本文介绍了一种基于FRET的流式细胞测定方案,用于量化S.cerevisae和HEK293T细胞中的蛋白质自组装。
蛋白质自组装控制蛋白质功能,并在空间和时间上划分细胞过程。目前研究它的方法具有低灵敏度、间接读出、吞吐量有限和/或总体水平而非单单元分辨率。我们设计了一种基于流式细胞学的单一方法,解决了所有这些限制:分布式反源性FRET或DAmFRET。DAmFRET 通过体内的敏感排放 FRET 检测和量化蛋白质自组装,支持跨模型系统(从酵母到人体细胞)进行部署,并实现灵敏的单细胞、高通量读出,而与蛋白质无关本地化或溶解性。
研究同质蛋白相互作用或”自组装”的测定很重要,因为蛋白质的寡聚状态和溶解度决定了它们的功能。蛋白质组比比皆是,同种多子1,2,3,4,而相对较少的蛋白质作为单体功能。蛋白质也可能由于压力、年龄或调节不当而异常地聚集,从而导致活动的病理变化。确定调整此类事件的因素,甚至组件的物理性质,通常具有异常困难。
越来越多的蛋白质现在被承认以非凡的协同性和不确定的化学测量自组装,导致它们从其他细胞成分中混合,作为蛋白质密集阶段。这些形式为无序的冷凝水,如液滴和凝胶,或高度有序的细丝,如淀粉样纤维。与后者相关的构象波动使其初始形成,或成核,在分子级5,6中固有的概率。由于成核的概率随体积而缩放,因此在活细胞7、8的空间范围内,这种组件的形成可能是高度随机的。在随机成核有限相分离的极端是prion,高度有序的蛋白质组件,很少是自发成核,但一旦形成,模板自己的增长无限期。其中一种蛋白质,称为ASC,在哺乳动物先天免疫细胞的活性中执行一种类似数字的病毒状开关。ASC 自组装通过它与特定蛋白质的相互作用而成核,这些蛋白质在结合病原体或危险相关分子模式时自行被排斥。ASC组件依次成核procaspase-1自组装和激活,导致细胞因子成熟和细胞9,10的丙酮化。负责其组装的ASC区域属于死亡域超级家族,由人类蛋白酶中的一百多个成员组成。尽管死亡领域在先天免疫和程序化细胞死亡中起着关键作用,但大多数尚未在自我组装方面得到特征。通过直接的单细胞读出蛋白质自组装,将大大促进具有此类行为的其他蛋白质的发现和表征。
研究蛋白质自组装的经典蛋白质生物化学方法,如尺寸排除色谱和超离心,主要限于种群水平评估。但是,不能用这种详细级别对成核限制相变产生的细胞对细胞异质性进行建模。基于荧光显微镜的单细胞方法重新获得这一能力,但缺乏准确量化成核或检测稀有组件所需的吞吐量。此外,可溶性自组装,如大多数酶和淀粉样蛋白寡聚物,太小,流动性小,无法通过标准光显微镜解决。它们可以通过更复杂的方法(如荧光相关光谱法)进行检测,但这些在细胞数量和吞吐量方面非常有限。
基于邻近性的蛋白质组装测定,如FRET和裂解荧光酸补性,为这些问题提供了潜在的解决方案。然而,它们通常要求使用两种不同的结构来表达与互补标记融合的兴趣蛋白——在FRET的情况下,供体和受体荧光量。这损害了实验吞吐量,也降低了由于供体和受体相对水平的细胞到细胞的变化而降低灵敏度。为了规避这种情况,我们设计了一种采用光可转换荧光荧光团(mEos3.111)的测定方法,它允许单个结构来表达供体和受体标记的蛋白质。未转换的 mEos3.1(类似 GFP 的供体)的发射光谱与光转换 mEos3.1(dsRed 样受体)的激发光谱充分重叠,使 FRET 在分子接近时发生(<10 nm)。因此,通过将细胞暴露于经验确定的剂量为 405 nm 光,该光束将总 mEos3.1 的最佳分数转换为受体形式,我们实现了多个样本中供体和受体的一致且可重复的相对水平,表达水平和实验。当使用 561 nm 光直接激发时,或者间接(通过来自捐赠者的能量传递)使用 488 nm 光(即敏感发射 FRET)测量受体荧光。我们报告蛋白质组装是这两个值的比例,并称之为非交响FRET或AmFRET。
为了按流式细胞测量计算蛋白质浓度,我们首先计算用mEos3.1标记的Spc42的平均荧光强度。由于酵母细胞含有大约1000个Spc42分子,我们然后计算单个荧光绿色mEos3.1分子的荧光强度。通过利用所有细胞浓度的均匀光转换(图1E),我们再关联光转换后所有接受器强度的总mEos3.1荧光值。然后,我们能够将荧光蛋白的摩尔总数除以近似的细胞体积(根据使用成像流细胞测定法确定),以获得感兴趣的蛋白质的总细胞浓度。如获得准确计算,请参阅原稿8。
通过表达酵母中2+质粒中的mEos3.1融合蛋白,我们在每个样品8中探讨大约千倍的蛋白质浓度范围。我们在HEK293T细胞中通过在转染过程中质粒的变异而达到同样的结果,因此,复印数也可变。
AmFRET,或DAmFRET对数千个细胞的分布揭示了任何感兴趣的蛋白质在细胞醇中自我组装的浓度依赖性。总体而言,DAmFRET 是一种能够发现和描述蛋白质自组装的方法,具有前所未有的灵敏度、吞吐量和可重复性组合。
虽然使用成像细胞仪使我们能够获得体内蛋白质浓度测量,但大多数研究机构尚未提供此类细胞计。然而,DAmFRET甚至可以在典型的非成像细胞仪中运行,以获得蛋白质表达范围内的蛋白质组装分布。
DAmFRET 是检测体内蛋白质自组装的最全面的方法。DAmFRET 将高浓度、单细胞分辨率和高通量蛋白相互作用的直接读出相结合。直接读取 DAmFRET 和融合蛋白不需要特定的亚细胞定位或不溶性状态,消除了误报,并将其适用性扩展到其原生亚细胞位置的各种蛋白质。值得注意的是,通过标记细胞器与荧光团3.1在光谱上相容的荧光团,如T-蓝宝石和mCardinal,可以确定可溶性和组装形式的蛋白质的亚细胞定位与DAmFRET。
使用此处所述的成像流细胞仪,需要 8 小时分析每孔约 20,000 个门控单元的 96 孔板。但是,我们还定期使用标准(非成像)细胞仪执行 DAmFRET,以实现更高的吞吐量(每分钟最多 20 个样本)。事实上,任何具有空间分离的 488 和 561 nm 激光器的流式细胞仪,这些激光器没有对数和伪影,并且具有适当的 PMT 和滤波器来检测供体、FRET 和受体信号,足以执行 DAmFRET。目前,吞吐量的这种增加是以本地化信息和体积确定为代价的,因此,必须将自组装分析为蛋白质表达的函数,而不是浓度。这不是定性分析的问题。此外,通过将光谱上独特的荧光荧光酸熔融到内源性”内生”内生”内生”管理”蛋白质,其表达与细胞体积密切相关,可以估计细胞体积。
正如我们在酵母和哺乳动物细胞中部署DAmFRET所证明的那样,DAmFRET可以很容易地适应不同的表达系统。这使得蛋白质的自组装可以在其原生细胞环境中被研究。此外,它还能够比较不同细胞培养模型的蛋白质组装,以研究控制蛋白质自组装的机制的保存。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢杰夫·兰格、杰伊·恩鲁、吴建正、塔里克·汗和埃伦·凯特为开发测定所做的工作。这项工作的部分原因是,作为分别在英国开放大学和美国斯托尔斯医学研究所研究生院注册的学生,T.S.K.和A.R.G的博士博士理论研究要求。其他与测定相关的信息可在https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016中找到。本手稿的原始数据可以从 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372 的 Stowers 原始数据存储库访问。这项工作由NIH主任的早期独立奖DP5-OD009152、Dimes基金会第5-Fy17-32期赠款和斯塔斯医学研究所资助。
作者贡献如下。概念化:T.S.K.、S.V.和R.H.;方法:T.S.K.、S.V.、A.R.G.和A.B;调查:S.V.、T.S.K.和A.R.G.;正式分析:S.V.和T.S.K.;数据整理:T.S.K.;可视化:T.S.K 和 S.V.,写作(原稿):S.V.和 T.S.K.;写作(审阅、编辑):R.H.、S.V.和T.S.K.;和融资收购:R.H.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |