यह आलेख दोनों एस cerevisiae और HEK293T कोशिकाओं में प्रोटीन स्वयं विधानसभा मात्रा निर्धारित करने के लिए एक FRET-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
प्रोटीन स्व-असेम्बली प्रोटीन समारोह को नियंत्रित करता है और अंतरिक्ष और समय में सेलुलर प्रक्रियाओं को कम करता है। यह अध्ययन करने के लिए वर्तमान तरीकों कम संवेदनशीलता से ग्रस्त हैं, अप्रत्यक्ष पढ़ने के बहिष्कार, सीमित प्रवाह, और / हम एक प्रवाह साइटोमेट्री आधारित एकल पद्धति है कि इन सीमाओं के सभी पते डिजाइन: वितरित एम्फीफ्लोरिक FRET या DAmFRET. DAmFRET का पता लगाता है और vivo में संवेदनशील उत्सर्जन FRET द्वारा प्रोटीन आत्म-असेम्बली का परिमाण, मॉडल सिस्टम भर में तैनाती सक्षम बनाता है- खमीर से मानव कोशिकाओं के लिए और संवेदनशील, एकल सेल, उच्च throughput पठन-आउट प्राप्त प्रोटीन की परवाह किए बिना स्थानीयकरण या विलेयता.
homotypic प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए परख, या “स्व-असेम्बली” महत्वपूर्ण हैं क्योंकि अल्पवयीन राज्य और प्रोटीन की घुलनशीलता उनके कार्य हुक्म. प्रोटीओम में होमो-मल्टीमर्स1,2,3,4,जबकि अपेक्षाकृत कम प्रोटीन मोनोमर के रूप में कार्य करते हैं। प्रोटीन भी तनाव, उम्र, या misregulation के कारण aberantly इकट्ठा कर सकते हैं, गतिविधि में रोग परिवर्तन के लिए अग्रणी. कारकों की पहचान है कि इस तरह की घटनाओं, या यहां तक कि विधानसभाओं की शारीरिक प्रकृति, अक्सर असाधारण चुनौतीपूर्ण है.
प्रोटीन की बढ़ती संख्या अब असाधारण cooperativity और अनिश्चित स्टोइकियोमेट्री के साथ स्वयं को इकट्ठा करने के लिए मान्यता प्राप्त कर रहे हैं, प्रोटीन घने चरणों के रूप में अन्य सेलुलर घटकों से उनके demixing में जिसके परिणामस्वरूप. ये अव्यवस्थित संघनित ोंकाओं का रूप लेते हैं, जैसे बूंदों और जैल, या अत्यधिक आदेशित फिलामेंट, जैसे एमिलॉयड फाइबर। बाद के साथ जुड़े अनुरूप उतार-चढ़ाव आणविक स्तर5,6पर स्वाभाविक रूप से संगतिक, अपने प्रारंभिक गठन या नाभिक को प्रदान करते हैं। क्योंकि मात्रा के साथ नाभिक तराजू की संभावना, इस तरह के विधानसभाओं के गठन के रहने वाले कोशिकाओं के स्थानिक दायरे में अत्यधिक stochastic हो सकता है7,8. stochastic नाभिक-सीमित चरण जुदाई के चरम पर prions हैं, अत्यधिक आदेश प्रोटीन विधानसभाओं कि केवल शायद ही कभी सहज रूप से नाभिक, लेकिन एक बार गठन, टेम्पलेट अपने स्वयं के विकास अनिश्चित काल के लिए. ऐसा ही एक प्रोटीन, एएससी के रूप में जाना जाता है, स्तनधारी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिविधि में एक डिजिटल prion की तरह स्विच निष्पादित करता है. एएससी आत्म विधानसभा विशिष्ट प्रोटीन है कि खुद बाध्यकारी रोगज़नक़- या खतरे से जुड़े आणविक पैटर्न पर oligomerized है के साथ अपनी बातचीत से नाभिक है. एएससी असेंबली बारी में न्यूक्लिएट procaspase-1 स्वयं को इकट्ठा करने और सक्रिय करने के लिए, कोशिका9,10के साइटोकीन परिपक्वता और pyroptosis के लिए अग्रणी . अपनी विधानसभा के लिए जिम्मेदार एएससी के क्षेत्र मौत डोमेन superfamily, जो मानव proteome में एक से अधिक सैकड़ों सदस्यों के होते हैं के अंतर्गत आता है. जन्मजात प्रतिरक्षा और क्रमादेशित सेल मौत में मौत डोमेन की निर्णायक भूमिकाओं के बावजूद, उनमें से ज्यादातर अभी तक आत्म विधानसभा के संबंध में विशेषता नहीं किया गया है. इस तरह के व्यवहार के साथ अतिरिक्त प्रोटीन की खोज और विशेषता बहुत प्रोटीन स्वयं विधानसभा के एक प्रत्यक्ष, एकल सेल readout द्वारा सुविधा होगी.
शास्त्रीय प्रोटीन जैव रसायन दृष्टिकोण प्रोटीन स्वयं विधानसभा का अध्ययन करने के लिए, इस तरह के आकार बहिष्कार क्रोमैटोग्राफी और ultracentrifugation के रूप में, जनसंख्या स्तर के आकलन के लिए काफी हद तक सीमित हैं. तथापि, न्यूक्लिएशन-सीमित प्रावस्था संक्रमण के परिणामस्वरूप कोशिका-से-कोशिका विषमता को विस्तार के इस स्तर के साथ मॉडल नहीं किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के आधार पर एकल सेल दृष्टिकोण इस क्षमता हासिल है, लेकिन सही मात्रा नाभिक या दुर्लभ विधानसभाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक प्रवाह की कमी. इसके अलावा, इस तरह के सबसे एंजाइमों और पूर्व amyloid oligomers के रूप में घुलनशील आत्म विधानसभा, बहुत छोटे हैं और मोबाइल मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा हल किया जा करने के लिए. वे इस तरह के फ्लोरोसेंट सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में और अधिक परिष्कृत दृष्टिकोण से पता लगाया जा सकता है, लेकिन इन सेल संख्या और प्रवाह में बहुत सीमित हैं.
प्रोटीन असेंबली की निकटता-आधारित परख, जैसे FRET और स्प्लिट फ्लोरोफोर पूरकेशन, इन समस्याओं के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करते हैं। हालांकि, वे आम तौर पर दो अलग अलग constructs के उपयोग की आवश्यकता होती है पूरक टैग के लिए जुड़े ब्याज के प्रोटीन व्यक्त दाता और FRET के मामले में स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर्स. यह प्रयोगात्मक थ्रूपुट से समझौता करता है और दाता और स्वीकारकर्ता के सापेक्ष स्तरों में सेल-टू-सेल भिन्नता के कारण संवेदनशीलता को भी कम करता है। इस दरकिनार करने के लिए, हम एक परख है कि एक photoconvertible fluorophor, mEos3.111,जो एक एकल निर्माण दोनों दाता व्यक्त करने की अनुमति देता है को रोजगार डिजाइन- और स्वीकारकर्ता टैग प्रोटीन. unconverted mEos3.1 (GFP की तरह दाता) के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पर्याप्त photoconverted mEos3.1 (dsRed की तरह स्वीकारकर्ता) की उत्तेजना स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप करने के लिए FRET होने की अनुमति जब अणुओं करीब निकटता में हैं (lt;10 एनएम). इस प्रकार, 405 एनएम प्रकाश की एक अनुभवजन्य निर्धारित खुराक के लिए कोशिकाओं को उजागर करके, जो photoconverts कुल mEos3.1 का एक इष्टतम अंश स्वीकारकर्ता के रूप में, हम दाता और स्वीकार करने के कई नमूनों में दाता और स्वीकार करने के लगातार और reproducible रिश्तेदार स्तर को प्राप्त करने, व्यंजक स्तर और प्रयोग. हम स्वीकारकर्ता फ्लोरोसेंट उपाय जब या तो सीधे 561 एनएम प्रकाश के साथ उत्साहित, या परोक्ष रूप से (दाता से ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा) 488 एनएम प्रकाश के साथ (यानी, संवेदनशील उत्सर्जन FRET). हम प्रोटीन असेंबली को इन दो मूल्यों के अनुपात के रूप में रिपोर्ट करते हैं और इसे उभयप्रवाहीय FRET या AmFRET कहते हैं।
प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रोटीन एकाग्रता की गणना करने के लिए, हम पहले mEos3.1 के साथ टैग Spc42 का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना. क्योंकि खमीर कोशिकाओं Spc42 के लगभग 1000 अणु होते हैं, हम तो एक भी फ्लोरोसेंट हरी mEos3.1 अणु की फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना. सभी सेलुलर सांद्रताओं पर सम प्रकाश रूपांतरण का लाभ उठाकर (चित्र 1E) हम तो फोटो रूपांतरण के बाद सभी स्वीकारकर्ता तीव्रता के लिए कुल mEos3.1 फ्लोरोसेंट मानसह. हम तो अनुमानित cytosolic मात्रा द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की moles की कुल संख्या को विभाजित करने में सक्षम हैं (के रूप में इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग कर निर्धारित) ब्याज की प्रोटीन की कुल cytosolic एकाग्रता प्राप्त करने के लिए. सटीक गणना के लिए, कृपया मूल पांडुलिपि8देखें.
खमीर में एक 2 डिग्री प्लाज्मिड से mEos3.1-fused प्रोटीन व्यक्त करके, हम हर नमूने में प्रोटीन एकाग्रता के एक लगभग हजार गुना रेंज की जांच8. हम transfection के दौरान प्लाज्मिड तेज में भिन्नता के आधार पर HEK293T कोशिकाओं में एक ही प्राप्त है, और इसलिए चर प्रतिलिपि संख्या.
AmFRET, या DAmFRET के परिणामस्वरूप वितरण, कोशिकाओं के कई हजारों के लिए ब्याज के किसी भी प्रोटीन के लिए cytosol में आत्म विधानसभा की एकाग्रता निर्भरता से पता चलता है. कुल मिलाकर, DAmFRET की खोज और संवेदनशीलता का एक अभूतपूर्व संयोजन के साथ प्रोटीन आत्म विधानसभा की विशेषता के लिए एक सक्षम पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है, throughput, और reproducibility.
एक इमेजिंग साइटोमीटर का उपयोग करते समय हमें विवो प्रोटीन एकाग्रता माप में प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है, इस तरह के cytometers अभी तक ज्यादातर अनुसंधान संस्थानों में उपलब्ध नहीं हैं. फिर भी, DAmFRET प्रोटीन अभिव्यक्ति की सीमा पर प्रोटीन विधानसभा के वितरण प्राप्त करने के लिए एक ठेठ गैर-इमेजिंग साइटोमीटर में भी चलाया जा सकता है।
DAmFRET विवो में प्रोटीन स्वयं विधानसभा का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक तरीका है। DAmFRET एकाग्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर homotypic प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के प्रत्यक्ष पढ़ने के बाहर को जोड़ती है, एकल सेल संकल्प और उच्च थ्रूपुट के साथ. DAmFRET के प्रत्यक्ष पठन-आउट और तथ्य यह है कि जुड़े प्रोटीन एक विशिष्ट subcellular स्थानीयकरण या अघुलनशील राज्य की आवश्यकता नहीं है झूठी सकारात्मक समाप्त और उनके मूल subcellular स्थानों पर प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अपनी प्रयोज्यता फैली हुई है. विशेष रूप से, fluorophores कि इस तरह के टी Sapphire और mCardinal के रूप में mEos3.1 के साथ वर्णक्रमीय संगत कर रहे हैं के साथ organelles टैगिंग द्वारा, घुलनशील और प्रोटीन के इकट्ठे रूपों के subcellular स्थानीयकरण DAmFRET के साथ निर्धारित किया जा सकता है.
यहाँ वर्णित के रूप में इमेजिंग प्रवाह cytometer का उपयोग करना, यह लेता है 8 एच एक 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति लगभग 20,000 gated कोशिकाओं के साथ प्लेट का विश्लेषण करने के लिए. हालांकि, हम भी नियमित रूप से मानक (गैर-इमेजिंग) cytometers कि बहुत अधिक थ्रूपुट (प्रति मिनट 20 नमूने तक) को प्राप्त करने के साथ DAmFRET प्रदर्शन करते हैं। वास्तव में, स्थानिक रूप से अलग 488 और 561 एनएम लेज़रों के साथ किसी भी प्रवाह साइटोमीटर कि लॉग amp कलाकृतियों से मुक्त है और उचित PMTs और दाता का पता लगाने के लिए फिल्टर है, FRET, और स्वीकार करने वाले संकेतों के लिए पर्याप्त है DAmFRET प्रदर्शन करने के लिए. वर्तमान में, throughput में यह लाभ स्थानीयकरण जानकारी और मात्रा निर्धारण की कीमत पर आता है, इस तरह है कि आत्म विधानसभा तो एकाग्रता के बजाय प्रोटीन अभिव्यक्ति के एक समारोह के रूप में विश्लेषण किया जाना चाहिए. यह गुणात्मक विश्लेषण के लिए कोई समस्या नहीं है। इसके अतिरिक्त, यह एक अंतर्जात “हाउसकीपिंग” प्रोटीन जिसका अभिव्यक्ति कसकर cytosolic मात्रा के साथ संबंधित करने के लिए एक वर्णक्रमीय अलग फ्लोरोफोर fusing द्वारा cytosolic मात्रा का अनुमान लगाने के लिए संभव हो सकता है.
जैसा कि हम दोनों खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में DAmFRET की हमारी तैनाती के माध्यम से प्रदर्शन किया है, DAmFRET आसानी से विभिन्न अभिव्यक्ति प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह प्रोटीन के आत्म विधानसभा उनके मूल सेलुलर संदर्भों में अध्ययन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा, यह व्यापक रूप से भिन्न सेल संस्कृति मॉडल भर में प्रोटीन विधानसभा की तुलना करने की क्षमता प्रदान करता है तंत्र है कि प्रोटीन स्वयं विधानसभा शासन के संरक्षण का अध्ययन.
The authors have nothing to disclose.
हम जेफ लैंग, जे Unruh, Jianzheng वू, तारिक खान, और एलेन Ketter परख के विकास की दिशा में अपने काम के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम को पूरा करने के लिए किया गया था, भाग में, T.S.K. और A.R.G के लिए पीएचडी थीसिस अनुसंधान के लिए आवश्यकताओं के रूप में मुक्त विश्वविद्यालय, ब्रिटेन के साथ पंजीकृत छात्रों, और चिकित्सा अनुसंधान स्नातक स्कूल, संयुक्त राज्य अमेरिका के लिए Stowers संस्थान, क्रमशः. अतिरिक्त परख से संबंधित जानकारी https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016 में पाया जा सकता है. इस पांडुलिपि अंतर्निहित मूल डेटा http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372 पर Stowers मूल डेटा भंडार से पहुँचा जा सकता है. इस काम NIH निदेशक के प्रारंभिक स्वतंत्रता पुरस्कार DP5-OD009152, Dimes फाउंडेशन अनुदान संख्या 5-FY17-32 के मार्च, और चिकित्सा अनुसंधान के लिए Stowers संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया.
लेखक योगदान इस प्रकार हैं. संकल्पना: T.S.K., S.V., और R.H.; विधि: T.S.K., S.V., A.R.G., और A.B.; जांच: S.V., T.S.K., और A.R.G.; औपचारिक विश्लेषण: एस.वी., और टी.एस.के.; डेटा करनिर्धारण: T.S.K.; विज़ुअलाइज़ेशन: T.S.K, और S.V., लेखन (मूल ड्राफ्ट): S.V., और T.S.K.; लेखन (समीक्षा, संपादन): R.H., S.V., और T.S.K.; और अनुदान अधिग्रहण: आर.एच.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |