Summary
السومو هو البروتين المعدل الأساسي والمحفوظ بشكل كبير والصغير الحجم. في هذا البروتوكول ، نقوم بوصف استخدام بروتين التراكب السومو الذي يتسامح مع الإجهاد (kmUTAG) لتصور الاصليه ، وغير الموسومة السومو الاقتران وتوطينها في مجموعه متنوعة من أنواع الخلايا.
Abstract
هنا نقدم طريقه جديده لدراسة البروتينات وتوطينها شبه الخلوي في خلايا الثدييات والبويضات الخيطية. هذا الأسلوب يستخدم المؤتلف تعديل السومو-محاصره جزء من البروتين, kmUTAG, المستمدة من الانزيم البروتيني Ulp1 السومو من الخميرة الناشئة المتسامحة الإجهاد كلوفيريميسسيس ماركسيانوس. لقد قمنا بتكييف خصائص kmUTAG لغرض دراسة sumoylation في مجموعه متنوعة من النظم النموذجية دون استخدام الأجسام المضادة. لدراسة السومو ، KmUTAG لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع النهج المستندة إلى الأجسام المضادة. يتم إنتاج هذا الكاشف المتسامح مع الإجهاد السومو ريكومبينانتلي ، فانه يعترف ايسواشكال السومو الأصلي من العديد من الأنواع ، وعلي عكس الأجسام المضادة المتاحة تجاريا فانه يظهر انخفاض تقارب لحره ، السومو غير مترافق. وتشمل النتائج التمثيلية المبينة هنا توطين الاقترانات السومو في خلايا ثقافة الانسجه الثديية والبويضات الخيطية.
Introduction
والغرض من هذا الأسلوب هو تسهيل دراسة وتحليل البروتينات المترافقة السومو باستخدام المؤتلف السومو التراكب UTAG (Ulp علامةالمجال) البروتين. كما هو مفصل أدناه ، يمكن استخدام UTAG بدلا من الكواشف الأخرى والنهج لتنقيه وكشف وتصور البروتينات المعدلة السومو. اعتمادا علي ظروف النمو ، قد تحتوي الخلايا علي مئات أو آلاف البروتينات التي يتم تعديلها باستخدام سلاسل السومو أو السومو (للمراجعة انظر Kerscher et al. 20061 و kerscher 20162). وهذا يمثل صعوبة كبيره بالنسبة للتحليلات الوظيفية للبروتينات المعدلة السومو محدده, خصوصا ان جزءا فقط من هدف sumoylation معينه هو في الواقع تعديل3. بالاضافه إلى أدوارهم في العمليات الخلوية الاساسيه مثل التنظيم العابر ، توازن البروتين ، والاستجابة للإجهاد الخلوي ، وأعاده عرض الكروماتين اثناء الانقسام والانقسام العصبي ؛ أصبح من الواضح الآن بما فيه الكفاية ان السومو ، السومو-البروتينات المعدلة ، ومكونات مسار السومو أيضا لديها إمكانات كما المؤشرات الحيوية للامراض مثل السرطان واضطرابات الأعصاب4،5،6 ،7. وهذا يؤكد الحاجة إلى أدوات قويه وموثوقه ومتاحه بسهوله ونهج مبتكره للكشف والتحليل الوظيفي للبروتينات المعدلة السومو في مجموعه متنوعة من الخلايا والعينات.
في العديد من الانظمه ، الأجسام المضادة الخاصة السومو هي الكواشف المفضلة للكشف والعزل والتحليلات الوظيفية للبروتينات المعدلة السومو8،9. ومع ذلك ، فان بعض الأجسام المضادة الخاصة بالسومو المتاحة تجاريا باهظه التكلفة ، ومحدوده الكمية أو التوافر ، وعرضه لإظهار التقارب المتغير بشكل عشوائي والتفاعل التبادلي ، وفي بعض الحالات تنقص استنساخ10. ويتمثل أحد النهج البديلة في التعبير عن العلامات التي تم الوسم بها في الخلايا المتحولة والكائنات الحية ، ولكن ربط علامات المربه إلى السومو قد يخفض بشكل مصطنع اقترانه بأهداف البروتين11. بالاضافه إلى ذلك ، لا تكون المربية مفيده عند تقييم الخلايا أو الانسجه غير المحولة.
Ulp1 هو الانزيم البروتيني السومو المحفوظة من s. سيريفيسياي ان كلا العمليات السلائف السومو و desumoylates السومو البروتينات مترافق12. قمنا بتطوير كاشف UTAG استنادا إلى الملاحظة صدفه ان طفرة من السيستين الحفاز (C580S) في Ulp1's السومو معالجه Ulp domain (UD) لا يمنع فقط السومو الانقسام ولكن أيضا الفخاخ السومو-البروتينات مترافق مع ارتفاع الغرائب12. للبساطة ، أشرنا إلى هذه القطعة الطرفية Ulp1 (C580S) الخاصة بالجهاز الذي يشبه الكربوكسي باسم UTAG (اختصار ل UD TAG). UTAG هو بروتين التراكب عموم السومو التي تمثل بديلا مفيدا لمكافحه السومو الأجسام المضادة المستخدمة للعزل والكشف عن البروتينات المعدلة السومو. الأهم من ذلك ، فانه يعترف علي وجه التحديد-مطوية أصلا ، السومو مترافق وليس فقط واحد أو عده المردة علي السومو. لتحسين كل من الاستقرار البروتين و السومو قوه ملزمه من UTAG ، ونحن ولدت البديل من UTAG من الخميرة المتسامحة الإجهاد كلوفيريميسسيس ماركسيانوس (كم). KmUTAG باحكام يربط السومو-الاقتران مع نانومولار تقارب13. بالاضافه إلى ذلك ، kmUTAG مقاومه لدرجات الحرارة المرتفعة (42 درجه مئوية) ، والحد من العوامل (5 مم TCEP-تريس (2-كربوكسيايثيل) هيدروكلوريد فوسفونين) ، المسخ (ما يصل إلى 2 م اليوريا) ، والعوامل المؤكسدة (0.6 ٪ بيروكسيد الهيدروجين) ، والمنظفات غير الايونيه. هذا التحمل الإجهاد مفيد خلال حاله تنقيه قاسيه وأوقات الحضانة لفترات طويلة ، وضمان الاستقرار والنشاط السومو المحاصرة. ومع ذلك ، ليس من المستغرب ان يكون نشاط KmUTAG لمحاصره السومو غير متوافق مع الكواشف المعدلة من السيستين والمنظفات الايونيه ومستخلصات البروتين المشوهة تماما. التقارب الملحوظ وخصائص KmUTAG تشير إلى ان هذا الكاشف قد تصبح جزءا من المرجع القياسي لدراسة البروتينات sumoylated في أنواع متعددة.
هنا نقدم طريقه بسيطه للكشف عن البروتينات المعدلة السومو في الخلايا الثديية والديدان الخيطية باستخدام بروتين الانصهار الفلورية mCherry-كموتاغ المؤتلف (kmUTAG-fl).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الكشف عن السومو في خلايا الانسجه الثابتة الثقافة باستخدام المؤتلف KmUTAG-FL السومو البروتين الملائمة
- تنمو الخلايا ثقافة الانسجه المفضلة علي 22 مم الغطاء المستدير ينزلق في لوحات TC 6-حسنا حتى 70 ٪-80 ٪ متموج. قم بتنفيذ الخطوات 1.2 – 1.8 في اللوحة 6 جيدا.
- تغسل الخلايا لفتره وجيزة مع 1 مل من DPBS (المالحة دولبيكو الفوسفات مخزنه)
- للتثبيت ، واعداد حل جديد من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) حل (المخفف في DPBS). لإصلاح الخلايا ، أضافه 2 مل 4 ٪ PFA في DPBS لكل بئر. احتضان الخلايا لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. ملاحظه: يجب اجراء كافة الخطوات باستخدام PFA في غطاء أمان المختبر ويجب التخلص من PFA بشكل صحيح.
- غسل الخلايا الثابتة 3x في 1 مل DPBS في حين البندق لوحه ، 5 دقيقه كل غسل.
- لتتخلل الخلايا ، احتضان لمده 15 دقيقه مع 0.1 ٪ تريتون X-100 في DPBS
- غسل الخلايا 3x في 1 مل DPBS في حين البندق لوحه ، 5 دقيقه كل غسل
- احتضان الخلايا مع 500 μL من 0.1 M الجليسين-HCL (pH 2.0) لمده 10 ثانيه ، ثم تحييد الأس الهيدروجيني علي الفور مع 500 μL من 10x سومو العازلة البروتياز (SPB).
- غسل الخلايا 3x في 1 مل DPBS في حين لوحه البندق ، 5 دقيقه كل غسل
- أزاله الشفتين من البئر ووضعها في غرفه الرطوبة. ثم المضي قدما في احتضان علي كوفيرسليب علي النحو التالي:
- ل UTAG-fl تلطيخ فقط: مزيج 1 ميكروغرام UTAG-fl مع 100 μL من 1x SPB التي تحتوي علي 5 مم TCEP في أنبوب ، ماصه المزيج علي الخلايا علي coverslip ، واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 ساعة في غرفه الرطوبة.
- اختياريا ، ل UTAG-FL ومكافحه SUMO1 الأجسام المضادة المشترك تلوين ، والمضي قدما في ما يلي:
- مزيج في أنبوب 1 ميكروغرام UTAG-FL و 0.5 μL SUMO2/3 8A2 (تم الحصول عليها للدراسات التنموية الهجين البنك9) مع 100 μl من حجب العازلة ، ماصه المزيج علي coverslip ، واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 ساعة.
- يغسل الخلايا علي الشفة 3 مرات مع 200 μL DPBS ، 5 دقيقه كل غسل.
- مزيج في أنبوب 0.5 μL مكافحه الماوس اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة مترافق مع 100 μL حجب العازلة ، ماصه المزيج علي coverslip ، واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 ساعة.
- لغسل الشفتين ، ماصه 200 μL DPBS علي كل coverslips ويترك في مكان لمده 10 دقيقه. كرر الغسيل 2 مره أخرى.
- أزاله كوفيرسليب من غسل الماضي وعكس ذلك علي شريحة المجهر التي تم تنظيفها مسبقا مع قطره من المتوسطة المتصاعدة (انظر جدول المواد).
- يخزن بين عشيه وضحيها في الفريزر-20 درجه مئوية قبل العرض تحت المجهر. تصور باستخدام مجموعات مرشح المناسبة ل DAPI (DNA) ، تكساس الحمراء (kmUTAG-fl) ، و اليكسا فلور 488 (إذا تم تنفيذ اختياري SUMO2/3 المشتركة تلطيخ).
2. الكشف عن السومو في الغدد الخيطية الثابتة باستخدام UTAG-fl
- نقل خنثى الكبار إلى قطره 8 μL من البيض العازلة14 علي شريحة زائد المشحونة التي تم المغلفة مع بولي-L-يسين. الإفراج عن الغدد التناسلية من الديدان باستخدام 27.5 G الابر. المضي قدما اما وسم الأجسام المضادة أو UTAG-fl وضع العلامات.
- للحصول علي عينات وسم الأجسام المضادة ، المضي قدما علي النحو التالي:
- تجميد العينات الكراك في النيتروجين السائل ومن ثم إصلاح بين عشيه وضحيها في-20 درجه مئوية الميثانول في جره Coplin.
- أيضا في الجرار Coplin ، وغسل الشرائح لمده 3 مرات في 1x تلفزيوني ، ثم كتله لمده 20 دقيقه في التلفزيونية التي تحتوي علي 0.5 ٪ بوسني و 0.1 ٪ توين 20.
- أضافه 30 μL من مكافحه السومو 6F2 الأجسام المضادة (1:10) لكل شريحة تغطي العينات. احتضان بين عشيه وضحيها في غرفه الرطوبة في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: تم الحصول علي سومو 6F2 من الدراسات التنموية الهجين البنك15. - في الجرار Coplin ، وغسل الشرائح لمده 2 دقيقه في 1x تلفزيوني ، ثم تغطيه واحتضان العينات مع 30 μL من DyLight 488 الأجسام المضادة الماوس الثانوية الماعز مكافحه (1:200) لمده 1.5 ساعة في غرفه الرطوبة في درجه حرارة القاعة.
- في الجرار Coplin ، وغسل الشرائح لمده 2 دقيقه في 1x تلفزيوني ، واجراء تراجع سريع في dH20 ، ومن ثم تحميل الشرائح مع تصاعد المتوسطة (انظر جدول المواد).
- ل KmUTAG-fl وضع العلامات ، والمضي قدما في ما يلي:
- لإصلاح الخلايا ، أضافه 1 حجم من 8 ٪ PF إلى عينات للتركيز النهائي من 4 ٪ PF. إصلاح لمده 10 دقيقه في غرفه الرطوبة ومن ثم إخماد رد الفعل عن طريق نقل الشرائح إلى جره Coplin تحتوي علي 1x التلفزيونية مع 0.1 M الجليسين لمده لا تقل عن 5 دقيقه.
- في الجرار Coplin ، وغسل الخلايا لمده 5 دقائق في 1x تلفزيوني ، ثم يتخلل العينات في 1x التلفزيونية التي تحتوي علي 0.1 ٪ تريتون-X لمده 10 دقيقه.
- يغسل في جره Coplin علي الأقل 5 دقيقه في 1x تلفزيوني ، ثم أضافه 200 μL من 0.1 M غليسين-HCl (pH = 2.0) إلى العينات علي الشريحة لمده 10 ثانيه. فورا أضافه 200 μL من SPB 10x لتحييد الأس الهيدروجيني.
- غسل الشريحة في 1x التلفزيونية في جره Coplin لمده 5 دقائق.
- أزاله الشريحة من غسل وماصه 100 μL من 1x SPB + 5mM TCEP التي تحتوي علي 2 ميكروغرام من UTAG-fl إلى الديدان الخيطية علي الشرائح ، واحتضان في غرفه الرطوبة ل 1 h دون هزاز.
- أعاده الشريحة إلى جره Coplin ويغسل لمده 15 دقيقه في 1x تلفزيوني
- أزاله الشريحة من الغسيل ، واستخدام مسح المختبر لتجف حول العينة ، ومن ثم تحميل الشرائح مع 5 μL من المتوسطة المتصاعدة (انظر جدول المواد). تخزين الشرائح في 4 درجه مئوية. تصور باستخدام مجموعات التصفية المناسبة ل DAPI (DNA) ، تكساس الحمراء (kmUTAG-fl) ، و DyLight 488 (SUMO2/3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KmUTAG-fl هو المؤتلف ، mCherry الموسومة البروتين السومو المحاصرة. لإنتاج kmUTAG-fl ، ونحن المستنسخة codon الأمثل مككرز-kmUTAG في pSPOT1 التعبير الفوقي البكتيري (الشكل 1). بعد الاستقراء ، تم تنقيه بروتين kmUTAG-fl علي بقعه فخ ، والتملص ، والمجمدة حتى مزيد من الاستخدام. لضمان النشاط السومو-المحاصرة من KmUTAG-fl ، أكدنا ملزمه لSUMO1-الخرز مترافق وهطول الامطار من البروتين الانصهار السومو-CAT (البيانات لم تظهر ، ولكن انظر العمل السابق13).
وأظهرت KmUTAG-fl حضن مع خلايا ثابته PNT2 تلطيخ النووية متميزة عندما لوحظ باستخدام مجموعه مرشح المناسبة (كروما) وهدف الغمر النفط 100x علي المجهر اكسيوبلان زيس العدسة (الشكل 2-اعلي اللوحة اليمني). وكانت البقع النووية المنتشرة والبؤر النووية واضحة. تم تاكيد التعريب النووي باستخدام المشاركة في تلطيخ مع DAPI (الشكل 2-اعلي اللوحة اليسرى). تماشيا مع نشاط السومو-المحاصرة من kmUTAG-fl كان نمط التعريب النووي يذكرنا SUMO2/3 تلطيخ. شارك في تلطيخ مع مكافحه SUMO2/3 8A2 الأجسام المضادة (الشكل 2 -أسفل اللوحة اليسرى) أكدت المشاركة في توطين kmUTAG-fl مع اشاره SUMO2/3 (الشكل 2-دمج ، أسفل اليمين). وهذا يؤكد فعاليه KmUTAG-fl للكشف عن SUMO2/3 في خلايا الثدييات.
منذ kmUTAG-fl المعارض الخصوصية عموم السومو ، ونحن أيضا اختباره علي الديدان الخيطية c. اليجنس لتحديد ما إذا كان نمط التعريب من kmutag-fl سوف تتطابق مع أنماط المبلغ عنها سابقا من الأجسام المضادة لمكافحه السومو و mcherry:: البروتينات الانصهار السومو 8و15. تم تجهيز الغدد التناسلية المعزولة من البويضات البالغة المنتجة للعلامات أليفه لوضع العلامات مع الأجسام المضادة لمكافحه السومو أو kmUTAG-fl. اتساقا مع التقارير السابقة 8، الأجسام المضادة لمكافحه السومو المترجمة في البداية إلى النيوتوبلاسما المتاخره البويضات طور (الشكل 3a، C). هو بعد ذلك يوزع إلى المركزية حلقه مجمعه ([رك]) من ال يقترن [هوموولوجس] ([بيفلنتس]) بما ان الظرف نوويه انهار والكروموسومات اجتماع نحو الغيبية لوحه (شكل [3 ب], [د]). مكونات مجمع الحلبة ، والذي يقع بين التماثل DAPI الملطخة ، وتشمل كلا جي-17 (a E3 سومو ligase) و سومو-مترافق الكروكينيسين 8. وفي التحضيرات الموازية ، كشفت الغدد التناسلية المسمية باسم KmUTAG-fl عن أنماط مماثله (الشكل 3E، و). تحولت KmUTAG-fl من وصف النونوتوبلاسما إلى التركيز علي مجمع الحلبة ، والبويضات بدات (-1 البويضة في الشكل 3E) والانتهاء (-1 البويضة في الشكل 3e) عمليه انهيار المغلف النووي. هذه النتائج التحقق من صحة KmUTAG-fl كاداه مفيده لتحليل العمليات المتعلقة بالانقسام الذاتي والمرتبطة السومو في c. اليجات وربما الديدان الخيطية الأخرى.
الشكل 1 التمثيل التخطيطي للبروتين الانصهار kmUTAG-fl السومو التي تستخدم في هذا الأسلوب. يتم استخدام pSPOT1 ناقلات العلامات الموضعية للتعبير عن KmUTAG-fl. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2-التنظير الحراري مع SUMO2/3 في خلايا الثدييات. وقد نمت خلايا PNT2 علي الشفتين ، ثابته ، وملطخه مع كل من KmUTAG-fl ومكافحه SUMO2 8A2 الأجسام المضادة ، قبل تطبيق وسائل الاعلام المتصاعدة التي تحتوي علي DAPI. تم تصور الشرائح باستخدام المجهر البؤري والمرشحات المناسبة ل DAPI (DNA) ، mCherry (kmUTAG-fl) ، و GFP (anti SUMO2/3). kmUTAG-fl كولوكزيد مع SUMO2/3 في PNT2 الخلايا. شريط مقياس = 20 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 مقارنه بين وضع العلامات السومو من قبل الأجسام المضادة لمكافحه السومو و KmUTAG-fl اثناء نضوج البويضات c. ايليسواس . (ا) تخطيطي لل [ ك.]. تدخل البويضات النامية المبيد المنوي (sprmth) واحدا تلو الآخر حيث يتم تخصيبها قبل دخول الرحم. البويضات في الموقع-1 ، المتاخمة مباشره لل spermatheca الخضوع لانهيار المغلف النووي قبل الإخصاب. بعد الإخصاب ، يبقي الكروماتين المنوي في حاله مكثفه حتى تكمل كروموسومات البويضات انقساماتها الخاصة. (ب) الرسم التخطيطي الذي يظهر هيكل الثنائية الصبغيه التي تشكل بعد الكروموسومات المتماثلة قد جمعت ، تفكيكها سينابتومينال المعقدة ، ومكثفه في التحضير لغيبية. مجمع الحلقة المركزية (RC) بين homologs هو المخصب ليس فقط في الشفق كيناز والبروتين نقطه التفتيش بوب-1 ولكن أيضا E3 السومو يغاز جي-17 و chromاوكيناوا. (جيم-دال) خط من الخلايا النامية داخل القناة (C) والبويضة المخصبة حديثا في الغيبية من الانقسام الأول (د) المسمية الأجسام المضادة لمكافحه السومو. (جيم-دال) الصور كامله الحجم في الحق تظهر المدمجة (م) وقناه واحده DAPI (D) ومكافحه السومو الأجسام المضادة (S Ab) صور من-2 و-1 النوى والمنطقة المحور الثاني المغزل. o = الميتافيزيقية انا الكروموسومات من البويضة ، ق = العنبر الكروماتين الكتلة. (بالانكليزيه والفرنسية) تطوير البويضات داخل القناة المسمية باسم KmUTAG-fl. تركيز KmUTAG-fl في مجمع الحلبة يبدا قريبا قبل انهيار الغلاف النووي (-1 البويضة في E) ويصبح مقتصرا إلى حد كبير علي مجمع الحلبة بعد المغلف النووي انهيار (-1 بويضة في F). الأزرق = DAPI. شريط مقياس = 5 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم استخدام kmUTAG-fl ، بروتين المؤتلف ، للدراسات الوظيفية من السومو في خلايا الثدييات الثابتة وتشريح الغدد الديدان الخيطية. KmUTAG-fl هو كاشف خاص بعموم السومو متسامح مع الإجهاد يتعرف علي البروتينات الاصليه المترافقة مع السومو وسلاسل السومو ويوقعها. وبما ان الهيكل الثالث لشركه السومو مصان بشكل كبير ، فمن المحتمل جدا ان يتم تحليل أنواع السومو من النماذج الاضافيه والانظمه غير النموذجية باستخدام كاشف kmUTAG-fl. وعلي هذا النحو ، قد تمثل KmUTAG-fl كاشفا بديلا أو ثانويا مفيدا لبروتوكولات تلطيخ الأجسام المضادة التقليدية.
هناك سابقه وافره لاستخدام بدائل غير الأجسام المضادة, بما في ذلك يكتينس للكشف عن الكربوهيدرات ، فضلا عن ابتامر نوكليوتيودس و affimer الببتيدات لفي وضع العلامات المجرية من البروتينات 16,17,18 ،19. بالاضافه إلى ذلك ، تم إنشاء affimers و monobodies ان ربط السومو ومنع التفاعل مع السومو التفاعل الزخارف (سيمز) علي البروتين الأخرى18،20،21. ومع ذلك ، وعلي حد علمنا ، KmUTAG-fl هو أول بروتين الفلورسنت المؤتلف عموم السومو الملائمة للتصور المباشر لتصريف السومو في الخلايا الثابتة. KmUTAG-fl مشتق من Ulp1 من الخميرة التي تحمل الإجهاد ، ك. ماركسيانوس ، وهذا قد يفسر استقراره ملحوظ 13. وخلافا لمعظم الأجسام المضادة ، لا تتطلب KmUTAG أجساما مضاده ثانويه للتصور ، والخلايا الملونة مرئية بسهوله تحت المجهر الفلوري. كل من تحليلاتنا من السومو الاقتران في خلايا الثدييات والغدد التناسلية الغدة الخيطية تشير إلى ان التصوير القائم علي KmUTAG يقارن بشكل إيجابي إلى السومو الأجسام المضادة-تلطيخ ويظهر القليل من الضجيج (علي سبيل المثال مقارنه الشكل 3a، B مقابل الشكل 3a ، هاء).
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول استخدام بارافورمالدهيد الطازجة وفتره تثبيت قصيرة للحفاظ علي السومو أصلا مطوية بحيث يمكن التعرف عليها من قبل kmUTAG. كما ان العلاج القصير للخلايا الثابتة مع محلول الأس الهيدروجيني المنخفض يزيد من حساسيته لل السومو. ومع ذلك ، ليست جميع العينات قد تصلح للتحليل مع KmUTAG-fl. كما هو الحال مع البروتوكولات المستندة إلى الأجسام المضادة ، عند محاولة توطين السومو في أنواع الخلايا الجديدة أو الانسجه ، قد يكون اختيار المنظفات وتركيزات المنظفات متغيرات مهمة. في نهاية المطاف ، ونحن نخطط لتوليد اضافيه KmUTAG-fl المتغيرات بما في ذلك الخلية اختراق البروتين kmUTAG التي يمكن استخدامها للكشف عن ديناميات السومو في الخلايا الحية ، العضوية ، والخزعات الانسجه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يتم توفير الكواشف kmUTAG المؤتلف لمجتمع البحوث عبر Kerafast.com.
Acknowledgments
ونود ان نشكر جميع أعضاء مختبر كيرشر علي دعمهم ، ناتالي نغوين للقراءة النقدية للمخطوطة ، وليديا سيب للتسلسل. وقد دعم هذا العمل صندوق الكومنولث لتسويق البحوث MF16-034-LS إلى OK. وقدم الدعم البحثي لطلاب W & M من قبل صندوق بحوث بيلي-هوستون ، ومركز تشارلز يكرم زمالات لري و CH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. SUMOylation. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).
- Hay, R. T.
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
