Este artigo descreve um protocolo fret-based do citometria do fluxo para quantificar o Self-assembly da proteína em células de S. cerevisiae e de HEK293T.
A auto-montagem da proteína governa a função da proteína e compartimentaliza processos celulares no espaço e no tempo. Os métodos atuais para estudá-lo sofrem de baixa sensibilidade, leitura indireta, taxa de transferência limitada e/ou nível de população em vez de resolução de célula única. Nós projetamos uma metodologia única baseada em citometria de fluxo que aborda todas essas limitações: FRET ou DAmFRET de Anfífluoricos distribuídos. DAmFRET detecta e quantifica auto-montagens de proteínas por emissão sensibilizada FRET in vivo, permite a implantação através de sistemas de modelo-de levedura para células humanas-e atinge sensível, Single-Cell, high-throughput de leitura-outs independentemente da proteína localização ou solubilidade.
Os ensaios para estudar interações de proteínas neutralizantes, ou “automontagem” são importantes porque o estado oligomérico e a solubilidade das proteínas determinam sua função. O proteoma abunda com homo-multimers1,2,3,4, enquanto relativamente poucas proteínas funcionam como monómeros. As proteínas também podem montar aberrantemente devido ao stress, idade ou desregulação, levando a alterações patológicas na atividade. Identificar os fatores que modulam tais eventos, ou mesmo a natureza física das assembléias, é muitas vezes excepcionalmente desafiador.
Um número crescente de proteínas são agora reconhecidos para se automontar com extraordinária cooperatividade e estequiometria indeterminada, resultando em sua demixing de outros constituintes celulares, como fases proteínas-densas. Estes tomam a forma de condensados desordenados, tais como gotículas e géis, ou filamentos altamente ordenados, tais como fibras amilóides. As flutuações conformacionais associadas a este último tornam sua formação inicial, ou nucleação, inerentemente probabilística no nível molecular5,6. Como a probabilidade de escalas de nucleação com volume, a formação de tais montagens pode ser altamente estocástica nos limites espaciais das células vivas7,8. No extremo da separação de fase limitada de nucleação estocástica são prions, conjuntos de proteínas altamente ordenados que raramente nucleam espontaneamente, mas uma vez formados, modelam seu próprio crescimento indefinidamente. Uma dessas proteínas, conhecida como ASC, executa um interruptor como prion digital na atividade de células imunes inatas de mamíferos. A auto-montagem ASC é nucleada por sua interação com proteínas específicas que se têm oligomerizadas ao patógeno vinculativo ou padrões moleculares associados ao perigo. Os conjuntos ASC, por sua vez, nucleam procaspase-1 para automontar e ativar, levando à maturação de citocinas e piroptose da célula9,10. A região da ASC responsável por sua montagem pertence à superfamília do domínio da morte, que consiste em mais de 100 membros no Proteome humano. Apesar dos papéis cruciais dos domínios da morte na imunidade inata e na morte celular programada, a maioria deles ainda não se caracterizou em relação à automontagem. A descoberta e a caracterização de proteínas adicionais com tal comportamento serão facilitadas extremamente por um leitura direto, da único-pilha do self-assembly da proteína.
As abordagens de bioquímica de proteínas clássicas para estudar a automontagem de proteínas, como a cromatografia de exclusão de tamanho e a ultracentragem, são largamente limitadas às avaliações de nível populacional. No entanto, a heterogeneidade célula a célula resultante de transições de fase limitadas por nucleação não pode ser modelada com esse nível de detalhe. As aproximações da único-pilha baseadas na microscopia de fluorescência recuperam esta capacidade, mas faltam a taxa de transferência necessária para quantificar com precisão a nucleação ou para detectar montagens raras. Além disso, os self-assemblies solúveis tais como a maioria de enzimas e oligomers do pre-amyloid, são demasiado pequenos e móveis a ser resolvidos pela microscopia de luz padrão. Eles podem ser detectados por abordagens mais sofisticadas, como espectroscopia de correlação de fluorescência, mas elas são muito limitadas no número de células e na taxa de transferência.
Os ensaios de proximidade de conjunto proteico, como o FRET e a complementação do fluoróforo dividido, oferecem uma solução potencial para esses problemas. No entanto, eles geralmente exigem o uso de dois diferentes construtos expressando a proteína de interesse fundido com tags complementares-os fluoróforos doador e aceitador no caso da FRET. Isto compromete a taxa de transferência experimental e igualmente reduz a sensibilidade devido à variação da pilha-à-pilha nos níveis relativos de doador e de acceptor. Para contornar isso, projetamos um ensaio que emprega um fluoróforo fotoconversível, mEos 3.111, que permite que um único construto expresse tanto a proteína doador-e aceitadora-etiquetada. O espectro das emissões de mEos não convertidos 3.1 (GFP-como o doador) sobrepõe-se suficientemente com o espectro da excitação de mEos photoconvertido 3.1 (dsRed-como o Acceptor) para permitir que o FRET ocorra quando as moléculas estão na proximidade próxima (< 10 nanômetro). Assim, expondo as células a uma dose empiricamente determinada de 405 nm de luz, que fotoconverte uma fração óptima do total de mEos 3.1 na forma aceitadora, nós alcançamos níveis relativos consistentes e reprodutíveis de doador e aceitador em várias amostras, níveis de expressão e experimentos. Nós medimos a fluorescência do aceitador quando excitado diretamente com luz de 561 nanômetro, ou indiretamente (pela transferência de energia do doador) com luz de 488 nanômetro (isto é, FRET sensibilizado da emissão). Nós relatamos o conjunto da proteína como a relação destes dois valores e termo ele traste amphifluoric ou AmFRET.
A fim de calcular a concentração proteica por citometria de fluxo, primeiro calculamos a intensidade média de fluorescência de Spc42 marcada com os mEos 3.1. Como as células de levedura contêm aproximadamente 1000 moléculas de Spc42, calculamos então a intensidade da fluorescência de uma única molécula verde fluorescente de mEos 3.1. Ao alavancar a fotoconversão mesmo em todas as concentrações celulares (Figura 1e), correlacionamos, então, os valores totais de fluorescência de meos 3.1 para todas as intensidades aceptoras após a fotoconversão. Em seguida, podemos dividir o número total de moles de proteínas fluorescentes pelo volume citosólico aproximado (como determinado usando citometria de fluxo de imagem) para obter a concentração citosólica total da proteína de interesse. Para cálculos exatos, por favor, consulte o manuscrito original8.
Ao expressar os mEos 3,1-proteína fundida a partir de um plasmídeo 2μ em levedura, nós sonda uma faixa de aproximadamente mil vezes de concentração de proteínas em cada amostra8. Nós alcançamos o mesmo em células HEK293T em virtude da variação na captação do plasmídeo durante o transfection, e daqui número variável da cópia.
A distribuição resultante de amfret, ou damfret, para muitos milhares de pilhas revela a concentração-dependência do self-assembly no citosol para toda a proteína do interesse. No geral, o DAmFRET representa uma metodologia capacitando para descobrir e caracterizar a automontagem de proteínas com uma combinação inédita de sensibilidade, throughput e reprodutibilidade.
Ao usar um citômetro da imagem latente permite-nos de obter medições in vivo da concentração da proteína, tais citômetros não estão ainda disponíveis em a maioria de instituições de pesquisa. Não obstante, damfret pode ser funcionado mesmo em um citômetro não-imagem típico para começ distribuições do conjunto da proteína sobre a escala da expressão da proteína.
DAmFRET é o método mais abrangente para detectar a automontagem de proteínas in vivo. Damfret combina o Read-Out direto de interações neutralizantes da proteína-proteína sobre uma escala larga da concentração, com a única definição da pilha e a taxa de transferência elevada. O Read-Out direto de DAmFRET e o fato de que as proteínas fundidas não exigem uma localização Subcellular específica ou um estado insolúvel elimina positivos falsos e estende sua aplicabilidade a uma escala larga das proteínas em seus locais subcellular nativos. Notavelmente, marcando organelas com fluoróforos que são espectralmente compatíveis com os mEos 3.1, como T-Sapphire e mCardinal, a localização subcelular de formas solúveis e montadas de proteínas pode ser determinada ao lado de DAmFRET.
Usando o citômetro do fluxo da imagem latente como descrito aqui, toma 8 h para analisar uma placa 96-well com aproximadamente 20.000 pilhas fechadas por bem. No entanto, também rotineiramente realizamos DAmFRET com citometros padrão (não-imagem) que atingem uma taxa de transferência muito maior (até 20 amostras por minuto). De facto, todo o citômetro do fluxo com os lasers espacialmente separados de 488 e de 561 nanômetro que é livre dos artefatos do ampère do registro e tem os PMTs apropriados e os filtros para detectar o doador, o fret, e os sinais do Acceptor são suficientes executar damfret. Presentemente, este ganho na taxa de transferência vem à custa da informação da localização e da determinação do volume, tais que o Self-assembly deve então ser analisado em função da expressão da proteína um pouco do que a concentração. Este não é um problema para análises qualitativas. Adicionalmente, pode ser possível estimar o volume citosólico por fusão um fluoróforo especèstica distinto a uma proteína endógena do “Housekeeping” cuja a expressão correlaciona firmemente com volume citosólico.
Como temos demonstrado através da nossa implantação de DAmFRET em ambas as células de levedura e de mamíferos, DAmFRET pode ser facilmente adaptado para diferentes sistemas de expressão. Isto permite que o Self-assembly das proteínas seja estudado em seus contextos celulares nativos. Além disso, oferece a habilidade de comparar a montagem da proteína através dos modelos extensamente divergentes da pilha-cultura para estudar a conservação dos mecanismos que governam o Self-assembly da proteína.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan, e Ellen ketter por seu trabalho para o desenvolvimento do ensaio. Este trabalho foi feito para cumprir, em parte, os requisitos para a pesquisa de teses de doutorado para T.S.K. e a. R. G como estudantes cadastrados na Universidade aberta, Reino Unido, e no Instituto de pós-graduação de pesquisa médica da faculdade de medicina, EUA, respectivamente. Informações adicionais relacionadas com o ensaio podem ser encontradas em https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Os dados originais subjacentes a este manuscrito podem ser acessados a partir do repositório de dados original do Stowers em http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de independência antecipada do diretor da NIH DP5-OD009152, March of Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-32, e o Instituto de pesquisas médicas da Stowers.
Contribuições do autor são as seguintes. Conceitualização: T.S.K., SV e H.R.; Metodologia: T.S.K., SV, A.R.G., e A. B; Investigação: SV, T.S.K. e A.R.G.; Análise formal: SV, e T.S.K.; Curation dos dados: T.S.K.; Visualização: T. S. K e SV, escrita (rascunho original): SV, e T.S.K.; Redação (revisão, edição): H.R., SV e T.S.K.; e aquisição de financiamento: H.R.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |