Summary
Dieser Artikel beschreibt ein FRET-basiertes Flow-Zytometrie-Protokoll zur Quantifizierung der Protein-Selbstmontage in s. cerevisiae- und HEK293T-Zellen.
Abstract
Die Protein-Selbstmontage bestimmt die Proteinfunktion und unterteilt zelluläre Prozesse in Raum und Zeit. Aktuelle Methoden, um es zu untersuchen, leiden unter geringer Empfindlichkeit, indirekten Auslesungen, begrenztem Durchsatz und/oder Bevölkerungsebene anstelle einer Einzelzellenauflösung. Wir haben eine auf Flow Cytometry basierende Einzelmethodik entwickelt, die alle diese Einschränkungen anspricht: Distributed Amphifluoric FRET oder DAmFRET. DAmFRET erkennt und quantifiziert Protein-Selbstbaugruppen durch sensibilisierte Emission FRET in vivo, ermöglicht den Einsatz über Modellsysteme hinweg – von Hefe bis zu menschlichen Zellen - und erreicht empfindliche, einzellige, hochdurchsatzige Auslesungen unabhängig von Proteinen Lokalisierung oder Löslichkeit.
Introduction
Assays zur Untersuchung homotypischer Proteinwechselwirkungen oder "Selbstmontage" sind wichtig, weil der oligomere Zustand und die Löslichkeit von Proteinen ihre Funktion diktieren. Das Proteom ist reich an Homo-Multimern1,2,3,4, während relativ wenige Proteine als Monomere fungieren. Proteine können sich auch aufgrund von Stress, Alter oder Fehlregulation enden, was zu pathologischen Veränderungen in der Aktivität führt. Die Identifizierung der Faktoren, die solche Ereignisse modulieren, oder sogar die physikalische Natur der Baugruppen, ist oft eine außerordentliche Herausforderung.
Eine wachsende Zahl von Proteinen wird heute erkannt, um sich mit außergewöhnlicher Kooptativität und unbestimmter Stoichiometrie selbst zu montieren, was zu ihrer Demischung von anderen zellulären Bestandteilen, als proteindichte Phasen führt. Diese haben die Form von ungeordneten Kondensaten, wie Tröpfchen und Gele, oder hoch geordneten Filamenten, wie Amyloidfasern. Die mit letzterem verbundenen Konformationsschwankungen machen ihre Anfangsbildung oder Keimbildung von Natur aus probabilistisch auf der molekularen Ebene5,6. Da die Wahrscheinlichkeit von Keimungsskalen mit Volumen, die Bildung solcher Baugruppen kann in den räumlichen Grenzen der lebenden Zellen7,8sein. Am äußersten Ende der stochastischen Nukleations-begrenzte Phasentrennung befinden sich Prionen, hochgeordnete Proteinassemblys, die nur selten spontan, aber einmal gebildet ihr eigenes Wachstum auf unbestimmte Zeit zünten. Ein solches Protein, bekannt als ASC, führt einen digitalen prionartigen Schalter in der Aktivität von angeborenen Immunzellen von Säugetieren aus. Die ASC-Selbstmontage wird durch ihre Wechselwirkung mit spezifischen Proteinen, die sich selbst oligomerisiert haben, durch bindung von pathogenen oder gefahrenassoziierten molekularen Mustern nukleiert. Die ASC-Baugruppen wiederum nukleate Procaspase-1 zur Selbstmontage und Aktivierung, was zu Zytokinreifung und Pyroptose der Zelle9,10führt. Die Region des ASC, die für ihre Versammlung verantwortlich ist, gehört zur Überfamilie der Todesdomäne, die aus über hundert Mitgliedern des menschlichen Proteoms besteht. Trotz der zentralen Rollen von Todesdomänen in der angeborenen Immunität und programmierten Zelltod, die meisten von ihnen sind noch nicht in Bezug auf Die Selbstmontage gekennzeichnet. Die Entdeckung und Charakterisierung zusätzlicher Proteine mit einem solchen Verhalten wird durch eine direkte, einzellige Auslesung der Proteinselbstmontage erheblich erleichtert.
Klassische Proteinbiochemie-Ansätze zur Untersuchung der Protein-Selbstmontage, wie Größenausschlusschromatographie und Ultrazentrifugation, beschränken sich weitgehend auf Populationsebenenbewertungen. Die Heterogenität von Zelle zu Zelle, die sich aus Nukleationsbegrenzten Phasenübergängen ergibt, kann jedoch nicht mit dieser Detailgenauigkeit modelliert werden. Einzellige Ansätze, die auf der Fluoreszenzmikroskopie basieren, gewinnen diese Fähigkeit wieder, aber es fehlt der erforderliche Durchsatz, um die Keimbildung genau zu quantifizieren oder seltene Baugruppen zu erkennen. Darüber hinaus sind lösliche Selbstbaugruppen wie die meisten Enzyme und Prä-Amyloid-Oligomere zu klein und mobil, um durch standardleichte Mikroskopie gelöst zu werden. Sie können durch ausgefeiltere Ansätze wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie nachgewiesen werden, aber diese sind in Der zellzahlierlicher und durchsatzsehr begrenzter Art.
Näherungsbasierte Assays der Proteinzusammensetzung, wie FRET und Split-Fluorophor-Komplementierung, bieten eine mögliche Lösung für diese Probleme. Sie erfordern jedoch in der Regel die Verwendung von zwei verschiedenen Konstrukten, die das Protein von Interesse ausdrücken, das zu ergänzenden Tags verschmolzen wird – spender- und akzeptierende Fluorophore im Falle von FRET. Dies beeinträchtigt den experimentellen Durchsatz und reduziert auch die Empfindlichkeit aufgrund von Zell-zu-Zell-Variationen in den relativen Konzentrationen von Spender und Akzeptor. Um dies zu umgehen, haben wir einen Test entworfen, der ein photokonvertierbares Fluorophor, mEos3.111, verwendet, das es einem einzigen Konstrukt ermöglicht, sowohl Spender- als auch Mit-Akzeptanz-Protein auszudrücken. Das Emissionsspektrum von unkonvertiertem mEos3.1 (GFP-ähnlicher Spender) überschneidet sich ausreichend mit dem Anregungsspektrum von photoconverted mEos3.1 (dsRed-like acceptor), um FRET auftreten zu lassen, wenn sich die Moleküle in unmittelbarer Nähe befinden (<10 nm). Durch die Exposition der Zellen einer empirisch ermittelten Dosis von 405 nm Licht, die einen optimalen Anteil der GesamtmEos3.1 in die Akzeptorform photoconvertiert, erreichen wir konsistente und reproduzierbare relative Spender- und Akzeptorspiegel über mehrere Proben hinweg, Expressionsebenen und Experimenten. Wir messen die Akzeptorfluoreszenz, wenn wir entweder direkt mit 561 nm Licht oder indirekt (durch Energieübertragung vom Spender) mit 488 nm Licht (d.h. sensibilisierte Emission FRET) angeregt werden. Wir berichten Protein-Montage als das Verhältnis dieser beiden Werte und sprechen es amphifluoric FRET oder AmFRET.
Um die Proteinkonzentration durch Durchflusszytometrie zu berechnen, berechnen wir zunächst die mittlere Fluoreszenzintensität von Spc42 mit mEos3.1. Da Hefezellen etwa 1000 Moleküle von Spc42 enthalten, berechnen wir dann die Fluoreszenzintensität eines einzelnen fluoreszierenden grünen mEos3.1 Moleküls. Durch die Nutzung der gleichmäßigen Photokonversion bei allen zellulären Konzentrationen (Abbildung 1E) korrelieren wir dann die Gesamtfluoreszenzwerte mEos3.1 für alle Akzeptorintensitäten nach der Photokonvertierung. Wir sind dann in der Lage, die Gesamtzahl der Maulwürfe von fluoreszierenden Proteinen durch das ungefähre zytosolische Volumen (wie durch bildgebende Durchflusszytometrie bestimmt) zu dividieren, um die gesamte zytosolische Konzentration des Proteins von Interesse zu erhalten. Genaue Berechnungen finden Sie im Originalmanuskript8.
Durch die Exdinierung des mEos3.1-fused Proteins aus einem 2-Plasma-Plasmid in Hefe untersuchen wir in jeder Probe einen etwa tausendfachen Bereich der Proteinkonzentration8. Dasselbe erreichen wir in HEK293T-Zellen durch Variation der Plasmidaufnahme während der Transfektion und damit variable Kopierzahl.
Die daraus resultierende Verteilung von AmFRET, oder DAmFRET, für viele Tausende von Zellen zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Selbstmontage im Zytosol für jedes Protein von Interesse. Insgesamt stellt DAmFRET eine ermöglichliche Methode dar, um die Proteinselbstmontage mit einer beispiellosen Kombination aus Empfindlichkeit, Durchsatz und Reproduzierbarkeit zu entdecken und zu charakterisieren.
Während wir mit einem bildgebenden Zytometer In-vivo-Proteinkonzentrationsmessungen erhalten können, sind solche Zytometer an den meisten Forschungseinrichtungen noch nicht verfügbar. Dennoch kann DAmFRET auch in einem typischen nicht-bildgebenden Zytometer ausgeführt werden, um Verteilungen der Proteinanordnung über den Bereich der Proteinexpression zu erhalten.
Protocol
1. Herstellung von Saccharomyces cerevisiae für DAmFRET-Assay
- Transformieren Sie experimentell relevante Hefestämme mit einem 2" Galactose-induzierbaren Plasmid, das das Protein von Interesse ausdrückt8, das entweder am C- oder N-Endpunkt mit mEos3.1 mit einem Standard-Lithiumacetat-Protokoll12 markiert ist.
- Wachsen Sie die Hefe in flüssiger Kultur.
- Für jedes Abfrageprotein impfen Hefekolonien (transformiert), in Dreifacher Richtung jeweils in 200 L geeigneter nicht induzierender Wachstumsmedien (d. h. Medien mit 2% Dextrose, Hefestickstoffbase und Aminosäuren zur Auswahl des Plasmids) in einer 96-Well-Platte ( Abbildung 1C).
- Inkubieren Sie Zellen, während sie auf einem Plattenschüttler schütteln (siehe Materialtabelle) mit 1,5 mm Umlaufbahn bei 1200 Umdrehungen bei 30 °C für 16 h.
- Induzieren Deexpression des Gens von Interesse (repräsentatives Protokoll für 16 h-einige Proteine kann mehr oder weniger Zeit in Anspruch nehmen).
- Nach 16 h Induktion die Platte bei 2200 x g für 2 min bei Raumtemperatur drehen (RT0, um die Proben zu pellet.
- Entfernen Sie Medien durch gewaltsame Inversion. Resuspend-Zellen mit 200 l geeigneter Induktionsmedien (d. h. Medien mit 2% Galaktose, Hefestickstoffbasis und Aminosäuren zur Auswahl des Plasmids). Siehe Abbildung 1C.
- Zellen bei 30 °C für 12 h schütteln.
- Zentrifuge (siehe Materialtabelle) die Platte bei 2200 x g für 2 min bei RT, um die Proben zu pellet. Entfernen Sie Medien durch gewaltsame Inversion. Resuspend Zellen mit 200 l des Induktionsmediums.
- Inkubieren Sie Zellen, während sie bei 1200 Rpm bei 30 °C für weitere 4 h schütteln. Diese Resuspension in frischen Medien sollte 4 h vor dem Betrieb von DAmFRET erfolgen, um die Autofluoreszenz zu reduzieren.
2. Säugetier-Plasmid-Erstellung
- Konstruieren Sie einen Säugetiervektor, der einen konstitutiven Promotor und mEos3.1 mit einem Platzhalter hat, um das Gen von Interesse und einen Linker dazwischen einzufügen.
ANMERKUNG: Wir haben einen golden-gate-kompatiblen Vektor M1 aus einem öffentlich verfügbaren Plasmid (siehe Materialtabelle) mit den folgenden Modifikationen konstruiert: Eine vorhandene BsaI-Site wurde durch eine Punktmutation G bis A (an Position 3719 gemäß der Sequenz). mEos3.1 wurde mit standortgesteuerter Mutagenese des Fluorophors bei I157V gewonnen. Invertierte BsaI-Standorte gefolgt von 4x(EAAAR)-Linkerwurden durch Gibson-Baugruppe in-Frame zwischen CMV-Promoter und mEos3.1 eingefügt, um den endgültigen M1-Vektor zu erzeugen. Proteinexpression wird durch CMV Enhancer und Promoter angetrieben; und Transkriptionsbeendigung durch SV40 Polyadenylierungssignal. - Erstellen Sie eine Bibliothek mit Inserts, die mit dem konstruierten Vektor kompatibel ist.
HINWEIS: Wir bestellen unsere Einsätze für die Golden Gate-Montage als synthetische lineare Fragmente (siehe Materialtabelle), flankiert von BsaI-Standorten zur Ligaierung in M1 zwischen CMV-Promoter und 4x(EAAAR)-mEos3.1.
3. Säugetierzellkultur und Transfektion
- Kultur HEK293T Zellen in DMEM + 10% FBS + 1x PenStrepMedien bei 37 °C bei 5% CO2 .
- Am Tag vor der Transfektion, Samen 5 x 105 Zellen in einer 6-Well-Platte mit 2 ml Medien.
- Transfektionszellen mit 2 g Plasmid-DNA mit einem Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 3:1 (Transfektionsreagenz:DNA). Mischen Sie die Komponenten in 150 l reduzierten Serummedien (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie bei RT für 15 min, fügen Sie die Mischung zu jedem Brunnen hinzu und brüten Sie für 48 h für die Proteinexpression.
- Bestätigen Sie die Proteinexpression nach 24 h durch Epifluoreszenzmikroskopie (488 nm Anregung, 515 nm Emission).
4. Vorbereitung von Säugetierzellen für DAmFRET-Assay
- Nach 48 h Proteinexpression Medien aus jedem Brunnen entfernen und Zellen mit 1 ml 37 °C Phosphat-gepufferter Saline (PBS) sorgfältig waschen. Nach dem Waschen die PBS ansaugen.
- 0,5 ml Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzufügen (0,25%) und für 5 min bei 37 °C inkubieren.
- Fügen Sie jedem Brunnen 0,5 ml komplettes DMEM-Medium hinzu, setzen Sie Zellen wieder auf und stellen Sie sicher, dass keine großen Klumpen sichtbar sind.
- Übertragen Sie das gesamte Volumen jedes Brunnens in 1,5 ml Rohre.
- Spinzellen für 5 min bei 1000 x g bei Raumtemperatur (RT).
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml PBS + 10 mM EDTA wieder auf.
- Drehen Sie die Zellen für 5 min bei 1000 x g bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) + 10 mM EDTA in PBS wieder auf.
- Fix Zellen für 5 min auf einem Schütteltisch mit konstanter Bewegung.
- Spinzellen für 5 min bei 1000 x g bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml PBS + 10 mM EDTA wieder auf.
- Spinzellen für 5 min bei 1000 x g bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in ausreichender Puffermenge für den Zytometrielauf wieder aus (für 1 Bohrgut einer 96-Well-Platte verwenden Sie 200 l PBS + 10 mM EDTA).
- Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf einen Brunnen einer runden unteren 96-Well-Platte.
5. Photokonversion von Hefe- und Säugetierzellen für den Assay
- Fotokonvertieren von Proben in einer Mikroplatte ohne Abdeckung mit einer UV-Lampe (siehe Materialtabelle), ausgestattet mit einem 320-500 nm (violett) Filter und einem Strahlkollimator, 45 cm über der Platte positioniert, für eine Dauer von 25 min beim Schütteln. Diese Bedingungen sind geeignet, wenn die Strahlleistung an der Platte 11,25 mW/cm2beträgt, mit ca. 17.000 mJ/cm2 der gesamten Photonendosis8.
6. DAmFRET Datenerfassung
- Assayzellen mit einem Zytometer mit nicht kollinearen 488/561 Lasern. Die folgenden Daten sind die Mindestanforderungen für die Berechnung von FRET.
- Verwenden Sie einen 488 nm Anregungs- / 515 nm Emissionskanal für die Erfassung der Spenderfluoreszenz.
- Verwenden Sie einen 488 nm Anregungs- / 595 nm Emissionskanal für die Erfassung der Fluoreszenz des FRET-Signals.
- Verwenden Sie einen 561 nm Anregungs- / 595 nm Emissionskanal (nicht kollinear mit dem 488/595-Kanal) für die Erfassung der Akzeptorfluoreszenz.
- Verwenden Sie einen 405 nm Anregungskanal/ 457 nm Emissionskanal für die Erfassung von Autofluoreszenz8.
- Verwenden Sie einen hellfeldbildkanal für die Volumenberechnung.
ANMERKUNG:Imaging Zytometer Einstellungen für S. cerevisiae sind wie folgt: 60x Objektiv bei niedriger Durchflussrate und hoher Empfindlichkeit; Laserleistungen auf 405 nm bei 15 mW, 488 nm bei 15 mW, 561 nm bei 20 mW.Imaging Zytometer Einstellungen für HEK293T Zellen sind wie folgt:40x Objektiv bei niedriger Durchflussrate und hoher Empfindlichkeit; Laserleistungen auf 405 nm bei 15 mW, 488 nm bei 15 mW, 561 nm bei 20 mW. Beachten Sie auch, dass unser bildgebendes Zytometer speziell für die räumlich getrennten 488 nm und 561 nm Laser (d.h. bei verschiedenen Kameras) entwickelt wurde, um eine klare Auflösung von FRET von Akzeptorfluoreszen zimperbar zu erhalten. Ce.
- Sammeln Sie Daten für 20.000-50.000 Einzelzellen pro Probe innerhalb eines fluoreszenzpositiven Gates.
- Tor einzelne Zellen durch ein hohes Seitenverhältnis und eine kleine Zellfläche im Gegensatz zu verklumpten Zellen oder Schutt, die ein niedriges Seitenverhältnis und große oder sehr kleine Zellbereiche haben würden.
HINWEIS: Die äquivalenten Parameter in einem nicht-imaging Zytometer sind FSC (Forward Scatter) für ungefähre Zellgröße und SSC (Side Scatter) für die Zellgranularität. Verwenden Sie außerdem FSC-Pulshöhe versus Pulsbreite als Proxy für Einzelzellen-Gating. Darüber hinaus ist es wichtig, keine Ereignisse zu sammeln, die Fluoreszenzwerte über die obere Empfindlichkeitsgrenze des Zytometers hinaus aufweisen. In unserem bildgebenden Zytometer beschränken wir die Erfassung von Ereignissen auf einen rohen maximalen Pixelwert von einem weniger als die Sättigungsgrenze für jeden fluoreszierenden Kanal, den wir sammeln. Ebenso sollten bei herkömmlichen Durchflusszytometern Datenpunkte im Abschnitt mit der höchsten Intensität (einschließlich Ereignissen, die über den dynamischen Erfassungsbereich hinausgehen) nicht analysiert werden.
- Tor einzelne Zellen durch ein hohes Seitenverhältnis und eine kleine Zellfläche im Gegensatz zu verklumpten Zellen oder Schutt, die ein niedriges Seitenverhältnis und große oder sehr kleine Zellbereiche haben würden.
7. Datenanalyse
- Führen Sie eine Kompensation mit einer nicht photokonvertierten mEos3.1-Probe für das reine Spendersignal und monomerisches DsRed2, das ein ähnliches Spektrum wie die rote Form von mEos3.1 hat, für das reine Akzeptorsignal13. Um mehr Empfindlichkeit zu erreichen, stellen Sie sicher, dass der FRET-Detektorkanal auch als Spillover-Ziel im Analyseprogramm betrachtet wird.
- Gate-Proben, um nur einzelne Zellen auszuwählen, die fluoreszenzpositiv sind (wie in Abbildung 2).
- Berechnen Sie den AmFRET-Parameter als Verhältnis des gesamten FRET-Signals (488ex/595em) dividiert durch das gesamte FRET-Akzeptor (561ex/595em) Signal.
- Visualisieren Sie Daten mithilfe einer Durchflusszytometriesoftware (siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Zytosolische Konzentrationen für S. cerevisiae in dieser Studie wurden mit den folgenden Einstellungen berechnet, wie in Khan et al.8. Die Datenanalyse wurde mit der Durchflusszytometrie-Software durchgeführt (siehe Materialtabelle).
Representative Results
Nachweis von Oligomeren, die keine Punktia bilden
Wir haben zuvor DAmFRET für die Charakterisierung der Proteinphasentrennung eingesetzt, was typischerweise zur Bildung großer Proteinassemblys führt, die auch durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden können. Um die Anwendbarkeit von DAmFRET auf beugungsbegrenzte Proteinassemblys zu demonstrieren, haben wir ein biochemisch gut charakterisiertes Protein analysiert, das diskrete Homo-Heptamer bildet, die viel zu klein sind, um durch Lichtmikroskopie visualisiert zu werden: die menschliche Mitchaperonin, HSPE114. Wir verglichen die DAmFRET-Profile von Hefezellen, die mEos3.1 allein oder HSPE1-mEos3.1 exdrücken. Letztere wiesen einheitliche positive AmFRET-Werte auf, während erstere vernachlässigbare AmFRET (Abbildung3A)aufwiesen. Die Bilder von Zellen, die durch das bildgebende Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle)aufgenommen wurden, zeigten diffuse Fluoreszenz in allen Kanälen-Spender, FRET und Akzeptor, sowohl für mEos3.1- als auch für HSPE1-mEos3.1-exezierende Zellen (Abbildung 3B). Um diesen Befund bei höherer optischer Auflösung zu bestätigen, haben wir die konfokale Mikroskopie verwendet, um Z-Stacks für mehrere Zellfelder zu erfassen. Tatsächlich war die Fluoreszenz gleichmäßig im Zytosol verteilt, ohne nachweisbare Punktias, ob die Zellen HSPE1-mEos3.1 oder das Fluorophor allein exprimierten (Abbildung3C). Beachten Sie, dass das gekennzeichnete Kd von HSPE1 etwa 3 m beträgt, was leicht unter der Empfindlichkeit unseres Systems liegt, und daher beobachten wir nicht die sigmoidale Beziehung von FRET zu einer Konzentration, die für dieses diskrete Homo-Oligomer zu erwarten wäre. Dennoch kommen wir zu dem Schluss, dass DAmFRET eine lösliche Homo-Oligomerisierung in vivo mit Einzelzellauflösung robust erkennt.
Nachweis von Keimbaugruppen
Um die Fähigkeit von DAmFRET zu demonstrieren, diskrete Homo-Oligomere von Nukleationsbegrenzten wie Prionen zu unterscheiden, analysierten wir das menschliche Inflammasomenprotein ASC. Während WT ASCPYD Filamente in vivobildet, ist die inaktive R41E-Mutation von ASCPYD nicht9,10. Wir drückten in Hefezellen entweder mEos3.1 allein oder mEos3.1 verschmolzen entweder zu WT oder R41E ASCPYD. Hefezellen, die das Fluorophor allein oder die mutierte Form der ASCPYD exezieren, zeigten vernachlässigbares AmFRET über den gesamten Konzentrationsbereich, was auf eine Unfähigkeit zur Selbstinteraktion hindeutet. Im Gegensatz dazu zeigte WT ASCPYD ein DAmFRET-Profil mit zwei Populationen: eine mit vernachlässigbarem AmFRET und die andere mit hohem AmFRET (Abbildung 4A). Wie durch die Fluoreszenzbilder bestätigt (Abbildung 4B), stellen diese Populationen Zellen dar, die nur lösliches Protein enthalten bzw. meist selbst zusammengesetztes Protein enthalten. Die diskontinuierliche Beziehung zwischen den Populationen und die Tatsache, dass sie bei überlappenden Konzentrationen auftreten, deutet darauf hin, dass eine Keimbarriere die monomere Form des Proteins stabilisiert und es davon abhalten kann, sich während der Dauer des Experiments zusammenzusetzen. 8. Die Lücke in AmFRET zwischen den beiden Populationen zeigt, dass, sobald die Keimbildung auftritt, sie fast sofort andere Monomere auf die montierte Form einfügt und ein neues stationäres Niveau von AmFRET erreicht. DAmFRET bestätigte frühere Strukturdaten, dass der Punktmutant ASCPYD R41E die Keimbildung über die durch dieses Expressionssystem erreichbaren Konzentrationen gestört hat (Abbildung 4A).
Anwendbarkeit von DAmFRET in Säugetierzellen
Obwohl Hefezellen ideale Wirtszellen für DAmFRET sind, wollten wir die Anwendbarkeit von DAmFRET auf Säugetierzellen ausdehnen. Um den Zelltod durch funktionelle ASC-Polymere zu vermeiden, haben wir DAmFRET in HEK293T-Zellen getestet, denen die Caspase-1-Expression fehlt. Wir drückten die gleichen Proteine in HEK293T-Zellen aus wie in Hefezellen in Abbildung 4A. Die resultierenden DAmFRET-Profile in HEK293T-Zellen ähneln qualitativ denen in Hefezellen (Abbildungen 4A,C). DAmFRET dient somit als vielseitigste In-vivo-Methode zur Erkennung und Quantifizierung von nukleatierten Protein-Selbstbaugruppen bei Einzelzellauflösung mit hohem Durchsatz, unabhängig vom Vorhandensein mikroskopisch sichtbarer Punktzeichen als auch vom Zelltyp.
Abbildung 1 : Überblick über das experimentelle Design für S. cerevisiae. Diese Figur wurde von Khan et al.8 mit Genehmigung adaptiert. (A) 2- Plasmakarte mit dem offenen Leserahmen für das Protein von Interesse, mit photoconvertible mEos3.1 markiert und von einem induzierbaren Promotor angetrieben. (B) Bei Umwandlung in Hefezellen führt das 2-Zoll-Replikationssystem zu einer Variabilität der Kopierzahlen zwischen den Zellen. Diese Variation, kombiniert mit dem Transkriptionsrauschen des GAL1-Promotors, führt zu einer breiten Verteilung der Proteinexpression in einer Zellpopulation. (C) Experimentelle Übersicht für Hefe DAmFRET Assay. Um gesunde Zellen für den Test zu gewährleisten, werden Kolonien zuerst für die Proliferation über 16 h in synthetischen Medien geimpft, die die nicht induzierende Kohlenstoffquelle Dextrose enthalten. Nach der Proliferation werden die Zellen für 16 h auf synthetische Medien übertragen, die die induzierende Kohlenstoffquelle Galaktose enthalten. Nach der Induktion werden die Zellen teilweise und gleichmäßig durch Belichtung von 405 nm Licht photokonvertiert. (D) Die Proben werden dann mit der bildgebenden Durchflusszytometrie analysiert. Die Spektren und Intensitäten von grün und rot mEos3.1 machen sie für einen FRET-Spender bzw. -Akzeptor gut geeignet. Wenn die roten Moleküle in unmittelbarer Nähe zueinander sind, wie es in dem in der unteren Zelle dargestellten Polymer vorkommt, fluoreszieren die roten Moleküle bei Anregung grüner Moleküle (FRET). (E) Diagramm der Spender-/Akzeptorintensitäten, die eine enge lineare Beziehung bei der Photokonversion zeigen, was zeigt, dass die Effizienz der Photokonvertierung nicht durch die Ausdrucksebene beeinflusst wird. (F) Streudiagramm des mittelwertigen Akzeptors im Vergleich zu Spenderintensitäten aus Populationen von Zellen, die eine Vielzahl von mEos-markierten Proteinen in löslicher und amyloider Form exzessiieren, was zeigt, dass die Effizienz der Photokonversion nicht durch die Fusion beeinflusst wird Partner oder Löslichkeit (Fehlerbalken zeigen Standardabweichung biologischer Triplizen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : DAmFRET-Gating-Strategie für bildgebende Durchflusszytometriedaten. Gating-Strategie verwendet, um nur konzentrierte, unbewässerte einzelzellen zu analysieren, die eine geringe Autofluoreszenz haben und das fluoreszierende Protein ausdrücken. (A) Hierarchie der Tore, um gut fokussierte, lebende, einzelne Zellen für die Analyse zu erhalten. (B) Histogramm des Gradienten RMS des Hellfeldkanals. Diese Messung ermöglicht die Auswahl von Zellen, die unter durchdseliegendem Licht richtig fokussiert sind. (C) Dichteplot der Zirkularität im Vergleich zu einer Fläche, die eine gated population von nicht bestückten kugelförmigen Einzelzellen zeigt. (D) Dichtediagramm mit Autofluoreszenz (Ch07) im Vergleich zur Spenderfluoreszenzintensität (Ch02), die separate Populationen von exzessierenden Zellen (gated) und dunklen Zellen zeigt. (E) Streudiagramm von Spender- versus Akzeptorintensitäten, die einen deutlichen Verlust der Spenderfluoreszenz in einer Teilmenge von Zellen zeigen, die sich aus FRET zwischen Spender und Akzeptorfluorophoren ergeben. (F) Endgültiges DAmFRET-Diagramm. Zellen, die unmontiertes Protein enthalten, werden um Null AmFRET zentriert, während Zellen, die selbst zusammengesetztes Protein enthalten, einen positiven AmFRET-Wert aufweisen. Zwei sich überlappende Populationen in der Parzelle deuten auf eine endliche Barriere hin, um dieses Protein in höherwertige Baugruppen wie Amyloide einzuschließen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Repräsentative Daten monomerer und heptamerer Proteine durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie. (A) DAmFRET-Profil des monomeren mEos3.1 Proteins (links) und heptamer HSPE1 mit mEos3.1 (rechts) markiert mit erhöhtem verhältnismetrischen FRET, das aus homotypischer Montage resultiert. (B) Bilder vom Zytometer, von Zellen, die mEos3.1 (links) und HSPE1 (rechts) in allen erfassten Kanälen zeigen. (C) Repräsentative Bilder von Hefezellen, die monomere mEos3.1 (links) und HSPE1 (rechts) exdrücken. Die Bilder sind Summenprojektionen von konfokalen Scheiben. Mindestens fünfzig Zellen wurden abgebildet, um diese Beobachtung zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : DAmFRET-Profile zeigen ein ähnliches Selbstmontageverhalten menschlicher ASCPYD Protein in S. cerevisiae und HEK293T Zellen. (A) Dichtediagramme, die AmFRET-versus zytosolische Konzentration (in M) von mEos3.1 (links) oder mEos3.1 zeigen, verschmolzen mit WT (Mitte) oder monomerisierender Mutant von ASCPYD (rechts) in S. cerevisiae. (B) Bilder vom Zytometer, von Zellen aus dem unteren und oberen Tor (linke bzw. mittlere Paneele), die WT ASCPYDexemitzen; und von Zellen, die ASCPYD R41E des angegebenen Gates (rechtes Panel) exdrücken. (C) Dichtediagramme, die AmFRET-versus-Akzeptorintensität für die gleiche Reihe von Proteinen wie in (A) zeigen, aber in HEK293T-Zellen exprimiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
DAmFRET ist die umfassendste Methode, um die Protein-Selbstmontage in vivo zu erkennen. DAmFRET kombiniert das direkte Auslesen homotypischer Protein-Protein-Wechselwirkungen über einen weiten Konzentrationsbereich mit Einzelzellauflösung und hohem Durchsatz. Das direkte Auslesen von DAmFRET und die Tatsache, dass die geschmolzenen Proteine keine spezifische subzelluläre Lokalisation oder einen unlöslichen Zustand erfordern, eliminieren Falschpositive und erweitern seine Anwendbarkeit auf eine breite Palette von Proteinen an ihren nativen subzellulären Standorten. Insbesondere durch die Kennzeichnung von Organellen mit Fluorophoren, die spektral kompatibel mit mEos3.1 sind, wie Z.B. T-Sapphire und mCardinal, kann neben DAmFRET die subzelluläre Lokalisation von löslichen und zusammengesetzten Proteinformen bestimmt werden.
Mit dem hier beschriebenen Bilddurchflusszytometer dauert es 8 h, um eine 96-Well-Platte mit ca. 20.000 gated cells pro Brunnen zu analysieren. Wir führen jedoch auch routinemäßig DAmFRET mit Standard-Zytometern (nicht-imaging) durch, die einen wesentlich höheren Durchsatz erreichen (bis zu 20 Proben pro Minute). Tatsächlich reicht jedes Durchflusszytometer mit räumlich getrennten 488- und 561 nm-Lasern, das frei von Log-Amp-Artefakten ist und über die entsprechenden PMTs und Filter zur Erkennung von Spender-, FRET- und Akzeptorsignalen verfügt, aus, um DAmFRET auszuführen. Derzeit geht dieser Durchsatzgewinn zu Lasten der Lokalisierungsinformationen und der Volumenbestimmung, so dass die Selbstmontage dann als Funktion der Proteinexpression und nicht als Konzentration analysiert werden muss. Für qualitative Analysen ist dies kein Problem. Darüber hinaus kann es möglich sein, das zytosolische Volumen abzuschätzen, indem ein spektral ausgeprägtes Fluorophor zu einem endogenen "Housekeeping"-Protein verschonen wird, dessen Expression eng mit dem zytosolischen Volumen korreliert.
Wie wir durch unseren Einsatz von DAmFRET sowohl in Hefe- als auch in Säugetierzellen gezeigt haben, kann DAmFRET leicht an verschiedene Expressionssysteme angepasst werden. Dies ermöglicht die Selbstmontage von Proteinen in ihren nativen zellulären Kontexten zu untersuchen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, die Protein-Montage über sehr unterschiedliche Zellkulturmodelle hinweg zu vergleichen, um die Erhaltung von Mechanismen zu untersuchen, die die Proteinselbstmontage steuern.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan und Ellen Ketter für ihre Arbeit zur Entwicklung des Assays. Diese Arbeit wurde getan, um teilweise die Anforderungen für die Doktorarbeit Forschung für T.S.K. und A.R.G als Studenten an der Open University, UK, und dem Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, jeweils registriert zu erfüllen. Weitere Informationen zum Assay finden Sie unter https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Originaldaten, die diesem Manuskript zugrunde liegen, können über das Stowers Original Data Repository unter http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372 abgerufen werden. Diese Arbeit wurde durch den Early Independence Award DP5-OD009152 des NIH Director, March of Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-32, und das Stowers Institute for Medical Research finanziert.
Die Autorenbeiträge lauten wie folgt. Konzeptualisierung: T.S.K., S.V. und R.H.; Methodik: T.S.K., S.V., A.R.G. und A.B; Untersuchung: S.V., T.S.K. und A.R.G.; Formale Analyse: S.V. und T.S.K. ; Datenkuration: T.S.K.; Visualisierung: T.S.K, und S.V., Schreiben (OriginalEntwurf): S.V., und T.S.K.; Schreiben (Review, Editing): R.H., S.V. und T.S.K.; und Finanzierungserwerb: R.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
| ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
| ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
| CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
| Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
| DMEM | Gibco | 11966025 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
| Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
| Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
| FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
| Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
| HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
| Mammalian Cells | HEK293T | ||
| mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
| mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
| optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
| PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
| Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
| Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |
References
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