Denne artikel beskriver en fret-baseret flow flowcytometri-protokol til kvantificering af protein-selvsamling i både S. cerevisiae -og HEK293T-cellerne.
Protein selv montage regulerer protein funktion og segmenter cellulære processer i rum og tid. Nuværende metoder til at studere det lider af lav følsomhed, indirekte udlæsninger, begrænset gennemløb, og/eller befolkning-niveau snarere end enkelt celle opløsning. Vi har udviklet en flow cytometry-baseret enkelt metode, der adresserer alle disse begrænsninger: distribueret Amningspind eller DAmFRET. DAmFRET registrerer og kvantificerer protein selv samlinger ved sensibiliseret emission FRET in vivo, muliggør udrulning på tværs af modelsystemer-fra gær til humane celler-og opnår følsomme, enkelt celle-, højt gennemløb-læse-outs uanset protein lokalisering eller opløselighed.
Assays at studere Homotypiske protein interaktioner, eller “selv-samling” er vigtige, fordi oligomer tilstand og Opløselighed af proteiner dikterer deres funktion. Proteomet bugner af Homo-multimere1,2,3,4, hvorimod relativt få proteiner fungerer som monomerer. Proteiner kan også samle Aberrant på grund af stress, alder eller fejl regulering, hvilket fører til patologiske ændringer i aktivitet. Det er ofte usædvanligt udfordrende at identificere de faktorer, der modunere sådanne begivenheder, eller endog den fysiske karakter af forsamlinger.
Et stigende antal proteiner er nu anerkendt for at selv samle med ekstraordinær cooperativitet og ubestemt støkiometri, hvilket resulterer i deres at fra andre cellulære bestanddele, som protein tætte faser. Disse tager form af uordnede kondensater, såsom dråber og geler, eller højt ordnede filamenter, såsom amyloid fibre. De konformationsmæssige udsving forbundet med sidstnævnte gør dets oprindelige dannelse, eller nukleation, i sagens natur probabilistisk på molekyl niveau5,6. Fordi sandsynligheden for nukleation skalaer med volumen, dannelsen af sådanne forsamlinger kan være meget stokastiske i den rumlige grænser af levende celler7,8. På det ekstreme af stokastiske nukleation-begrænset faseadskillelse er prioner, højt ordnede protein samlinger, der kun sjældent kerner, men når dannet, skabelon deres egen vækst på ubestemt tid. Et sådant protein, kendt som ASC, udfører en digital prion-lignende switch i aktiviteten af pattedyr medfødte immunceller. ASC Self-montering er kerneholdige af sin interaktion med specifikke proteiner, der selv har oligomeriseret ved binding patogen-eller fare-associerede molekylære mønstre. De ASC samlinger i sving kerne procaspase-1 til selv-samle og aktivere, fører til cytokin modning og pyroptose af cellen9,10. Den region ASC ansvarlig for sin forsamling tilhører døds domænet super familie, som består af over 100 medlemmer i den menneskelige proteome. På trods af de centrale roller døds domæner i medfødte immunitet og programmeret celledød, de fleste af dem er endnu ikke blevet karakteriseret med hensyn til selv-samling. Opdagelsen og karakterisering af yderligere proteiner med en sådan adfærd vil blive lettet betydeligt ved en direkte, enkelt celle aflæsning af protein selvsamling.
Klassisk protein biokemi tilgange til at studere protein selvsamling, såsom størrelses udelukkelse kromatografi og ultracentrifugering, er i vid udstrækning begrænset til populationsniveau vurderinger. Celle-til-celle-heterogenitet, der skyldes nukleation-begrænsede fase overgange, kan dog ikke modeles med dette detaljeringsniveau. Enkelt celle tilgange baseret på Fluorescens mikroskopi genvinde denne evne, men mangler det gennemløb, som er nødvendigt for nøjagtigt at kvantificere kimdannelse eller for at detektere sjældne samlinger. Desuden er opløselige selv-forsamlinger, såsom de fleste enzymer og præ-amyloid oligomerer, for små og mobile til at blive løst ved standard Light mikroskopi. De kan påvises ved mere sofistikerede tilgange såsom fluorescens korrelations spektroskopi, men disse er meget begrænset i celle nummer og gennemløb.
Nærheds baserede assays af protein samling, såsom fret og split fluoroforet komplementering, tilbyder en potentiel løsning på disse problemer. Men de generelt kræver brug af to forskellige konstruktioner, der udtrykker det protein af interesse smeltet til komplementære Tags-donor og acceptor fluorophores i tilfælde af FRET. Dette kompromitterer eksperimentel gennemstrømning og reducerer også følsomheden på grund af celle-til-celle variation i de relative niveauer af donor og acceptor. For at omgå dette, designede vi en analyse, der beskæftiger en foto konvertibel fluorophore, mEos 3.111, som giver mulighed for en enkelt konstruktion til at udtrykke både donor-og acceptor-mærkede protein. Emissionsspektret af ikke-konverterede mEos 3.1 (GFP-lignende donor) overlapper tilstrækkeligt med excitation spektrum af foto konverterede mEos 3.1 (dsRed-lignende acceptor) at tillade ÆRGRE at forekomme, når molekylerne er i umiddelbar nærhed (< 10 nm). Således, ved at udsætte cellerne for en empirisk bestemt dosis på 405 nm lys, som foto konverterer en optimal fraktion af total mEos 3.1 i acceptor form, vi opnår konsistente og reproducerbare relative niveauer af donor og acceptor på tværs af flere prøver, udtryks niveauer og eksperimenter. Vi måler den acceptor fluorescens, når ophidset enten direkte med 561 nm lys, eller indirekte (ved energioverførsel fra donor) med 488 nm lys (dvs. sensibiliseret emission FRET). Vi rapporterer protein samling som forholdet mellem disse to værdier og term det amphifluoric FRET eller AmFRET.
For at beregne proteinkoncentrationen ved flowcytometri beregner vi først den gennemsnitlige fluorescens intensitet af Spc42 Tagged med mEos 3.1. Da gærceller indeholder ca. 1000 molekyler Spc42, beregner vi fluorescens intensiteten af et enkelt fluorescerende grønt mEos 3.1-molekyle. Ved at udnytte den selv fotokonvertering ved alle cellulære koncentrationer (figur 1E), korrelerer vi de totale meos 3.1 fluorescens værdier for alle acceptor intensiteter efter foto konvertering. Vi er derefter i stand til at opdele det samlede antal mol af fluorescerende proteiner af den omtrentlige cytosolisk volumen (som bestemmes ved hjælp af Imaging flow cytometry) for at opnå den samlede cytosolisk koncentration af proteinet af interesse. For eksakte beregninger henvises til det originale manuskript8.
Ved at udtrykke mEos 3.1-smeltet protein fra en 2Μ plasmid i gær, sonde vi en ca tusind-fold vifte af proteinkoncentration i hver prøve8. Vi opnår det samme i HEK293T celler i kraft af variation i plasmid optagelse under transfection, og dermed variabel kopi nummer.
Den resulterende fordeling af AmFRET, eller DAmFRET, for mange tusinde celler afslører koncentrationen-afhængighed af selvsamling i cytosol for ethvert protein af interesse. Samlet set repræsenterer DAmFRET en mulig metode til at opdage og karakterisere protein selvsamling med en hidtil uset kombination af følsomhed, gennemløb og reproducerbarhed.
Mens du bruger et billedbehandlings-flowcytometer gør det muligt for os at opnå in vivo-protein koncentrationsmålinger, er sådanne cytometre endnu ikke tilgængelige på de fleste forskningsinstitutioner. Ikke desto mindre kan DAmFRET køres selv i en typisk non-Imaging flowcytometer for at få fordelinger af protein samling over rækken af protein udtryk.
DAmFRET er den mest omfattende metode til påvisning af protein-selv montage in vivo. DAmFRET kombinerer direkte Oplæsning af Homotypiske protein-protein interaktioner over en bred vifte af koncentration, med enkelt celle opløsning og høj gennemløb. Direkte læsning af DAmFRET og det faktum, at de smeltet proteiner ikke kræver en specifik subcellulær lokalisering eller uopløselig tilstand eliminerer falske positiver og udvider dets anvendelighed til en bred vifte af proteiner på deres indfødte subcellulære steder. Især ved at tagge organeller med fluorophorer, der er spektralt kompatible med mEos 3.1, såsom T-Sapphire og mCardinal, kan den subcellulære lokalisering af opløselige og samlede former for proteiner bestemmes sammen med DAmFRET.
Ved hjælp af Imaging flow flowcytometer som beskrevet her, det tager 8 h at analysere en 96-brønd plade med ca 20.000 gated celler per brønd. Vi udfører dog også rutinemæssigt DAmFRET med standard (non-Imaging) cytometre, der opnår meget højere gennemløb (op til 20 prøver pr. minut). Faktisk, enhver flow flowcytometer med rumligt adskilt 488 og 561 nm lasere, der er fri for Log amp artefakter og har de relevante PMTs og filtre til påvisning donor, FRET, og acceptor signaler er tilstrækkelig til at udføre DAmFRET. På nuværende tidspunkt kommer denne gevinst i gennemløb på bekostning af lokaliseringsoplysninger og volumenbestemmelse, således at selvsamling skal analyseres som en funktion af protein ekspression snarere end koncentration. Dette er ikke et problem for kvalitative analyser. Derudover kan det være muligt at estimere cytosolisk volumen ved at fusing en spektralt distinkt fluoroforet til en endogene “husholdning” protein, hvis udtryk stramt korrelerer med cytosolisk volumen.
Som vi har demonstreret gennem vores indsættelse af DAmFRET i både gær og pattedyrceller, kan DAmFRET let tilpasses til forskellige udtryks systemer. Dette gør det muligt for den selv-samling af proteiner, der skal undersøgt i deres indfødte cellulære sammenhænge. Desuden giver det mulighed for at sammenligne protein samling på tværs af vidt forskellige celle-kultur modeller for at studere bevarelsen af mekanismer, der styrer protein selvsamling.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Jeff lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan og Ellen ketter for deres arbejde hen imod udvikling af analysen. Dette arbejde blev gjort for at opfylde, til dels, krav til PhD afhandling Research for T.S.K. og A. R. G som studerende er registreret hos Open University, UK, og Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, hhv. Yderligere analyse relaterede oplysninger kan findes på https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Oprindelige data underliggende dette manuskript kan tilgås fra Stowers oprindelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Dette arbejde blev finansieret af NIH instruktørens tidlige uafhængigheds pris DP5-OD009152, marts af Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-32, og Stowers Institute for Medical Research.
Forfatter bidrag er som følger. Konceptualisering: T.S.K., S.V. og RH; Metode: T.S.K., S.V., A.R.G. og A. B; Undersøgelse: S.V., T.S.K. og A.R.G.; Formel analyse: S.V. og T.S.K.; Data-curation: T.S.K.; Visualisering: T. S. K og S.V., skrivning (oprindeligt udkast): S.V., og T.S.K.; Skrivning (gennemgang, redigering): S.V. og T.S.K.; og finansiering erhvervelse: RH
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |