Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.
Eiwit zelf assemblage regelt de eiwit functie en compartimendt cellulaire processen in ruimte en tijd. De huidige methoden om het te bestuderen hebben last van lage gevoeligheid, indirecte Read-outs, beperkte doorvoer en/of bevolkingsniveau in plaats van een resolutie van één cel. We ontwierpen een flow cytometrie-gebaseerde enkelvoudige methodologie die al deze beperkingen behandelt: verspreide Amphifluoristische FRET of DAmFRET. DAmFRET detecteert en kwantificeert eiwit-zelf assemblages door gesensibiliseerde emissie FRET in vivo, maakt implementatie over modelsystemen mogelijk-van gist tot menselijke cellen-en bereikt gevoelige, eencellige, high-throughput Lees-outs, ongeacht eiwit lokalisatie of oplosbaarheid.
Assays voor het bestuderen van homotypische eiwit interacties, of “zelf-assemblage” zijn belangrijk omdat de oligomere toestand en oplosbaarheid van eiwitten dicteren hun functie. Het proteoom is overvloedig met homo-multimers1,2,3,4, terwijl relatief weinig eiwitten functioneren als monomeren. Eiwitten kunnen ook aberrantly assembleren als gevolg van stress, leeftijd of misregulering, wat leidt tot pathologische veranderingen in activiteit. Het identificeren van de factoren die dergelijke gebeurtenissen, of zelfs de fysieke aard van de assemblages moduleren, is vaak uitzonderlijk uitdagend.
Een groeiend aantal eiwitten zijn nu erkend om zichzelf te monteren met buitengewone cooperativiteit en onbepaalde stoichiometrie, resulterend in hun demenging van andere cellulaire bestanddelen, als eiwit-dichte fasen. Deze hebben de vorm van ongeordende condensaten, zoals druppels en gels, of sterk geordende filamenten, zoals amyloïde vezels. De conformationele fluctuaties in verband met laatstgenoemde maken de initiële vorming, of nucleatie, inherent probabilistisch op moleculair niveau5,6. Omdat de waarschijnlijkheid van nucleatie schaalt met volume, kan de vorming van dergelijke assemblages zeer stochastisch zijn in de ruimtelijke grenzen van levende cellen7,8. In het uiterste van stochastische nucleatie-beperkte fasescheiding zijn prionen, hoog geordende eiwit assemblages die slechts zelden nucleaat spontaan, maar eenmaal gevormd, sjabloon hun eigen groei voor onbepaalde tijd. Een dergelijk eiwit, dat bekend staat als ASC, voert een digitale prion-achtige schakelaar uit in de activiteit van aangeboren immuuncellen van zoogdieren. ASC zelf montage wordt nucleated door zijn interactie met specifieke eiwitten die zichzelf hebben oligomerized op bindende pathogeen-of gevaar-geassocieerde moleculaire patronen. De ASC assemblies op hun beurt nucleaat procaspase-1 om zichzelf te monteren en te activeren, wat leidt tot cytokine rijping en pyroptosis van de cel9,10. De regio van ASC die verantwoordelijk is voor de assemblage behoort tot de Death domein superfamilie, die bestaat uit meer dan 100 leden in het menselijke proteome. Ondanks de cruciale rollen van de dood domeinen in aangeboren immuniteit en geprogrammeerde celdood, de meeste van hen hebben nog niet gekarakteriseerd met betrekking tot zelf-assemblage. De ontdekking en karakterisering van extra eiwitten met dergelijk gedrag zal sterk worden vergemakkelijkt door een directe, eencellige uitlezen van eiwit zelf montage.
Klassieke eiwit biochemie benaderingen om zelf assemblage van eiwitten te bestuderen, zoals grootte-uitsluitings chromatografie en ultracentrifugatie, zijn grotendeels beperkt tot beoordelingen van bevolkingsniveau. Echter, cel-naar-cel heterogeniteit als gevolg van nucleatie-beperkte faseovergangen kunnen niet worden gemodelleerd met dit detailniveau. Eencellige benaderingen op basis van fluorescentiemicroscopie herwinnen deze mogelijkheid, maar missen de doorvoer die nodig is om de nucleatie nauwkeurig te kwantificeren of om zeldzame assemblages te detecteren. Bovendien, oplosbare zelf-assemblages zoals de meeste enzymen en pre-amyloïde oligomeren, zijn te klein en mobiel om te worden opgelost door standaard Lichtmicroscopie. Ze kunnen worden gedetecteerd door meer geavanceerde benaderingen zoals fluorescentie correlatie spectroscopie, maar deze zijn zeer beperkt in het aantal cellen en de doorvoer.
Proximity-gebaseerde assays van eiwit assemblage, zoals fret en Split de complementatie, bieden een mogelijke oplossing voor deze problemen. Echter, ze vereisen in het algemeen het gebruik van twee verschillende constructies uitdrukken van het eiwit van belang gefuseerd aan aanvullende labels-de donor en acceptor fluorofores in het geval van FRET. Dit compromitteert experimentele doorvoer en vermindert ook de gevoeligheid als gevolg van cel-naar-cel variatie in de relatieve niveaus van donor en acceptor. Om dit te omzeilen, ontwierpen we een assay die gebruik maakt van een fotoconvertible fluorophore, mEos 3.111, waarmee één constructie zowel donor-als acceptor-gelabeld eiwit kan uitdrukken. Het emissiespectrum van niet-geconverteerde mEos 3.1 (GFP-achtige donor) overlapt voldoende met het excitatie spectrum van fotogeconverteerde mEos 3.1 (dsRed-achtige acceptor) om FRET te laten optreden wanneer de moleculen in de buurt zijn (< 10 nm). Dus, door cellen bloot te stellen aan een empirisch bepaalde dosis van 405 nm licht, die een optimale Fractie van totaal mEos 3.1 in de acceptor vorm converteert, bereiken we consistente en reproduceerbare relatieve niveaus van donor en acceptor over meerdere monsters, expressieniveaus en experimenten. We meten de acceptor fluorescentie wanneer opgewonden ofwel rechtstreeks met 561 nm licht, of indirect (door energie overdracht van de donor) met 488 nm licht (d.w.z. gesensibiliseerde emissie FRET). We rapporteren eiwit assemblage als de verhouding van deze twee waarden en term het amphifluoric FRET of AmFRET.
Om de eiwitconcentratie te berekenen door Flowcytometrie, berekenen we eerst de gemiddelde fluorescentie intensiteit van Spc42 gelabeld met mEos 3.1. Omdat gistcellen ongeveer 1000 moleculen van Spc42 bevatten, berekenen we vervolgens de intensiteit van de fluorescentie van een enkele fluorescerende groene mEos 3.1 molecuul. Door gebruik te maken van de gelijkmatige foto conversie bij alle cellulaire concentraties (Figuur 1e), correleren we vervolgens de totale MEOS 3.1 fluorescentie waarden voor alle acceptor-intensiteiten na foto conversie. Vervolgens kunnen we het totale aantal mollen van fluorescerende eiwitten verdelen door het geschatte cytosolische volume (zoals bepaald met behulp van Imaging flow cytometrie) om de totale cytosolische concentratie van het eiwit van belang te verkrijgen. Voor exacte berekeningen raadpleegt u het originele manuscript8.
Door de mEos 3.1-gesmolten proteïne uit een 2μ plasmide in gist uit te drukken, geven we een ongeveer duizend-voudige reeks eiwit concentraties in elk monster8. We bereiken hetzelfde in HEK293T cellen op grond van variatie in plasmide opname tijdens transfectie, en dus variabel kopie nummer.
De resulterende verdeling van AmFRET, of DAmFRET, voor vele duizenden cellen onthult de concentratie-afhankelijkheid van zelf-assemblage in de cytosol voor elk eiwit van belang. Over het algemeen vertegenwoordigt DAmFRET een faciliterende methodologie om de zelf montage van eiwitten te ontdekken en karakteriseren met een ongekende combinatie van gevoeligheid, doorvoer en reproduceerbaarheid.
Terwijl het gebruik van een beeldvormings cytometer ons in staat stelt om in vivo eiwitconcentratie metingen te verkrijgen, zijn dergelijke Cytometers nog niet beschikbaar bij de meeste onderzoeksinstellingen. Desondanks kan DAmFRET zelfs in een typische niet-beeldvormings cytometer worden uitgevoerd om distributies van eiwit assemblage over het bereik van eiwit expressie te krijgen.
DAmFRET is de meest uitgebreide methode om zelf montage van eiwitten in vivo te detecteren. DAmFRET combineert direct uitlezen van homotypische eiwit-eiwit interacties over een breed scala aan concentraties, met een enkelvoudige celresolutie en een hoge doorvoer. De directe read-out van DAmFRET en het feit dat de gesmolten eiwitten geen specifieke subcellulaire lokalisatie of onoplosbare toestand vereisen, elimineert valse positieven en breidt de toepasbaarheid ervan uit tot een breed scala aan eiwitten op hun inheemse subcellulaire locaties. Met name door het labelen van organellen met fluoroforen die spectraaal compatibel zijn met mEos 3.1, zoals T-Sapphire en mCardinal, kan de subcellulaire lokalisatie van oplosbare en geassembleerde vormen van eiwitten samen met DAmFRET worden bepaald.
Met behulp van de Imaging flow cytometer zoals hier beschreven, duurt het 8 uur om een 96-goed plaat te analyseren met ongeveer 20.000 gated cellen per put. We voeren echter ook routinematig DAmFRET uit met standaard (niet-beeldvormende) Cytometers die een veel hogere doorvoer bereiken (tot 20 samples per minuut). In feite is elke flow-cytometer met ruimtelijk gescheiden 488-en 561 nm-lasers die vrij is van logamp-artefacten en beschikt over de juiste PMTs en filters voor het opsporen van donor-, FRET-en acceptor-signalen voldoende om DAmFRET uit te voeren. Op dit moment komt deze winst in doorvoer ten koste van lokalisatie-informatie en volume bepaling, zodat zelf montage vervolgens moet worden geanalyseerd als een functie van eiwit expressie in plaats van concentratie. Dit is geen probleem voor kwalitatieve analyses. Bovendien kan het mogelijk zijn om het cytosolische volume te schatten door een spectraaal verschillende de te fusing naar een endogene “huishoud eiwit” waarvan de uitdrukking strak correleert met cytosolische volume.
Zoals we hebben laten zien door onze inzet van DAmFRET in zowel gist als zoogdiercellen, kan DAmFRET gemakkelijk worden aangepast aan verschillende uitdrukkings systemen. Hierdoor kan de zelf montage van eiwitten in hun inheemse cellulaire contexten worden bestudeerd. Bovendien biedt het de mogelijkheid om eiwit assemblage te vergelijken in zeer uiteenlopende celcultuurmodellen om het behoud van mechanismen te bestuderen die de zelf montage van eiwitten beheersen.
The authors have nothing to disclose.
We willen Jeff lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan en Ellen ketter bedanken voor hun werk aan de ontwikkeling van de assay. Dit werk werd gedaan om gedeeltelijk te voldoen aan de vereisten voor doctoraatsonderzoek voor T.S.K. en A. R. G als studenten geregistreerd bij de Open University, UK, en de Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, respectievelijk. Aanvullende assay-gerelateerde informatie is te vinden op https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Originele gegevens die aan dit manuscript zijn gelinkt, kunnen worden geraadpleegd vanuit de Stowers Original data repository op http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Dit werk werd gefinancierd door de vroege onafhankelijkheids prijs van NIH Director DP5-OD009152, maart van Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-32, en het Stowers Institute for Medical Research.
Bijdragen van de auteur zijn als volgt. Conceptualisatie: T.S.K., SV en R.H.; Methodologie: T.S.K., SV, A.R.G. en A. B; Onderzoek: SV, T.S.K. en A.R.G.; Formele analyse: SV, en T.S.K.; Data-Curation: T.S.K.; Visualisatie: T. S. K, en SV, schrijven (origineel concept): SV, en T.S.K.; Schrijven (revisie, redactie): R.H., SV en T.S.K.; en financiering acquisitie: R.H.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |