Den här artikeln beskrivs ett FRET-baserat flöde flödescytometrianalys protokoll för att kvantifiera protein självmontering i både S. cerevisiae och HEK293T celler.
Protein själv-församlingen reglerar proteinfunktion och compartmentalizes cellulära processer i tid och rum. Nuvarande metoder för att studera det lider av låg känslighet, indirekta Läs-outs, begränsad genomströmning, och/eller populationsnivå snarare än encellig upplösning. Vi konstruerade en flödescytometri-baserad enda metod som tar upp alla dessa begränsningar: distribuerade Amphifluoric FRET eller DAmFRET. DAmFRET detekterar och kvantifierar proteinself-församlingar av sensibiliserade emission FRET in vivo, möjliggör distribution över modellsystem-från jäst till mänskliga celler-och uppnår känslig, Single-cell, hög genomströmning avläsnings-oberoende av protein lokalisering eller löslighet.
Analyser för att studera homotypic protein interaktioner, eller “själv-församling” är viktiga eftersom oligomeriska tillstånd och löslighet av proteiner diktera deras funktion. Proteomen vimlar av homo-multimers1,2,3,4, medan förhållandevis få proteiner fungerar som monomerer. Proteiner kan också montera aberrantly på grund av stress, ålder, eller misregulation, vilket leder till patologiska förändringar i aktivitet. Att identifiera de faktorer som modulera sådana händelser, eller ens den fysiska karaktären av sammansättningarna, är ofta exceptionellt utmanande.
Ett växande antal proteiner är nu erkända för att själv montera med extraordinära kooperativitet och obestämd stökiometri, vilket resulterar i deras demixning från andra cellulära beståndsdelar, som protein täta faser. Dessa tar formen av oordnade kondensat, såsom droppar och geler, eller mycket beställda glödtrådar, såsom amyloid fibrer. Den överensstämmande fluktuationer i samband med den senare göra sin ursprungliga bildandet, eller nukleation, till sin natur probabilistiska på molekylär nivå5,6. Eftersom sannolikheten för kärnbildning skalor med volym, kan bildandet av sådana församlingar vara mycket stokastiska i de rumsliga gränserna för levande celler7,8. Vid extrema av stokastisk nukleation-begränsad fasseparation är prioner, mycket beställda protein sammansättningar som bara sällan nukleate spontant, men en gång bildats, mall sin egen tillväxt på obestämd tid. Ett sådant protein, som kallas ASC, utför en digital Prion-liknande switch i aktiviteten hos däggdjurs medfödda immunceller. ASC självmontering är kärnan i dess interaktion med specifika proteiner som har själva oligomerized på bindande patogen-eller faroassocierade molekylära mönster. Den ASC församlingar i sin tur sedan procaspase-1 att själv montera och aktivera, vilket leder till cytokin mognad och pyroptos i cellen9,10. Regionen av ASC som är ansvarig för dess enhet, hör hemma till död området Superfamily, som består av över 100 medlemmar i människa proteomen. Trots de centrala rollerna för döden domäner i medfödda immunitet och programmerad celldöd, de flesta av dem har ännu inte karakteriserats med avseende på självmontering. Upptäckten och karaktäriseringen av ytterligare proteiner med sådant beteende kommer att underlättas avsevärt av en direkt, encellig avläsning av protein självmontering.
De klassiska proteinbiokemiska metoderna för att studera proteiners själv sammansättning, såsom kromatografi av storlek och ultracentrifugation, är till stor del begränsade till bedömningar på populationsnivå. Men cell-till-cell heterogenitet till följd av nukleation-begränsade fasövergångar kan inte modelleras med denna detaljnivå. Single-cell metoder baserade på fluorescens mikroskopi återfå denna förmåga, men saknar den genomströmning som krävs för att exakt kvantifiera nukleation eller att upptäcka sällsynta sammansättningar. Dessutom är lösliga själv sammansättningar, som de flesta enzymer och oligomerer före amyloid, för små och mobila att lösas med vanlig ljusmikroskopi. De kan upptäckas med mer sofistikerade metoder såsom fluorescens korrelationsspektroskopi, men dessa är mycket begränsade i cell nummer och genomströmning.
Närhet-baserade analyser av protein sammansättningen, såsom FRET och Split fluorophore kompletation, erbjuder en potentiell lösning på dessa problem. Emellertid, de kräver i allmänhet användning av två olika konstruktioner uttrycker protein av intresse smält till kompletterande Taggar-givaren och acceptorn fluoroforer i fallet med FRET. Detta äventyrar experimentell genomströmning och minskar också känsligheten på grund av cell-till-cell variation i de relativa nivåerna av givare och acceptor. För att kringgå detta, designade vi ett test som sysselsätter en photoconvertible fluorophore, mEos 3,111, som tillåter en enda konstruktion för att uttrycka både givare-och acceptor-märkta protein. Utsläppet spektrum av okonverterade mEos 3,1 (GFP-liknande givare) tillräckligt överlappar excitation spektrum av photokonverterade mEos 3,1 (dsRed-liknande acceptor) för att FRET att inträffa när molekylerna är i närheten (< 10 nm). Således, genom att utsätta celler till en empiriskt bestämd dos av 405 nm ljus, som photokonverterar en optimal fraktion av totala mEos 3,1 i acceptor form, vi uppnå konsekventa och reproducerbara relativa nivåer av givare och acceptor över flera prover, uttrycks nivåer och experiment. Vi mäter acceptorfluorescensen när upphetsad antingen direkt med 561 nm ljus, eller indirekt (genom energiöverföring från givaren) med 488 nm ljus (dvs., sensibiliserade utsläpp FRET). Vi rapporterar protein sammansättning som förhållandet mellan dessa två värden och term det amphifluoric FRET eller AmFRET.
För att beräkna protein koncentrationen med flödescytometri beräknar vi först den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos Spc42 märkta med mEos 3.1. Eftersom jästceller innehåller cirka 1000 molekyler av Spc42, beräknar vi sedan fluorescensintensiteten hos en enda fluorescerande grön mEos 3.1-molekyl. Genom att utnyttja även photoconversion vid alla cellulära koncentrationer (figur 1e), korrelerar vi sedan totala MeOS 3,1 fluorescens värden för alla acceptor intensiteter efter photoconversion. Vi kan sedan dela upp det totala antalet mol av fluorescerande proteiner med den ungefärliga cytosoliska volym (som bestäms med hjälp av Imaging Flow cytometry) för att få den totala cytosoliska koncentrationen av proteinet av intresse. För exakta beräkningar, vänligen se originalmanuskriptet8.
Genom att uttrycka mEos 3,1-smält protein från en 2Μ plasmid i jäst, vi sond en cirka tusen gånger proteinkoncentration i varje prov8. Vi uppnår samma i HEK293T celler på grund av variation i plasmid upptag under transfektion, och därmed variabel kopia nummer.
Den resulterande fördelningen av AmFRET, eller DAmFRET, för många tusen celler avslöjar koncentrationsberoende av själv-församlingen i Cytosol för något protein av intresse. Övergripande, DAmFRET representerar en möjliggörande metod för att upptäcka och karakterisera protein självmontering med en oöverträffad kombination av känslighet, genomströmning, och reproducerbarhet.
När du använder en avbildning flödescytometerns gör det möjligt för oss att få in vivo protein koncentrationen mätningar, sådana cytometrar är ännu inte tillgängliga på de flesta forskningsinstitut. Ändå kan DAmFRET köras även i en typisk icke-avbildning flödescytometerns att få distributioner av protein sammansättningen över utbudet av proteinuttryck.
DAmFRET är den mest omfattande metoden för att upptäcka protein självmontering in vivo. DAmFRET kombinerar direkt läsning av homotypic protein-protein interaktioner över ett brett spektrum av koncentration, med enkel cell upplösning och högt genomströmning. Den direkta uppläsning av DAmFRET och det faktum att de smält proteiner inte kräver en specifik subcellulär lokalisering eller olösligt tillstånd eliminerar falska positiva och utökar dess tillämplighet till ett brett spektrum av proteiner på deras inhemska subcellulära platser. I synnerhet genom att märka organeller med fluoroforer som är spektralt förenliga med mEos 3.1, såsom T-Sapphire och mCardinal, kan den subcellulära lokalisering av lösliga och sammansatta former av proteiner bestämmas tillsammans med DAmFRET.
Med hjälp av Imaging Flow flödescytometerns som beskrivs här, det tar 8 h att analysera en 96-bra tallrik med cirka 20 000 gated celler per brunn. Men vi utför också rutinmässigt DAmFRET med standard (icke-Imaging) cytometrar som uppnår mycket högre genomströmning (upp till 20 prover per minut). I själva verket, någon flödescytometer med rumsligt separerade 488 och 561 nm lasrar som är fri från log amp artefakter och har lämpliga PMTs och filter för att upptäcka givare, FRET, och acceptor signaler är tillräckligt för att utföra DAmFRET. För närvarande kommer denna förstärkning i genomströmningen på bekostnad av lokaliseringsinformation och volym bestämning, så att självmontering måste sedan analyseras som en funktion av proteinuttryck snarare än koncentration. Detta är inte ett problem för kvalitativa analyser. Dessutom, det kan vara möjligt att uppskatta cytosoliska volym genom att fixera en spektralt distinkt fluorophore till ett endogent “Housekeeping” protein vars uttryck tätt korrelerar med cytosoliska volym.
Som vi har visat genom vår utplacering av DAmFRET i både jäst och däggdjursceller, kan DAmFRET enkelt anpassas till olika uttrycks system. Detta möjliggör självmontering av proteiner som ska studeras i deras inhemska cellulära sammanhang. Dessutom erbjuder det möjligheten att jämföra protein sammansättningen över vitt skilda cell-kultur modeller för att studera bevarandet av mekanismer som reglerar protein självmontering.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan, och Ellen Ketter för deras arbete mot utveckling av analysen. Detta arbete gjordes för att uppfylla, delvis, krav på doktorsavhandling forskning för T.S.K. och A. G som studenter registrerade hos Open University, Storbritannien, och Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, respektive. Ytterligare analysrelaterad information finns på https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Ursprungliga data bakom detta manuskript kan nås från Stowers ursprungliga dataarkivet på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Detta arbete finansierades av NIH Director ‘ s Early Independence Award DP5-OD009152, mars Dimes Foundation Grant nr 5-VÅ17-32, och Stowers Institute for Medical Research.
Författarens bidrag är följande. Konceptualisering: T.S.K., S.V. och R.H.; Metodik: T.S.K., S.V., A.R.G. och A. B. Utredning: S.V., T.S.K., och A.R.G.; Formell analys: S.V., och T.S.K.; Data Curation: T.S.K.; Visualisering: T. S. K och S.V., skriva (original utkast): S.V., och T.S.K.; Skriva (granska, redigera): R.H., S.V. och T.S.K.; och finansiering förvärv: R.H.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |