立即加入 10x SPB 的 200Μl, 以中和 ph 值。
- 在一个科普林罐中清洗 1 x PBS 中的幻灯片5分钟。
- 从清洗和液器中取出含有2微克 UTAG-fl 的 1x spb + 5mM TCEP 的滑块和液器 100μl, 并在湿度室中孵育 1小时, 不摇晃。
- 将滑梯送回科普林罐, 在 1次 PBS 中清洗15分钟
- 从洗涤器中取出滑块, 使用实验室擦拭擦干样品, 然后用5μl 的安装介质安装滑块 (参见材料表)。将幻灯片存放在4°c。可视化使用适当的过滤器集的 DAPI (DNA), 德州红 (kmUTAG-fl) 和 DyLight 488 (sum2{)。
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Representative Results
Kumutag-fl 是一种重组的、标记为染色体的聊天捕获蛋白。为了生产 kmUTAG-fl, 我们克隆了一个代码优化的 Mcherry-kumutag 到 pSPOT1 细菌过度表达质粒 (图 1)。诱导后, kmUTAG-fl 蛋白在 Spog-trap 上纯化, 洗脱, 冷冻至进一步使用。为了确保 Kumutag-fl 的 SUMO-trapping 捕获活性, 我们确认了与 SUMO1 共轭珠子的结合和 sumocat 融合蛋白的沉淀 (数据未显示, 但见前面的工作13)。
用固定 PNT2 细胞培养的 KmUTAG-fl 在 Epifluorescent Zeiss 公理显微镜 (图 2-右上角面板) 上使用适当的滤光片 (色度) 和100x 油浸目标观察时, 显示出明显的核染色。扩散核染色和明显的核病灶都是可见的。核定位是用 DAPI 共染色 (图 2-左上角面板)。与 kmUTAG-fl 的 Sumo-bap往活动相一致, 核定位模式让人想起了 SUMO2/3 染色。与抗 SUMO2/3 8A2 抗体 (图 2 -左下角面板) 共染色, 证实了 KMUTAG-FL 与 summo2/3 信号 (图 2-合并, 右下角) 的共同定位。这验证了 KmUTAG-fl 在哺乳动物细胞中检测 summo"的有效性。
由于 Kumutg-fl 表现出泛 sumo 特异性, 我们还在线虫上对其进行了测试, 以确定 kmUTAG-fl 的定位模式是否与先前报告的抗 sumo 抗体和 mcherry 模式相匹配:: sumo 融合蛋白8,15。对产生卵母细胞的成虫中分离的性腺进行了抗 sumo 抗体或 kmUTAG-fl 标记. 与以前的报告8一致, 抗 sumo 抗体最初定位于晚减数分裂的核质前期卵母细胞 (图 3a, c)。然后, 当核包络破裂, 染色体向中期板块进行研究时, 它被重新分配到配对同源体 (双值) 的中心环复合体 (rc) (图 3B, d)。环复合体的组成部分, 位于 dapi 染色同源物之间, 包括 GEI-17(A E3 SUMO 连接酶) 和 sumo 共轭铬素8。在平行的准备工作中, 标记为 KmUTAG-fl 的性腺也显示出类似的模式 (图 3E, f)。KmUTAG-fl 从标记核浆转向集中在环复合体上, 因为卵母细胞开始 (图 3E中的-1 卵母细胞) 和完成 (图 3E中的1个卵母细胞) 核包络分解的过程。这些结果验证了 KmUTAG-fl是分析线虫和可能的其他线虫中减数分裂和 summ 相关过程的有用工具。
图1。该方法中使用的 kmUTAG-fl sumoapn 捕获融合蛋白的原理图表示。点标记向量 pSPOT1 用于 Kumutag-fl 的表达. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2. 在哺乳动物细胞中与 SUMO2/3 共联.PNT2 细胞生长在盖板上, 固定, 并染色 KmUTAG-fl 和抗 SUM2 8A2 抗体, 然后应用含有 DAPI 的安装介质。幻灯片使用共聚焦显微镜和适当的过滤器进行了可视化 DAPI (DNA), mCherry (kmUTAG-fl) 和 GFP (抗 sumo)。在 PNT2 细胞中与 sumo2-共聚化。刻度栏 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图3。抗 sumo抗体和 Kumtag-fl 标记在线虫卵母细胞成熟过程中的标记比较.(A)近端线虫的原理图。发育中的卵进入精子细胞, 在进入子宫前, 它们在那里受精卵。处于-1 位置的卵母细胞, 紧邻精子, 在受精前发生核包膜破裂。受精后, 精子染色质保持在凝聚状态, 直到卵母细胞染色体完成其减数分裂。(B) 示意图, 显示染色体二价形成后, 同源染色体重组, 分解他们的突触膜复合物, 并在准备中期的准备浓缩。同源体之间的中心环复合体 (RC) 不仅丰富于极光激酶和检查点蛋白 BUB-1, 而且还丰富了 E3 SUMO 激酶 GEI-17 和色度蛋白。(C-D)在减数分裂 i (d) 中期中, 在输卵管 (c) 内发育卵母细胞的一系, 并标记有抗 sumo 抗体的卵母细胞。(C-D)右侧的全尺寸图像显示-2 和-1 原子核的合并 (m) 和单通道 DAPI (d) 和抗 sumo 抗体 (S Ab) 图像以及中期 I 主轴区域。o = 卵母细胞的中期 i 染色体, s = 精子染色质质量。(E-F)在用 KmUTAG-fl 标记的输卵管内发育卵母细胞. 在核包络破裂前不久开始 KmUTAG-fl 在环状复合物中的浓度 (e 中的-1 卵母细胞), 并在很大程度上限制在核包络后的环复合体分解 ( -1个卵母细胞在 f)。蓝色 = DAPI。刻度栏 = 5μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们介绍了 kmUTAG-fl 的使用, 一种重组蛋白, 在固定的哺乳动物细胞和解剖线虫性腺的功能研究 sumo。Kumutag-fl 是一种抗压的泛 sumo 特异性试剂, 可识别和捕获原生 sumo 结合蛋白和 SUMO 链。由于 SUMO 的三级结构是高度保守的, 因此很有可能使用 kmUTAG-fl 试剂来分析来自附加模型和非模型系统的 SUMO 变种。因此, KmUTAG-fl 可能是传统抗体染色协议的一种有用的替代试剂或继发试剂。
使用非抗体替代品有充分的先例, 包括用于碳水化合物检测的乳素, 以及用于蛋白质16、17、18 体内标记的 aptamer 核苷酸和 affimer 肽,19。此外, 还产生了与 sumo 结合并防止与其他蛋白质 18、20、21上与 sumo 相互作用的图案(sim) 相互作用的亲和力和单模。然而, 据我们所知, Kumtag-fl 是第一个重组荧光泛 sumo 捕获蛋白, 用于固定细胞中 SUMO 共轭的直接可视化。KmUTAG-fl 来源于耐压酵母 k. marxianus 的 Ulp1 ,这可以解释其显著的稳定性13。与大多数抗体不同的是, KmUTAG 不需要用于可视化的二级抗体, 在荧光显微镜下很容易看到染色细胞。我们对哺乳动物细胞中 SUMO 共轭的分析和线虫性腺的分析表明, 基于 kumtag 的成像与 SUMO 抗体染色相比是有利的, 并且几乎没有噪音 (例如, 将图 3 a、b与图 3A进行比较), E)。
该协议中的关键步骤包括使用新鲜的聚甲醛和较短的固定时间, 以保持 SUMO natively 折叠, 使它可以被 Kumtag 识别。此外, 用低 pH 糖溶液对固定细胞进行简短的治疗, 提高了其对 SUMO 的敏感性。然而, 并不是所有的样品都适合用 KmUTAG-fl 进行分析。与基于抗体的协议一样, 当试图将 SUMO 定位在新的细胞类型或组织中时, 洗涤剂的选择和洗涤剂浓度可能是重要的变量。最终, 我们计划产生更多的 Kumutag-fl 变种, 包括一种细胞穿透 Kumutag 蛋白, 可用于检测活细胞、有机生物和组织活检中的 SUMO 动力学。
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Disclosures
重组 kmUTAG 试剂通过 kerafast. com 提供给研究界。
Acknowledgments
我们要感谢 Kerscher 实验室的所有成员的支持, 感谢 Nathalie Nguyen 对手稿的批评阅读, 并感谢 Lidia Epp 对测序。这项工作得到了英联邦研究商业化基金 MF16-034-LS 的支持。贝利-赫斯顿研究基金和查尔斯中心颁发的 ry 和 ch 奖奖学金为 w & m 学生提供研究支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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