Summary
SUMO é um essencial e altamente conservado, pequena ubiquitina-like modificador de proteína. Neste protocolo nós estamos descrevendo o uso de uma proteína de SUMO-aprisionamento recombinante stress-tolerante (kmUTAG) para visualizar os conjugados nativos, Untagged de SUMO e sua localização em uma variedade de tipos da pilha.
Abstract
Aqui nós estamos apresentando um método novo estudar a sumoilação das proteínas e sua localização Subcellular em pilhas de mamíferos e em oocytes do nematóide. Este método utiliza um fragmento de proteína de SUMO-aprisionamento modificado recombinante, kmUTAG, derivado do Ulp1 SUMO protease da levedura de brotamento tolerante ao estresse Kluyveromyces marxianus. Nós adaptamos as propriedades do kmutag com a finalidade de estudar a sumoilação em uma variedade de sistemas modelo sem o uso dos anticorpos. Para o estudo de SUMO, KmUTAG tem várias vantagens quando comparada com abordagens baseadas em anticorpos. Este reagente stress-tolerante do SUMO-aprisionamento é produzido recombinantly, reconhece isoformas de SUMO nativos de muitas espécies, e ao contrário dos anticorpos comercialmente disponíveis mostra a afinidade reduzida para o SUMO livre, Unconjugated. Os resultados representativos mostrados aqui incluem a localização de conjugados de sumo em pilhas da cultura de mamíferos do tecido e em oocytes do nematóide.
Introduction
A finalidade deste método é facilitar o estudo e a análise de proteínas SUMO-conjugadas usando a proteína recombinante de SUMO-trapping UTAG ( etiquetado domínio deULP). Como detalhado abaixo, UTAG pode ser usado no lugar de outros reagentes e aproximações para purify, detecta, e visualiza proteínas SUMO-modificadas. Dependendo das condições de crescimento, as células podem conter centenas ou milhares de proteínas que são modificadas com cadeias sumô ou SUMO (para revisão ver Kerscher et al. 2006 e kerscher 20162). Isto representa uma dificuldade considerável para as análises funcionais de proteínas de sumo-modificadas específicas, especialmente porque somente uma fração de um alvo particular da sumoilação é modificada realmente3. Além de seus papéis em processos celulares essenciais, tais como regulação transcricional, homeostase protéica, a resposta ao estresse celular, e remodelação da cromatina durante a mitose e meiose; tornou-se agora suficientemente desobstruído que o sumo, as proteínas sumo-modificadas, e os componentes do caminho do sumo igualmente têm o potencial como biomarcadores para patologias tais como o cancro e desordens neurodegenerativas4,5,6 ,7. Isso ressalta a necessidade de ferramentas robustas, confiáveis e prontamente disponíveis e abordagens inovadoras para a detecção e análise funcional de proteínas SUMO-modificadas em uma variedade de células e amostras.
Em muitos sistemas, os anticorpos de sumo-específicos são os reagentes da escolha para a deteção, a isolação e as análises funcionais deproteínas sumo-modificadas8,9. Entretanto, alguns anticorpos sumô-específicos comercialmente disponíveis são caros, limitados em quantidade ou disponibilidade, propensos a expor afinidades e reatividade cruzada de forma descontroladamente variável e, em alguns casos, falta de reprodutibilidade10. Uma abordagem alternativa é a expressão do epítopo mapeado-Tagged sumo em células transformadas e organismos, mas ligando epítopo Tags para sumo pode artificialmente diminuir a sua conjugação de alvos de proteínas11. Adicionalmente, os epítopos não são úteis quando as células ou tecidos não transformados são avaliados.
Ulp1 é uma protease de SUMO conservada de S. cerevisiae que processa o precursor de sumo e desumoylates proteínas CONJUGADAS com sumo-12. Nós desenvolvemos o reagente de utag baseado na observação serendipitous que uma mutação da cisteína catalítica (C580S) em Ulp1's sumo que processa ULP domínio (UD) não somente impede a segmentação de sumô mas igualmente prende proteínas sumo-conjugadas com a elevação avidez12. Para simplificar, nós nos referimos a este fragmento carboxy-terminal SUMO-aprisionamento Ulp1 (C580S) como UTAG (abreviada para UD TAG). UTAG é uma proteína de aprisionamento de Pan-SUMO recombinante que representa uma alternativa útil aos anticorpos anti-SUMO utilizados para o isolamento e detecção de proteínas SUMO-modificadas. Importante, ele especificamente reconhece nativamente dobrado, conjugada sumo e não apenas um ou vários epítopos no sumo. Para melhorar a estabilidade da proteína e a força obrigatória de SUMO de UTAG, nós geramos uma variação de UTAG do fermento stress-tolerante Kluyveromyces marxianus (quilômetro). A KmUTAG liga firmemente os conjugados sumô com a afinidade nanomolares13. Adicionalmente, kmUTAG é resistente a temperaturas elevadas (42 ° c), agentes redutores (5 mM TCEP-tris (2-carboxietil) cloridrato de fosfina), desnaturantes (até 2 M de ureia), agentes oxidantes (0,6% de peróxido de hidrogênio) e detergentes não iônicos. Esta tolerância ao stress é benéfica durante a condição de purificação dura e tempos de incubação prolongados, assegurando a sua estabilidade e atividade de captura de sumô. Não surpreendentemente, no entanto, a atividade do KmUTAG SUMO-trapping é incompatível com reagentes modificadores da cisteína, detergentes iônicos e extratos proteicos totalmente desnaturados. A afinidade e as propriedades notáveis de KmUTAG indicam que este reagente pode se tornar parte do repertório padrão para o estudo de proteínas sumoylated em espécies múltiplas.
Aqui nós fornecemos um método simples para detectar proteínas sumo-modificadas em pilhas de mamíferos e nematóides usando uma proteína de fusão fluorescente mcherry-kmutag de recombinação (kmutag-FL).
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Protocol
1. detecção de SUMO em células de cultura de tecido fixo usando proteína recombinante KmUTAG-FL SUMO-trapping
- Cresça as pilhas da cultura do tecido da escolha na tampa redonda de 22 milímetros desliza em placas do TC de 6 poços até 70%-80% confluent. Realize as etapas 1.2 – 1.8 na placa de 6 poços.
- Lave brevemente as células com 1 mL de DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco)
- Para fixação, prepare uma solução fresca de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) (diluída em DPBS). Para corrigir células, adicione 2 mL 4% PFA em DPBS a cada poço. Incubar as células por 20 min em temperatura ambiente. Nota: todas as etapas que usam PFA devem ser executadas em uma capa de segurança do laboratório e o PFA deve ser descartado corretamente.
- Lave as células fixas 3x em 1 mL DPBS enquanto nutating a placa, 5 min cada lavagem.
- Para permeabilizar as células, incubar por 15 min com 0,1% Triton X-100 em DPBS
- Lave as células 3x em 1 mL DPBS enquanto nutating a placa, 5 min cada lavagem
- Incubar as células com 500 μL de 0,1 M de Glycine-HCl (pH 2,0) por 10 s, em seguida, neutralizar o pH imediatamente com 500 μL de 10x sumo protease buffer (SPB).
- Lave as células 3x em 1 mL DPBS enquanto a placa de nutating, 5 min cada lavagem
- Retire as lamínulas do poço e coloque-as numa câmara de humidade. Em seguida, proceder com incubações na lamínula da seguinte forma:
- Para a coloração UTAG-FL apenas: misturar 1 μg UTAG-FL com 100 μL de 1x SPB contendo 5 mM de TCEP num tubo, pipetar a mistura para as células da lamínula e incubar à temperatura ambiente durante 1 h na câmara de humidade.
- Opcionalmente, para o UTAG-FL e a co-mancha do anticorpo anti SUMO1, prossiga com o seguinte:
- Misture em um tubo 1 μg UTAG-FL e 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (obtidos para estudos de desenvolvimento hybridoma Bank9) com 100 μl de tampão de bloqueio, pipetar a mistura na lamínula e incubar na temperatura ambiente durante 1 h.
- Lave as células na lamínula 3 vezes com 200 μL DPBS, 5 min cada lavagem.
- Misture em um tubo 0,5 μL anti-rato Alexa fluor 488 anticorpo conjugado com 100 μL tampão de bloqueio, pipetar a mistura na lamínula e incubar na temperatura ambiente durante 1 h.
- Para lavar as lamelas, pipetar 200 μL DPBS em cada lamínula e deixar no lugar durante 10 min. Repita a lavagem mais 2 vezes.
- Retire a lamínula da última lavagem e inverta-a numa lâmina de microscopia pré-limpa com uma gota de suporte de montagem (ver tabela de materiais).
- Armazene durante a noite em um congelador de-20 ° c antes de ver o microscópio. Visualize usando os conjuntos de filtros apropriados para DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) e Alexa fluor 488 (se for realizada a cocoloração opcional SUMO2/3).
2. detecção de SUMO em gônadas de nematódeo fixas usando UTAG-FL
- Transferir hermafroditas adultas para uma gota de 8 μL de tampão de ovo14 em um slide com carga de adição que foi revestido com poli-L-lisina. Solte as gônadas dos vermes usando 27,5 agulhas G. Proceder com rotulagem de anticorpos ou rotulagem UTAG-FL.
- Para amostras de rotulagem de anticorpos, proceda do seguinte modo:
- Congelar-crack amostras em nitrogênio líquido e, em seguida, fixar durante a noite em-20 ° c metanol em um frasco de Coplin.
- Também em frascos de Coplin, lave as lâminas por 3 vezes em 1X PBS, em seguida, bloquear por 20 min em PBS contendo 0,5% BSA e 0,1% Tween 20.
- Adicionar 30 μL de anticorpo anti-SUMO 6F2 (1:10) a cada lâmina que cubra os espécimes. Incubar durante a noite em uma câmara de humidade a 4 ° c.
Nota: o SUMO 6F2 foi obtido a partir do estudo do desenvolvimento hybridoma Bank15. - Em frascos de Coplin, lave as lâminas durante 2 min em 1X PBS, depois cubra e incubar espécimes com 30 μL de anticorpo secundário de cabra-anti-rato DyLight 488 (1:200) durante 1,5 horas numa câmara de humidade à temperatura ambiente.
- Em frascos de Coplin, lave as lâminas por 2 min em 1X PBS, faça um mergulho rápido em dH20 e, em seguida, monte os slides com suporte de montagem (veja a tabela de materiais).
- Para a etiquetagem KmUTAG-FL, proceda com o seguinte:
- Para fixar as células, adicionar 1 volume de 8% PF para amostras para uma concentração final de 4% PF. fixar por 10 min em uma câmara de humidade e, em seguida, saciar a reação Transferindo slides para um frasco de Coplin contendo 1X PBS com 0,1 M de glicina por pelo menos 5 min.
- Em frascos de Coplin, lave as células por 5 min em 1X PBS, em seguida, permeabilizar as amostras em 1X PBS contendo 0,1% Triton-X por 10 min.
- Lave em um frasco de Coplin por pelo menos 5 min em 1X PBS, em seguida, adicione 200 μL de 0,1 M Glycine-HCl (pH = 2,0) para as amostras no slide por 10 segundos. Adicione imediatamente 200 μL de 10x SPB para neutralizar o pH.
- Lave o slide em 1X PBS em um frasco de Coplin por 5 min.
- Retire a corrediça da lavagem e pipetar 100 μL de 1x SPB + 5mM TCEP contendo 2 μg de UTAG-FL para os nematódeos nas lâminas, e incubar na câmara de humidade durante 1 h sem balançar.
- Retorne o slide para o frasco de Coplin e lave por 15 min em 1X PBS
- Retire o slide da lavagem, use uma limpeza de laboratório para secar ao redor da amostra e, em seguida, monte as lâminas com 5 μL de suporte de montagem (ver tabela de materiais). Armazene os slides a 4 ° c. Visualize usando os conjuntos de filtros apropriados para DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) e DyLight 488 (SUMO2/3).
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Representative Results
KmUTAG-FL é um recombinante, mCherry-Tagged SUMO-trapping proteína. Para a produção de kmUTAG-FL, clonamos um mCherry-kmUTAG otimizado para o Codon no plasmídeo de superexpressão bacteriana pSPOT1 (Figura 1). Após a indução, a proteína kmUTAG-FL foi purificada em armadilha Spot, eluída e congelada até uso posterior. Para garantir a atividade de armadilhagem de sumô de KmUTAG-FL, confirmamos a ligação a grânulos conjugados com SUMO1 e precipitação de uma proteína de fusão SUMO-CAT (dados não mostrados, mas veja o trabalho anterior13).
KmUTAG-FL incubado com as pilhas PNT2 fixas mostrou uma mancha nuclear distinta quando observado usando o jogo apropriado do filtro (chroma) e um objetivo 100x da óleo-imersão em um microscópio epifluorescente de Axioplan de Zeiss (Figura 2-painel direito superior). A mancha nuclear difusa e os focos nucleares distintos eram visíveis. A localização nuclear foi confirmada por meio de cocoloração com DAPI (Figura 2-painel superior esquerdo). Consistente com a atividade de captura de sumô de kmUTAG-FL, o padrão de localização nuclear foi uma reminiscência da coloração de SUMO2/3. A cocoloração com anticorpo anti SUMO2/3 8A2 (Figura 2 -painel esquerdo inferior) confirmou a colocalização do kmUTAG-FL com o sinal SUMO2/3 (Figura 2-mesclagem, canto inferior direito). Isto valida a eficácia de KmUTAG-FL para detectar SUMO2/3 em pilhas de mamíferos.
Desde que kmutag-FL exibe a especificidade do Pan-sumo, nós igualmente testamos-o em nematóides dos elegans do C. para determinar se o teste padrão da localização de kmutag-FL combinaria os testes padrões previamente relatados de anticorpos de anti-sumo e de mcherry:: proteínas de fusão de sumo 8,15. As gônadas isoladas de hermafroditas adultas produtoras de oócitos foram processadas para rotulagem com anticorpos anti-sumo ou kmutag-FL. consistente com os relatórios anteriores 8, anticorpo anti-sumo inicialmente localizado ao nucleoplasma de meiótico tardia ovócitos pró-fásicos (Figura 3a, C). Redistribui então ao complexo central do anel (RC) dos homólogos emparelhados (bivalents) enquanto o envelope nuclear quebrou para baixo e o Congress dos cromossomas para a placa do metáfase (Figura 3B, D). Os componentes do complexo do anel, que está situado entre os homologs DAPI-manchados, incluem GEI-17 (uma ligase do SUMO E3) e chromokinesin SUMO-conjugated 8. Em preparações paralelas, as gônadas rotuladas com KmUTAG-FL revelaram padrões semelhantes (Figura 3E, F). Kmutag-FL deslocou de etiquetar o nucleoplasma para concentrar-se no complexo do anel, porque os oócitos começaram (-1 oócito na Figura 3E) e terminado (-1 oócito em Figura 3F) o processo de avaria nuclear do envelope. Estes resultados validam KmUTAG-FL como uma ferramenta útil para a análise da meiose e de processos SUMO-relacionados em C. elegans e possivelmente em outros NEMATODES.
Figura 1. Representação esquemática da proteína de fusão kmUTAG-FL SUMO-trapping utilizada neste método. O vetor Spot-tag pSPOT1 é usado para a expressão de KmUTAG-FL. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. colocalização de kmUTAG-FL com SUMO2/3 em células de mamíferos. As células PNT2 foram cultivadas em lamelas, fixas e coradas com o anticorpo KmUTAG-FL e anti-SUMO2 8A2, antes de aplicar suportes de montagem contendo DAPI. As lâminas foram visualizadas utilizando-se um microscópio confocal e filtros apropriados para DAPI (DNA), mCherry (kmUTAG-FL) e GFP (anti SUMO2/3). kmUTAG-FL colocalizada com SUMO2/3 em células PNT2. Barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação da rotulagem de SUMO por anticorpos anti-SUMO e KmUTAG-FL durante a maturação dos oócitos de C. elegans . (A) esquema do C. elegans gonad proximal. Os oócitos em desenvolvimento entram na espermateca (sprmth) um por um, onde são fertilizados antes de entrarem no útero. Os oócitos na posição-1, imediatamente adjacentes à espermateca, passam por uma quebra de envelope nuclear antes da fertilização. Após a fertilização, a cromatina do esperma permanece em um estado condensado até que os cromossomas do oócito completem suas divisões meiótico. (B) esquemático mostrando a estrutura de um bivalente cromossômico que se forma após os cromossomas homómicos terem recombinado, desmontado seu complexo sinaptomenal, e condensados em preparação para a metafase. Um complexo do anel central (RC) entre os homólogos é enriquecido não somente na quinase da Aurora e na proteína Bub-1 do ponto de verificação mas igualmente na ligase E3-17 do sumo e no chromokinesin. (C-D) Uma linha de oócitos em desenvolvimento dentro do oviduto (C) e um oócito recém-fertilizado na metafase da meiose I (D) rotulado com anticorpo anti-sumo. (C-D) Imagens de tamanho normal à direita mostram as imagens fundidas (m) e de canal único DAPI (D) e anticorpo anti-SUMO (S AB) dos núcleos-2 e-1 e da região do fuso metafase I. o = metáfase I cromossomas de oócitos, s = massa de cromatina de esperma. (E-F) Desenvolvimento de oócitos dentro do oviduto rotulado com kmutag-FL. a concentração de kmutag-FL no complexo do anel começa logo antes da avaria nuclear do envelope (-1 oócito em e) e torna-se pela maior parte restrita ao complexo do anel após o envelope nuclear desagregação (-1 oócito em F). Azul = DAPI. Barra de escala = 5 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui apresentamos o uso de kmUTAG-FL, uma proteína recombinante, para estudos funcionais de SUMO em células de mamíferos fixas e gônadas de nematódeos dissecados. O KmUTAG-FL é um reagente específico de Pan-SUMO, tolerante ao stress, que reconhece e intercepta proteínas conjugadas de SUMO nativas e cadeias de SUMO. Desde que a estrutura terciária de sumô é altamente conservada é muito provável que as variações de sumô do modelo adicional e dos sistemas do não-modelo possam ser analisadas com o reagente de kmUTAG-FL. Como tal, KmUTAG-FL pode representar um reagente alternativo ou secundário útil para protocolos de coloração tradicionais do anticorpo.
Há um amplo precedente para o uso de alternativas de não-anticorpo, incluindo lectinas para detecção de carboidratos, bem como nucleotídeos aptâmero e peptídeos de affimer para a rotulagem in vivo de proteínas 16, 17,18 ,19. Adicionalmente, os affimers e os monobodies foram gerados que ligam o sumo e impedem a interação com os motivos interagindo do sumo (Sims) em outras proteínas18,20,21. No entanto, a nosso conhecimento, KmUTAG-FL é a primeira proteína fluorescente recombinante Pan-SUMO-trapping para a visualização direta de conjugados sumô em células fixas. KmUTAG-FL é derivado de Ulp1 de um fermento stress-tolerante, K. marxianus, e este pode explicar sua estabilidade notável 13. Diferentemente da maioria dos anticorpos, o KmUTAG não requer um anticorpo secundário para visualização, e as células manchadas são prontamente visíveis o microscópio de fluorescência. Ambas as nossas análises de conjugados de SUMO em células de mamíferos e gônadas de nematoides sugerem que a imagem baseada em KmUTAG se compara favoravelmente com a coloração de anticorpos sumô e apresenta pouco ruído (por exemplo, comparar a Figura 3a, B versus Figura 3D , E).
Etapas críticas no protocolo incluem o uso de paraformaldeído fresco e um tempo de fixação curto para manter SUMO nativamente dobrado para que ele possa ser reconhecido por kmUTAG. Também, o tratamento breve de pilhas fixas com a baixa solução da glicina do pH aumenta sua sensibilidade para SUMO. No entanto, nem todas as amostras podem se emprestar à análise com KmUTAG-FL. Tal como com protocolos baseados em anticorpos, ao tentar localizar SUMO em novos tipos de células ou tecidos, a escolha do detergente e as concentrações de detergente podem ser variáveis importantes. Em última análise, planejamos gerar variantes adicionais de KmUTAG-FL, incluindo uma proteína kmUTAG de penetração celular que pode ser usada para detectar a dinâmica de SUMO em células vivas, organóides e biópsias de tecidos.
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Disclosures
Reagentes kmUTAG recombinantes são fornecidos à comunidade de pesquisa via Kerafast.com.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Kerscher por seu apoio, Nathalie Nguyen para a leitura crítica do manuscrito, e Lidia EPP para seqüenciamento. Este trabalho tem sido apoiado pelo Commonwealth Research comercialização fundo MF16-034-LS para OK. O apoio à pesquisa para estudantes de W & M foi fornecido pelo fundo de pesquisa Bailey-Huston, e Charles Center Honors bolsas para RY e CH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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