Summary
Le SUMO est une protéine modificatrice essentielle et très conservée, de petite taille, comme l’ubiquitine. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’une protéine de piégeage de SUMO recombinant tolérante au stress (kmUTAG) pour visualiser les conjugués de SUMO natifs et non marqués et leur localisation dans une variété de types de cellules.
Abstract
Nous présentons ici une nouvelle méthode pour étudier la sumoylation des protéines et leur localisation sous-cellulaire dans les cellules de mammifères et les ovocytes des nématodes. Cette méthode utilise un fragment de protéine de piégeage de SUMO modifié recombinant, kmUTAG, dérivé de la protéase de SUMO Ulp1 de la levure de bourgeonnement tolérante au stress Kluyveromyces marxianus. Nous avons adapté les propriétés de la kmUTAG dans le but d’étudier la sumoylation dans une variété de systèmes modèles sans l’utilisation d’anticorps. Pour l’étude de SUMO, KmUTAG a plusieurs avantages par rapport aux approches basées sur les anticorps. Ce réactif de piégeage du SUMO à tolérance de stress est produit de façon recombinante, il reconnaît les isoformes de SUMO indigènes de nombreuses espèces, et contrairement aux anticorps disponibles dans le commerce, il montre une affinité réduite pour le SUMO libre et non conjugué. Les résultats représentatifs présentés ici comprennent la localisation des conjugués SUMO dans les cellules de culture tissulaire de mammifères et les ovocytes de nématodes.
Introduction
Le but de cette méthode est de faciliter l’étude et l’analyse des protéines conjuguées au SUMO à l’aide de la protéine recombinante SUMO-piégeage UTAG ( étiquettede domaineULP). Comme détaillé ci-dessous, UTAG peut être utilisé en lieu et place d’autres réactifs et approches pour purifier, détecter et visualiser les protéines modifiées par le SUMO. Selon les conditions de croissance, les cellules peuvent contenir des centaines ou des milliers de protéines qui sont modifiées avec les chaînes SUMO ou SUMO (pour examen voir Kerscher et al. 20061 et kerscher 20162). Cela représente une difficulté considérable pour les analyses fonctionnelles de protéines spécifiques de SUMO, d’autant plus que seule une fraction d’une cible de sumoylation particulière est réellement modifiée3. En plus de leurs rôles dans les processus cellulaires essentiels tels que la régulation transcriptionnelle, l’homéostasie des protéines, la réponse au stress cellulaire, et le remodelage de la chromatine pendant la mitose et la méiose; Il est maintenant devenu suffisamment clair que le sumo, les protéines modifiées par le sumo et les composants de la voie de sumo ont également un potentiel comme biomarqueurs pour des pathologies telles que le cancer et les troubles neurodégénératifs4,5,6 ,7. Cela souligne la nécessité d’outils robustes, fiables et facilement disponibles et d’approches novatrices pour la détection et l’analyse fonctionnelle des protéines modifiées par le SUMO dans une variété de cellules et d’échantillons.
Dans de nombreux systèmes, les anticorps spécifiques au sumo sont les réactifs de choix pour la détection, l’isolement et les analyses fonctionnelles des protéines modifiées par le sumo8,9. Cependant, certains anticorps spécifiques au SUMO disponibles dans le commerce sont coûteux, limités en quantité ou en disponibilité, enclins à présenter des affinités à variables sauvagement et une réactivité croisée, et, dans certains cas, manquent de reproductibilité10. Une autre approche est l’expression du SUMO marqué par l’épitope dans les cellules et les organismes transformés, mais la liaison des étiquettes d’épitope au SUMO peut artificiellement abaisser sa conjugaison aux cibles protéiques11. En outre, les épitopes ne sont pas utiles lorsque des cellules ou des tissus non transformés sont évalués.
Ulp1 est une protéase de SUMO conservée de S. cerevisiae qui les deux traite le précurseur de sumo et desumoylates les protéines conjuguées de sumo12. Nous avons développé le réactif UTAG sur la base de l’observation fortuit qu’une mutation de la cystéine catalytique (C580S) dans Ulp1's traitement SUMO ULP domain (UD) non seulement prévient le clivage du sumo, mais piège également les protéines conjuguées au Sumo avec des l’avidité12. Pour simplifier, nous nous sommes référés à ce fragment carboxy-terminal SUMO-piégeage Ulp1 (C580S) comme UTAG (abréviation de UD TAG). UTAG est une protéine de piégeage de Pan-SUMO recombinante qui représente une alternative utile aux anticorps anti-SUMO utilisés pour l’isolement et la détection des protéines modifiées par le SUMO. Plus important encore, il reconnaît spécifiquement le SUMO en mode natif, conjugué et non pas seulement un ou plusieurs épitopes sur SUMO. Pour améliorer à la fois la stabilité protéique et la force de liaison SUMO de UTAG, nous avons généré une variante de l’UTAG de la levure tolérante au stress Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG lie étroitement les conjugués de SUMO à l’affinité nanomolaire13. De plus, kmUTAG résiste aux températures élevées (42 ° c), aux agents réducteurs (chlorhydrate de 5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) phosphine), aux dénaturants (jusqu’à 2 M d’urée), aux agents oxydants (0,6% de peroxyde d’hydrogène) et aux détergents non ioniques. Cette tolérance au stress est bénéfique pendant l’état de purification sévère et les durées d’incubation prolongées, assurant sa stabilité et son activité de piégeage du SUMO. Toutefois, il n’est pas surprenant que l’activité de piégeage de SUMO de KmUTAG soit incompatible avec les réactifs modifiant la cystéine, les détergents ioniques et les extraits protéiques entièrement dénaturés. L’affinité et les propriétés remarquables de KmUTAG indiquent que ce réactif peut faire partie du répertoire standard pour l’étude des protéines sumoylées chez plusieurs espèces.
Nous fournissons ici une méthode simple pour détecter les protéines modifiées par le SUMO dans les cellules de mammifères et les nématodes à l’aide d’une protéine de fusion mCherry-KmUTAG fluorescente recombinante (kmUTAG-FL).
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Protocol
1. détection de SUMO dans des cellules de culture tissulaire fixe utilisant la protéine recombinante KmUTAG-FL SUMO-piégeage
- Cultiver des cellules de culture tissulaire de choix sur des feuillets de 22 mm de couverture ronde dans des plaques de 6-Well TC jusqu’à 70% – 80% confluent. Effectuez les étapes 1.2 à 1.8 dans la plaque de 6 puits.
- Laver brièvement les cellules avec 1 mL de DPBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco)
- Pour la fixation, préparer une solution fraîche de 4% de paraformaldéhyde (PFA) solution (dilué dans DPBS). Pour fixer les cellules, ajouter 2 mL 4% PFA dans DPBS à chaque puits. Incuber les cellules pendant 20 min à température ambiante. Remarque: toutes les étapes utilisant le PFA doivent être effectuées dans un capot de sécurité de laboratoire et le PFA doit être éliminé correctement.
- Laver les cellules fixes 3x dans 1 mL DPBS tout en cassant la plaque, 5 min chaque lavage.
- Pour perméabilize les cellules, incuber pendant 15 min avec 0,1% Triton X-100 dans DPBS
- Laver les cellules 3x dans 1 mL DPBS tout en cassant la plaque, 5 min chaque lavage
- Incuber les cellules avec 500 μL de 0,1 M de glycine-HCL (pH 2,0) pendant 10 s, puis neutraliser le pH immédiatement avec 500 μL de tampon de protéase de SUMO 10x (SPB).
- Laver les cellules 3x dans 1 mL DPBS tandis que la plaque de noix, 5 min chaque lavage
- Retirez les lamelles du puits et placez-les dans une chambre d’humidité. Ensuite, procéder aux incubations sur la bavette comme suit:
- Pour la coloration UTAG-FL seulement: mélanger 1 μg UTAG-FL avec 100 μL de 1x SPB contenant 5 mM TCEP dans un tube, Pipetter le mélange sur les cellules de la lèvre, et incuber à température ambiante pendant 1 h dans la chambre d’humidité.
- En option, pour la co-coloration des anticorps UTAG-FL et anti SUMO1, procédez comme suit:
- Mélanger dans un tube 1 μg UTAG-FL et 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (obtenu pour les études de développement Hybridoma Bank9) avec 100 μl de tampon bloquant, Pipetter le mélange sur la lèvre, et incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Laver les cellules sur la lamelle 3 fois avec 200 μl de DPBS, 5 min chaque lavage.
- Mélanger dans un tube 0,5 μL anti-souris Alexa Fluor 488 anticorps conjugués avec 100 μL tampon bloquant, Pipetter le mélange sur la lèvre et incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Pour laver les lamelles, Pipetter 200 μl de DPBS sur chaque lamelle et laisser en place pendant 10 min. répéter le lavage 2 fois de plus.
- Enlevez le rebord du dernier lavage et inversez-le sur une glissière de microscopie préalablement nettoyée avec une goutte de support de montage (voir tableau des matériaux).
- Entreposer la nuit dans un congélateur de-20 ° c avant de regarder sous le microscope. Visualisez à l’aide des ensembles de filtres appropriés pour DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) et Alexa Fluor 488 (si la cocoloration optionnelle SUMO2/3 est effectuée).
2. détection de SUMO dans des gonades de nématodes fixes utilisant UTAG-FL
- Transférer les hermaphrodites adultes à une gouttelette de 8 μL de tampon d’oeufs14 sur une glissière plus chargée qui a été enduite de poly-L-lysine. Relâchez les gonades des vers à l’aide de 27,5 aiguilles G. Procédez à l’étiquetage des anticorps ou à l’étiquetage UTAG-FL.
- Pour les échantillons d’étiquetage d’anticorps, procédez comme suit:
- Congeler des échantillons de crack dans de l’azote liquide, puis fixer la nuit dans le méthanol-20 ° c dans un bocal de Coplin.
- Aussi dans les pots de Coplin, laver les lames pour 3 fois dans 1x PBS, puis bloquer pendant 20 min dans PBS contenant 0,5% BSA et 0,1% Tween 20.
- Ajouter 30 μL d’anticorps anti-SUMO 6F 2 (1:10) à chaque diapositive couvrant les spécimens. Incuber pendant la nuit dans une chambre d’humidité à 4 ° c.
NOTE: le SUMO 6F2 a été obtenu à partir des études de développement Hybridoma Bank15. - Dans les pots de Coplin, laver les lames pendant 2 min dans 1x PBS, puis recouvrir et incuber les spécimens avec 30 μL d’anticorps secondaire DyLight 488 chèvre-anti souris (1:200) pendant 1,5 heures dans une chambre d’humidité à température ambiante.
- Dans les pots de Coplin, laver les lames pendant 2 min dans 1x PBS, effectuer une trempette rapide en dH20, puis monter les glissières avec support de montage (voir tableau des matériaux).
- Pour l’étiquetage KmUTAG-FL, procédez comme suit:
- Pour fixer les cellules, ajouter 1 volume de 8% PF aux échantillons pour une concentration finale de 4% PF. fixer pendant 10 min dans une chambre d’humidité, puis éteindre la réaction en transférant les lames dans un bocal de Coplin contenant 1x PBS avec 0,1 M de glycine pendant au moins 5 min.
- Dans les pots de Coplin, laver les cellules pendant 5 min dans 1x PBS, puis perméabilize les échantillons dans 1x PBS contenant 0,1% Triton-X pendant 10 min.
- Laver dans un bocal de Coplin pendant au moins 5 min dans 1x PBS, puis ajouter 200 μL de 0,1 M de glycine-HCl (pH = 2,0) aux échantillons sur la diapositive pendant 10 secondes. Ajouter immédiatement 200 μL de 10x de SPB pour neutraliser le pH.
- Lavez la glissière dans un récipient de Coplin de 1x PBS pendant 5 min.
- Retirer la lame du lavage et Pipetter 100 μL de 1x SPB + 5mM TCEP contenant 2 μg d’UTAG-FL aux nématodes sur les lames, et incuber dans la chambre d’humidité pendant 1 h sans bascule.
- Retournez la glissière dans le bocal de Coplin et lavez-la pendant 15 min en 1x PBS
- Retirez la glissière du lavage, utilisez une lingette de laboratoire pour sécher autour de l’échantillon, puis montez les lames avec 5 μL de support de montage (voir tableau des matériaux). Rangez les lames à 4 ° c. Visualisez à l’aide des ensembles de filtres appropriés pour DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) et DyLight 488 (SUMO2/3).
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Representative Results
KmUTAG-FL est une protéine recombinante, mCherry-tag SUMO-piégeage. Pour produire kmUTAG-FL, nous avons cloné un mCherry-kmUTAG optimisé pour le codon dans le plasmide bactérien de surexpression bactérienne de pSPOT1 (figure 1). Après l’induction, la protéine kmUTAG-FL a été purifiée sur spot-TRAP, éluée et congelée jusqu’à utilisation ultérieure. Pour assurer l’activité de piégeage de SUMO de KmUTAG-FL, nous avons confirmé la liaison aux billes conjuguées à la SUMO1 et la précipitation d’une protéine de fusion SUMO-CAT (données non affichées, mais voir travaux précédents13).
KmUTAG-FL incubé avec des cellules PNT2 fixes a montré une coloration nucléaire distincte lorsqu’il est observé en utilisant le jeu de filtres approprié (Chroma) et un objectif d’immersion en huile 100X sur un microscope epifluorescent Zeiss Axioplan (figure 2-panneau supérieur droit). Les taches nucléaires diffuses et les foyers nucléaires distincts étaient visibles. La localisation nucléaire a été confirmée à l’aide de co-coloration avec DAPI (figure 2-panneau supérieur gauche). Conformément à l’activité de piégeage de SUMO de kmUTAG-FL, le modèle de localisation nucléaire rappelle la coloration de SUMO2/3. La co-coloration avec l’anticorps anti SUMO2/3 8A2 (figure 2 -panneau inférieur gauche) confirme la co-localisation de kmUTAG-FL avec le signal Sumo2/3 (figure 2-Merge, en bas à droite). Cela confirme l’efficacité de KmUTAG-FL pour détecter SUMO2/3 dans les cellules de mammifères.
Puisque kmUTAG-FL présente une spécificité Pan-SUMO, nous l’avons également testé sur des nématodes de C. elegans pour déterminer si le modèle de localisation de kmutag-FL correspondra aux modèles précédemment rapportés d’anticorps anti-sumo et de mCherry:: protéines de fusion de sumo 8,15. Des gonades isolées provenant d’hermaphrodites adultes produisant des ovocytes ont été traitées pour étiquetage avec des anticorps anti-SUMO ou kmUTAG-FL. conformément aux précédents rapports 8, anticorps anti-sumo initialement localisé au nucléoplasme de la méiotique tardive les ovocytes prophasés (figure 3A, C). Il a ensuite redistribué au complexe central de l’anneau (RC) des homologues appariés (bivalents) comme l’enveloppe nucléaire est tombé en panne et le Congrès des chromosomes vers la plaque de métaphase (figure 3b, D). Les composants du complexe annulaire, qui se situent entre les homologs colorés par le DAPI, comprennent à la fois la GEI-17 (a E3 SUMO ligase) et la chromokinesine 8conjuguée au sumo. Dans les préparations parallèles, les gonades étiquetées avec KmUTAG-FL ont révélé des schémas similaires (figure 3e, F). KmUTAG-FL est passé de l’étiquetage du nucléoplasme à la concentration sur le complexe de l’anneau, comme les ovocytes ont commencé (-1 ovocyte dans la figure 3e) et complété (-1 ovocyte dans la figure 3F) le processus de décomposition de l’enveloppe nucléaire. Ces résultats valident KmUTAG-FL comme un outil utile pour l’analyse de la méiose et des processus liés au SUMO chez C. elegans et possiblement avec d’autres nématodes.
La figure 1. Représentation schématique de la protéine de fusion kmUTAG-FL SUMO-piégeage utilisée dans cette méthode. Le vecteur spot-tag pSPOT1 est utilisé pour l’expression de KmUTAG-FL. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. colocalisation de kmUTAG-FL avec Sumo2/3 dans les cellules de mammifères. Les cellules PNT2 ont été cultivées sur des lamelles, fixées et colorées avec l’anticorps KmUTAG-FL et anti-SUMO2 8A2, avant d’appliquer un support de montage contenant du DAPI. Les diapositives ont été visualisées à l’aide d’un microscope confocale et de filtres appropriés pour DAPI (DNA), mCherry (kmUTAG-FL) et GFP (anti SUMO2/3). kmUTAG-FL colocalisé avec SUMO2/3 dans les cellules PNT2. Barre d’échelle = 20 μM. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 3. Comparaison de l’étiquetage SUMO par anticorps anti-SUMO et KmUTAG-FL pendant la maturation des ovocytes de C. elegans . (A) schéma de la gonade proximale du C. elegans . Les ovocytes en développement entrent dans la spermathèque (sprmth) un par un où ils sont fertilisés avant d’entrer dans l’utérus. Les ovocytes en position-1, immédiatement adjacents à la spermathèque, subissent une décomposition de l’enveloppe nucléaire avant la fécondation. Après la fécondation, la chromatine du sperme reste dans un État condensé jusqu’à ce que les chromosomes des ovocytes complètent leurs divisions méiotiques. Bschéma montrant la structure d’un bivalent chromosomique qui se forme après que les chromosomes homologues se sont recombinés, ont démonté leur complexe synaptoménal et se sont condensés en préparation de la métaphase. Un complexe d’anneau central (RC) entre les homologues est enrichi non seulement en Aurora kinase et la protéine de point de contrôle BUB-1, mais aussi l’E3 SUMO ligase GEI-17 et chromokinesin. (C-D) Une lignée d’ovocytes en développement dans l’oviducte (C) et un ovocyte nouvellement fécondé en métaphase de la méiose I (D) étiqueté avec l’anticorps anti-sumo. (C-D) Les images de taille réelle à droite montrent les images fusionnées (m) et monocanal DAPI (D) et anticorps anti-SUMO (S AB) des noyaux-2 et-1 et de la région de fuseau de la métaphase I. o = chromosomes de la métaphase I de l’ovocyte, s = masse de la chromatine du sperme. (E-F) Développement d’ovocytes à l’intérieur de l’oviducte étiqueté avec KmUTAG-FL. la concentration de KmUTAG-FL au complexe annulaire commence peu avant la décomposition de l’enveloppe nucléaire (-1 ovocyte en E) et devient largement restreinte au complexe de l’anneau après l’enveloppe nucléaire (-1 ovocyte en F). Bleu = DAPI. Barre d’échelle = 5 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous introduisons l’utilisation de kmUTAG-FL, une protéine recombinante, pour des études fonctionnelles de SUMO dans des cellules de mammifères fixes et des gonades de nématodes disséqué. KmUTAG-FL est un réactif spécifique au PAN-SUMO tolérant le stress qui reconnaît et piège les protéines conjuguées au SUMO et les chaînes de SUMO indigènes. Étant donné que la structure tertiaire de SUMO est très conservée, il est très probable que des variantes de SUMO issues de systèmes supplémentaires de modèle et de non-modèle puissent être analysées avec le réactif kmUTAG-FL. En tant que tel, KmUTAG-FL peut représenter une alternative utile ou un réactif secondaire pour les protocoles traditionnels de coloration des anticorps.
Il existe un précédent suffisant pour l’utilisation des alternatives non-anticorps, y compris les lectines pour la détection des glucides ainsi que les nucléotides aptamère et les peptides d’affimer pour l’étiquetage in vivo des protéines 16,17,18 ,19. En outre, des affimers et des monobodies ont été générés qui lient le sumo et empêchent l’interaction avec des motifs en interaction avec le sumo (Sims) sur d’autres protéines18,20,21. Cependant, à notre connaissance, KmUTAG-FL est la première protéine de piégeage de Pan-SUMO fluorescente recombinante pour la visualisation directe des conjugués SUMO dans des cellules fixes. KmUTAG-FL est dérivé de Ulp1 d’une levure tolérante au stress, K. marxianus, et cela peut expliquer sa remarquable stabilité 13. Contrairement à la plupart des anticorps, KmUTAG ne nécessite pas un anticorps secondaire pour la visualisation, et les cellules colorées sont facilement visibles sous le microscope de fluorescence. Nos analyses des conjugués SUMO dans les cellules de mammifères et les gonades des nématodes suggèrent que l’imagerie basée sur KmUTAG se compare favorablement à la coloration des anticorps SUMO et montre peu de bruit (par exemple, comparer la figure 3A, B versus la figure 3D , E).
Les étapes critiques dans le protocole comprennent l’utilisation de paraformaldéhyde frais et un temps de fixation court pour garder SUMO nativement plié de sorte qu’il peut être reconnu par kmUTAG. En outre, le bref traitement des cellules fixes avec la solution de faible pH glycine augmente sa sensibilité pour le SUMO. Cependant, tous les échantillons ne peuvent pas se prêter à l’analyse avec KmUTAG-FL. Comme pour les protocoles basés sur les anticorps, lorsqu’on tente de localiser le SUMO dans de nouveaux types ou tissus cellulaires, les concentrations de détergent et de détergents peuvent être des variables importantes. En fin de compte, nous prévoyons de générer des variantes KmUTAG-FL supplémentaires, y compris une protéine kmUTAG pénétrante de cellules qui peut être utilisée pour détecter la dynamique de SUMO dans les cellules vivantes, les organoïdes, et les biopsies tissulaires.
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Disclosures
Les réactifs kmUTAG recombinants sont fournis à la communauté de recherche via Kerafast.com.
Acknowledgments
Nous aimerions remercier tous les membres du laboratoire Kerscher pour leur soutien, Nathalie Nguyen pour la lecture critique du manuscrit, et Lidia EPP pour le séquençage. Ce travail a été appuyé par le Fonds de commercialisation de la recherche du Commonwealth MF16-034-LS à OK. Le soutien de la recherche pour les étudiants de W & M a été fourni par le fonds Bailey-Huston Research, et les bourses Charles Center Honors à RY et CH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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