Dieser Artikel beschreibt ein FRET-basiertes Flow-Zytometrie-Protokoll zur Quantifizierung der Protein-Selbstmontage in s. cerevisiae- und HEK293T-Zellen.
Die Protein-Selbstmontage bestimmt die Proteinfunktion und unterteilt zelluläre Prozesse in Raum und Zeit. Aktuelle Methoden, um es zu untersuchen, leiden unter geringer Empfindlichkeit, indirekten Auslesungen, begrenztem Durchsatz und/oder Bevölkerungsebene anstelle einer Einzelzellenauflösung. Wir haben eine auf Flow Cytometry basierende Einzelmethodik entwickelt, die alle diese Einschränkungen anspricht: Distributed Amphifluoric FRET oder DAmFRET. DAmFRET erkennt und quantifiziert Protein-Selbstbaugruppen durch sensibilisierte Emission FRET in vivo, ermöglicht den Einsatz über Modellsysteme hinweg – von Hefe bis zu menschlichen Zellen – und erreicht empfindliche, einzellige, hochdurchsatzige Auslesungen unabhängig von Proteinen Lokalisierung oder Löslichkeit.
Assays zur Untersuchung homotypischer Proteinwechselwirkungen oder “Selbstmontage” sind wichtig, weil der oligomere Zustand und die Löslichkeit von Proteinen ihre Funktion diktieren. Das Proteom ist reich an Homo-Multimern1,2,3,4, während relativ wenige Proteine als Monomere fungieren. Proteine können sich auch aufgrund von Stress, Alter oder Fehlregulation enden, was zu pathologischen Veränderungen in der Aktivität führt. Die Identifizierung der Faktoren, die solche Ereignisse modulieren, oder sogar die physikalische Natur der Baugruppen, ist oft eine außerordentliche Herausforderung.
Eine wachsende Zahl von Proteinen wird heute erkannt, um sich mit außergewöhnlicher Kooptativität und unbestimmter Stoichiometrie selbst zu montieren, was zu ihrer Demischung von anderen zellulären Bestandteilen, als proteindichte Phasen führt. Diese haben die Form von ungeordneten Kondensaten, wie Tröpfchen und Gele, oder hoch geordneten Filamenten, wie Amyloidfasern. Die mit letzterem verbundenen Konformationsschwankungen machen ihre Anfangsbildung oder Keimbildung von Natur aus probabilistisch auf der molekularen Ebene5,6. Da die Wahrscheinlichkeit von Keimungsskalen mit Volumen, die Bildung solcher Baugruppen kann in den räumlichen Grenzen der lebenden Zellen7,8sein. Am äußersten Ende der stochastischen Nukleations-begrenzte Phasentrennung befinden sich Prionen, hochgeordnete Proteinassemblys, die nur selten spontan, aber einmal gebildet ihr eigenes Wachstum auf unbestimmte Zeit zünten. Ein solches Protein, bekannt als ASC, führt einen digitalen prionartigen Schalter in der Aktivität von angeborenen Immunzellen von Säugetieren aus. Die ASC-Selbstmontage wird durch ihre Wechselwirkung mit spezifischen Proteinen, die sich selbst oligomerisiert haben, durch bindung von pathogenen oder gefahrenassoziierten molekularen Mustern nukleiert. Die ASC-Baugruppen wiederum nukleate Procaspase-1 zur Selbstmontage und Aktivierung, was zu Zytokinreifung und Pyroptose der Zelle9,10führt. Die Region des ASC, die für ihre Versammlung verantwortlich ist, gehört zur Überfamilie der Todesdomäne, die aus über hundert Mitgliedern des menschlichen Proteoms besteht. Trotz der zentralen Rollen von Todesdomänen in der angeborenen Immunität und programmierten Zelltod, die meisten von ihnen sind noch nicht in Bezug auf Die Selbstmontage gekennzeichnet. Die Entdeckung und Charakterisierung zusätzlicher Proteine mit einem solchen Verhalten wird durch eine direkte, einzellige Auslesung der Proteinselbstmontage erheblich erleichtert.
Klassische Proteinbiochemie-Ansätze zur Untersuchung der Protein-Selbstmontage, wie Größenausschlusschromatographie und Ultrazentrifugation, beschränken sich weitgehend auf Populationsebenenbewertungen. Die Heterogenität von Zelle zu Zelle, die sich aus Nukleationsbegrenzten Phasenübergängen ergibt, kann jedoch nicht mit dieser Detailgenauigkeit modelliert werden. Einzellige Ansätze, die auf der Fluoreszenzmikroskopie basieren, gewinnen diese Fähigkeit wieder, aber es fehlt der erforderliche Durchsatz, um die Keimbildung genau zu quantifizieren oder seltene Baugruppen zu erkennen. Darüber hinaus sind lösliche Selbstbaugruppen wie die meisten Enzyme und Prä-Amyloid-Oligomere zu klein und mobil, um durch standardleichte Mikroskopie gelöst zu werden. Sie können durch ausgefeiltere Ansätze wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie nachgewiesen werden, aber diese sind in Der zellzahlierlicher und durchsatzsehr begrenzter Art.
Näherungsbasierte Assays der Proteinzusammensetzung, wie FRET und Split-Fluorophor-Komplementierung, bieten eine mögliche Lösung für diese Probleme. Sie erfordern jedoch in der Regel die Verwendung von zwei verschiedenen Konstrukten, die das Protein von Interesse ausdrücken, das zu ergänzenden Tags verschmolzen wird – spender- und akzeptierende Fluorophore im Falle von FRET. Dies beeinträchtigt den experimentellen Durchsatz und reduziert auch die Empfindlichkeit aufgrund von Zell-zu-Zell-Variationen in den relativen Konzentrationen von Spender und Akzeptor. Um dies zu umgehen, haben wir einen Test entworfen, der ein photokonvertierbares Fluorophor, mEos3.111, verwendet, das es einem einzigen Konstrukt ermöglicht, sowohl Spender- als auch Mit-Akzeptanz-Protein auszudrücken. Das Emissionsspektrum von unkonvertiertem mEos3.1 (GFP-ähnlicher Spender) überschneidet sich ausreichend mit dem Anregungsspektrum von photoconverted mEos3.1 (dsRed-like acceptor), um FRET auftreten zu lassen, wenn sich die Moleküle in unmittelbarer Nähe befinden (<10 nm). Durch die Exposition der Zellen einer empirisch ermittelten Dosis von 405 nm Licht, die einen optimalen Anteil der GesamtmEos3.1 in die Akzeptorform photoconvertiert, erreichen wir konsistente und reproduzierbare relative Spender- und Akzeptorspiegel über mehrere Proben hinweg, Expressionsebenen und Experimenten. Wir messen die Akzeptorfluoreszenz, wenn wir entweder direkt mit 561 nm Licht oder indirekt (durch Energieübertragung vom Spender) mit 488 nm Licht (d.h. sensibilisierte Emission FRET) angeregt werden. Wir berichten Protein-Montage als das Verhältnis dieser beiden Werte und sprechen es amphifluoric FRET oder AmFRET.
Um die Proteinkonzentration durch Durchflusszytometrie zu berechnen, berechnen wir zunächst die mittlere Fluoreszenzintensität von Spc42 mit mEos3.1. Da Hefezellen etwa 1000 Moleküle von Spc42 enthalten, berechnen wir dann die Fluoreszenzintensität eines einzelnen fluoreszierenden grünen mEos3.1 Moleküls. Durch die Nutzung der gleichmäßigen Photokonversion bei allen zellulären Konzentrationen (Abbildung 1E) korrelieren wir dann die Gesamtfluoreszenzwerte mEos3.1 für alle Akzeptorintensitäten nach der Photokonvertierung. Wir sind dann in der Lage, die Gesamtzahl der Maulwürfe von fluoreszierenden Proteinen durch das ungefähre zytosolische Volumen (wie durch bildgebende Durchflusszytometrie bestimmt) zu dividieren, um die gesamte zytosolische Konzentration des Proteins von Interesse zu erhalten. Genaue Berechnungen finden Sie im Originalmanuskript8.
Durch die Exdinierung des mEos3.1-fused Proteins aus einem 2-Plasma-Plasmid in Hefe untersuchen wir in jeder Probe einen etwa tausendfachen Bereich der Proteinkonzentration8. Dasselbe erreichen wir in HEK293T-Zellen durch Variation der Plasmidaufnahme während der Transfektion und damit variable Kopierzahl.
Die daraus resultierende Verteilung von AmFRET, oder DAmFRET, für viele Tausende von Zellen zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Selbstmontage im Zytosol für jedes Protein von Interesse. Insgesamt stellt DAmFRET eine ermöglichliche Methode dar, um die Proteinselbstmontage mit einer beispiellosen Kombination aus Empfindlichkeit, Durchsatz und Reproduzierbarkeit zu entdecken und zu charakterisieren.
Während wir mit einem bildgebenden Zytometer In-vivo-Proteinkonzentrationsmessungen erhalten können, sind solche Zytometer an den meisten Forschungseinrichtungen noch nicht verfügbar. Dennoch kann DAmFRET auch in einem typischen nicht-bildgebenden Zytometer ausgeführt werden, um Verteilungen der Proteinanordnung über den Bereich der Proteinexpression zu erhalten.
DAmFRET ist die umfassendste Methode, um die Protein-Selbstmontage in vivo zu erkennen. DAmFRET kombiniert das direkte Auslesen homotypischer Protein-Protein-Wechselwirkungen über einen weiten Konzentrationsbereich mit Einzelzellauflösung und hohem Durchsatz. Das direkte Auslesen von DAmFRET und die Tatsache, dass die geschmolzenen Proteine keine spezifische subzelluläre Lokalisation oder einen unlöslichen Zustand erfordern, eliminieren Falschpositive und erweitern seine Anwendbarkeit auf eine breite Palette von Proteinen an ihren nativen subzellulären Standorten. Insbesondere durch die Kennzeichnung von Organellen mit Fluorophoren, die spektral kompatibel mit mEos3.1 sind, wie Z.B. T-Sapphire und mCardinal, kann neben DAmFRET die subzelluläre Lokalisation von löslichen und zusammengesetzten Proteinformen bestimmt werden.
Mit dem hier beschriebenen Bilddurchflusszytometer dauert es 8 h, um eine 96-Well-Platte mit ca. 20.000 gated cells pro Brunnen zu analysieren. Wir führen jedoch auch routinemäßig DAmFRET mit Standard-Zytometern (nicht-imaging) durch, die einen wesentlich höheren Durchsatz erreichen (bis zu 20 Proben pro Minute). Tatsächlich reicht jedes Durchflusszytometer mit räumlich getrennten 488- und 561 nm-Lasern, das frei von Log-Amp-Artefakten ist und über die entsprechenden PMTs und Filter zur Erkennung von Spender-, FRET- und Akzeptorsignalen verfügt, aus, um DAmFRET auszuführen. Derzeit geht dieser Durchsatzgewinn zu Lasten der Lokalisierungsinformationen und der Volumenbestimmung, so dass die Selbstmontage dann als Funktion der Proteinexpression und nicht als Konzentration analysiert werden muss. Für qualitative Analysen ist dies kein Problem. Darüber hinaus kann es möglich sein, das zytosolische Volumen abzuschätzen, indem ein spektral ausgeprägtes Fluorophor zu einem endogenen “Housekeeping”-Protein verschonen wird, dessen Expression eng mit dem zytosolischen Volumen korreliert.
Wie wir durch unseren Einsatz von DAmFRET sowohl in Hefe- als auch in Säugetierzellen gezeigt haben, kann DAmFRET leicht an verschiedene Expressionssysteme angepasst werden. Dies ermöglicht die Selbstmontage von Proteinen in ihren nativen zellulären Kontexten zu untersuchen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, die Protein-Montage über sehr unterschiedliche Zellkulturmodelle hinweg zu vergleichen, um die Erhaltung von Mechanismen zu untersuchen, die die Proteinselbstmontage steuern.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan und Ellen Ketter für ihre Arbeit zur Entwicklung des Assays. Diese Arbeit wurde getan, um teilweise die Anforderungen für die Doktorarbeit Forschung für T.S.K. und A.R.G als Studenten an der Open University, UK, und dem Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, jeweils registriert zu erfüllen. Weitere Informationen zum Assay finden Sie unter https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Originaldaten, die diesem Manuskript zugrunde liegen, können über das Stowers Original Data Repository unter http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372 abgerufen werden. Diese Arbeit wurde durch den Early Independence Award DP5-OD009152 des NIH Director, March of Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-32, und das Stowers Institute for Medical Research finanziert.
Die Autorenbeiträge lauten wie folgt. Konzeptualisierung: T.S.K., S.V. und R.H.; Methodik: T.S.K., S.V., A.R.G. und A.B; Untersuchung: S.V., T.S.K. und A.R.G.; Formale Analyse: S.V. und T.S.K. ; Datenkuration: T.S.K.; Visualisierung: T.S.K, und S.V., Schreiben (OriginalEntwurf): S.V., und T.S.K.; Schreiben (Review, Editing): R.H., S.V. und T.S.K.; und Finanzierungserwerb: R.H.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |