Denne artikkelen beskriver en bånd-basert flyt flowcytometri protokoll til å kvantifisere protein selv montering i både S. cerevisiae og HEK293T celler.
Protein selv montering regulerer protein funksjon og compartmentalizes cellulære prosesser i rom og tid. Nåværende metoder for å studere den lider av lav-følsomhet, indirekte lese-outs, begrenset gjennomstrømning, og/eller befolkning-nivå i stedet for én celle oppløsning. Vi har utformet en flyt flowcytometri enkelt metodikk som tar for oss alle disse begrensningene: distribuert Amphifluoric bånd eller DAmFRET. DAmFRET oppdager og kvantifiserer protein selv-forsamlinger av sensibilisert utslipp bånd in vivo, muliggjør distribusjon på tvers av modellsystemer-fra gjær til menneskelige celler-og oppnår sensitiv, enkelt celle, høy gjennomstrømming lese-outs uavhengig av protein lokalisering eller løselighet.
Analyser for å studere homotypic protein interaksjoner, eller “selv montering” er viktig fordi oligomer tilstand og løselighet av proteiner dikterer deres funksjon. Proteom overflod med homo-multimers1,2,3,4, mens relativt få proteiner fungerer som monomerer. Proteiner kan også montere aberrantly på grunn av stress, alder eller misregulation, noe som fører til patologiske forandringer i aktivitet. Identifisering av faktorene som modulere slike hendelser, eller til og med den fysiske karakteren til samlingene, er ofte svært utfordrende.
Et økende antall proteiner er nå anerkjent for å montere selv med ekstraordinære cooperativity og ubestemmelig støkiometri, noe som resulterer i deres demixing fra andre cellulære bestanddeler, som protein tette faser. Disse tar form av relaterte kondensat, som dråper og gels, eller svært bestilte filamenter, slik som amyloid fibre. De conformational svingninger knyttet til sistnevnte gjengi sin opprinnelige formasjon, eller kjernedannelse, iboende sannsynlighetsbasert på molekylær nivå5,6. Fordi sannsynligheten for kjernedannelse skalaer med volum, kan dannelsen av slike forsamlinger være svært Stokastisk i den romlige rammen av levende celler7,8. På det ekstreme av Stokastisk kjernedannelse-begrenset fase separasjon er prioner, høyt bestilte protein forsamlinger som bare sjelden nucleate spontant, men når dannet, mal sin egen vekst på ubestemt tid. En slik protein, kjent som ASC, utfører en digital Prion-lignende bryter i aktiviteten av pattedyr medfødte immunceller. ASC selv-montering er kjerne av sin interaksjon med bestemte proteiner som har selv oligomerized upon bindende patogen-eller fare-assosiert molekylær mønstre. Den ASC forsamlinger i sin tur nucleate procaspase-1 til selv montere og aktivere, fører til cytokin modning og pyroptosis av cellen9,10. Regionen av ASC ansvarlig for sin forsamling tilhører død domenet overfamilie, som består av over 100 medlemmer i den menneskelige proteom. Til tross for sentrale roller døden domener i medfødt immunitet og programmert celle død, de fleste av dem har ennå ikke vært preget med hensyn til selv-montering. Oppdagelsen og karakterisering av ytterligere proteiner med slik atferd vil bli sterkt tilrettelagt av en direkte, enkelt celle avlesning av protein selv-montering.
Klassisk protein biokjemi tilnærminger for å studere protein selv montering, slik som størrelses ekskludering kromatografi og ultracentrifugation, er i stor grad begrenset til befolkningsnivå vurderinger. Celle-til-celle-heterogenitet som er et resultat av en kjerne-begrenset faseovergang kan imidlertid ikke være modellert med dette detaljnivået. Enkelt celle tilnærminger basert på fluorescens mikroskopi gjenvinne denne evnen, men mangler gjennomstrømningen nødvendig for å nøyaktig kvantifisere kjernedannelse eller for å oppdage sjeldne forsamlinger. Videre, løselig selv-forsamlinger som de fleste enzymer og pre-amyloid oligomers, er for små og mobile å bli løst ved standard lys mikroskopi. De kan oppdages av mer sofistikerte tilnærminger som fluorescens korrelasjon spektroskopi, men disse er svært begrenset i celle nummer og gjennomstrømning.
Nærhets BAS ert analyser av protein montering, for eksempel bånd og splitt fluoroforen komplementering, tilbyr en potensiell løsning på disse problemene. Men de vanligvis krever bruk av to forskjellige konstruksjoner uttrykker protein av interesse smeltet til komplementære Tags-donor og Acceptor fluorophores i tilfelle av bånd. Dette kompromisser eksperimentell gjennomstrømning og reduserer også følsomheten på grunn av celle-til-celle-variasjon i de relative nivåene av donor-og Acceptor. For å omgå dette, utviklet vi en analyse som sysselsetter en photoconvertible fluoroforen, mEos 3.111, som tillater en enkelt konstruere å uttrykke både donor-og Acceptor-merket protein. Utslipps spekteret av uomvendte mEos 3.1 (GFP-lignende giver) er tilstrekkelig overlapper med det eksitasjon spekteret av photoconverted mEos 3.1 (dsRed-lignende Acceptor) for å tillate bånd til å forekomme når molekylene er i umiddelbar nærhet (< 10 NM). Således, ved å utsette celler til en empirisk bestemt dose av 405 NM lys, som photoconverts en optimal brøkdel av total mEos 3.1 i Acceptor form, oppnår vi konsistent og reproduserbar relative nivåer av donor og Acceptor på tvers av flere prøver, uttrykks nivåer og eksperimenter. Vi måler Acceptor fluorescens når opphisset enten direkte med 561 NM lys, eller indirekte (ved energi overføring fra donor) med 488 NM lys (dvs. sensibilisert utslipp bånd). Vi rapporterer protein forsamlingen som forholdet mellom disse to verdiene og begrepet det amphifluoric bånd eller AmFRET.
For å beregne proteinkonsentrasjon ved flyt flowcytometri vi først beregne gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av Spc42 merket med mEos 3.1. Fordi gjærceller inneholder ca 1000 molekyler av Spc42, vi deretter beregne fluorescens intensiteten av en enkelt fluorescerende grønt mEos 3.1 molekyl. Ved å utnytte den jevne photoconversion ved alle cellulære konsentrasjoner (fig. 1e), vi deretter relatere total meos 3.1 fluorescens verdier for alle Acceptor intensitet etter photoconversion. Vi er da i stand til å dele det totale antall føflekker av fluorescerende proteiner ved omtrentlig cytosolic volum (som bestemmes ved hjelp av Imaging Flow flowcytometri) for å få den totale cytosolic konsentrasjon av protein av interesse. For nøyaktige beregninger, vennligst se det opprinnelige manuskriptet8.
Ved å uttrykke mEos 3.1-smeltet protein fra en 2μ plasmider i gjær, sonde vi en ca tusen-fold utvalg av proteinkonsentrasjon i hver prøve8. Vi oppnår det samme i HEK293T celler i kraft av variasjon i plasmider opptak under transfeksjoner, og dermed variabel kopi nummer.
Den resulterende fordelingen av AmFRET, eller DAmFRET, for mange tusen celler avslører konsentrasjonen-avhengighet av selv-montering i stoffer for noen protein av interesse. Samlet representerer DAmFRET en slik metodikk for å oppdage og karakterisere protein selv montering med en enestående kombinasjon av følsomhet, gjennomstrømning og reproduserbarhet.
Mens du bruker et bilde flowcytometer, kan vi oppnå in vivo protein konsentrasjons målinger, slik cytometers er ennå ikke tilgjengelig på de fleste forskningsinstitusjoner. Likevel kan DAmFRET kjøres selv i en typisk ikke-tenkelig flowcytometer å få distribusjoner av protein forsamlingen over omfanget av protein uttrykk.
DAmFRET er den mest omfattende metoden for å oppdage protein selv montering in vivo. DAmFRET kombinerer direkte lesing av homotypic protein-protein interaksjoner over et bredt spekter av konsentrasjon, med én celle oppløsning og høy gjennomstrømming. Den direkte lese-ut av DAmFRET og det faktum at smeltet proteiner ikke krever en bestemt subcellulære lokalisering eller uløselig tilstand eliminerer falske positiver og utvider anvendelsen til et bredt spekter av proteiner på sitt eget subcellulære steder. Spesielt ved å merke organeller med fluorophores som er Spectrally kompatible med mEos 3.1, slik som T-Sapphire og mCardinal, kan subcellulære lokalisering av løselige og sammensatte former av proteiner bestemmes ved siden av DAmFRET.
Bruke Imaging Flow flowcytometer som beskrevet her, tar det 8 h å analysere en 96-brønn plate med ca 20 000 gated celler per brønn. Imidlertid, vi likeledes rutinemessig utføre DAmFRET med målestokk (ingen-tenkelig) cytometers det oppnå mange høyere produksjon (til 20 eksemplar per minutt). Faktisk, alle flyte flowcytometer med romlig adskilt 488 og 561 NM laser det er befri fra stokk forsterker artefakter og har det passende eksportert pmts og filterene for oppdager donor, bånd, og Acceptor signaler er nok å utføre DAmFRET. I dag kommer denne gevinsten i gjennomstrømning på bekostning av lokalisering informasjon og volum bestemmelse, slik at selv-montering må da analyseres som en funksjon av protein uttrykk snarere enn konsentrasjon. Dette er ikke et problem for kvalitative analyser. I tillegg kan det være mulig å anslå cytosolic volum ved å smelte en Spectrally distinkt fluoroforen til en endogene “housekeeping” protein hvis uttrykk tett samsvarer med cytosolic volum.
Som vi har demonstrert gjennom vår distribusjon av DAmFRET i både gjær og pattedyrceller, kan DAmFRET enkelt tilpasses ulike uttrykks systemer. Dette gjør at selv-montering av proteiner som skal studert i deres opprinnelige cellulære sammenhenger. Videre gir det muligheten til å sammenligne protein forsamlingen over vidt avvikende celle-kultur modeller for å studere bevaring av mekanismer som styrer protein selv-montering.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Jeff lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan, og Ellen Gyllenhammar for deres arbeid mot utviklingen av analysen. Dette arbeidet ble gjort for å oppfylle, delvis krav til doktorgrads avhandlingen forskning for T.S.K. som studenter registrert med Open University, UK, og Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, henholdsvis. Ytterligere analyse relatert informasjon finnes på https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Opprinnelige data underliggende dette manuskriptet kan nås fra Stowers opprinnelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Dette arbeidet ble finansiert av NIH Director ‘ s Early Independence Award DP5-OD009152, mars av kroner Foundation Grant no. 5-FY17-32, og Stowers Institute for Medical Research.
Forfatter bidrag er som følger. Konseptualisering: T.S.K., S.V., og R.H.; Metodikk: T.S.K., S.V., A.R.G. og A. B; Gransking: S.V., T.S.K., og A.R.G.; Formell analyse: S.V., og T.S.K.; Data Håndplukking: T.S.K.; Visualisering: T. S. K, og S.V., skrive (original draft): S.V., og T.S.K.; Skriving (gjennomgang, redigering): R.H., S.V. og T.S.K.; og finansiering oppkjøp: R.H.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |