본 문서는 S. 세레비시아 및 HEK293T 세포 모두에서 단백질 자가 조립을 정량화하는 FRET 기반 유동 세포 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.
단백질 자가 조립은 단백질 기능을 제어하고 공간과 시간에 세포 과정을 구획화합니다. 그것을 연구하는 현재 방법은 낮은 감도, 간접 판독, 제한된 처리량 및 / 또는 단일 세포 해상도보다는 인구 수준에서 고통받습니다. 분산 양피플루오성 FRET 또는 DAmFRET : 우리는 이러한 모든 한계를 해결하는 흐름 세포 분석 기반의 단일 방법론을 설계했다. DAmFRET는 생체 내 감작 방출 FRET에 의해 단백질 자가 어셈블리를 감지하고 정량화하고, 효모에서 인간 세포에 이르는 모델 시스템 전반에 배포할 수 있으며, 단백질에 관계없이 민감한 단일 세포, 고처리량 판독을 달성합니다. 현지화 또는 용해도.
상동성 단백질 상호 작용을 연구하는 아세, 또는 “자기 조립”은 단백질의 올리고메 상태와 용해도가 그들의 기능을 지시하기 때문에 중요합니다. 프로테오메는 호모 멀티머 1,2,3,4로풍부하지만 상대적으로 적은 단백질이 단량체로 기능합니다. 단백질은 또한 활동의 병리학적인 변경으로 이끌어 내는 긴장, 나이, 또는 잘못 조절 때문에 비차등으로 집합할 수 있습니다. 이러한 이벤트 또는 어셈블리의 물리적 특성을 조절하는 요인을 식별하는 것은 매우 어려운 경우가 많습니다.
단백질의 증가는 지금 단백질 조밀한 단계로 그밖 세포 성분에서 그들의 demixing 결과로 특별한 협력성 및 불확실한 stoichiometry를 가진 각자 집합하기 위하여 인식됩니다. 이들은 물방울과 젤과 같은 무질서한 응축수의 양식, 또는 아밀로이드 섬유와 같은 고도로 주문한 필라멘트의 양식을 취합니다. 후자와 관련된 형태 변동은 분자 수준5,6에서본질적으로 확률적으로 초기 형성 또는 핵 형성을 렌더링합니다. 핵 형성의 확률이 부피가 있는 스케일이기 때문에, 이러한 어셈블리의 형성은 살아있는 세포7,8의공간 적 경계에서 매우 확률적일 수 있다. 과식 핵 형성 제한 상 분리의 극단에서 프리온, 거의 자발적으로 핵을 핵화하지 않는 고도로 정렬 된 단백질 어셈블리, 하지만 일단 형성, 템플릿 자신의 자신의 성장을 무기한. ASC로 알려진 한 개의 단백질은 포유류 선천적 면역 세포의 활성에서 디지털 프리온과 같은 스위치를 실행합니다. ASC 자가 조립은 결합 병원체 또는 위험 관련 분자 패턴에 따라 올리고머화 된 특정 단백질과의 상호 작용에 의해 핵화됩니다. ASC 어셈블리는 차례로 프로카스파제-1을 자체 조립하고 활성화하여 세포9,10의사이토카인 성숙 및 발열로 이어진다. 그 어셈블리를 담당하는 ASC의 영역은 인간의 프로테오메에서 100 명 이상의 회원으로 구성된 죽음 영역 슈퍼 패밀리에 속한다. 선천적인 면역과 프로그램된 세포 사멸에 있는 죽음 도메인의 중추적인 역할에도 불구하고, 그들의 대부분은 아직 자기 집합에 관하여 특징이지 않았습니다. 이러한 거동을 가진 추가 단백질의 발견 및 특성화는 단백질 자가 조립의 직접적인 단세포 판독에 의해 크게 촉진될 것이다.
크기 배제 크로마토그래피 및 초원심분리와 같은 단백질 자가 조립을 연구하는 고전 적 단백질 생화학 접근법은 주로 인구 수준 평가에 국한됩니다. 그러나, 핵 형성 제한된 상 전이에서 유래하는 세포 간 이질성은 이 세부 수준으로 모델링될 수 없습니다. 형광 현미경 검사법에 근거를 둔 단세포 접근은 이 기능을 회복합니다, 그러나 정확하게 핵을 정량화하거나 희소한 어셈블리를 검출하기 위하여 필요한 처리량이 부족합니다. 또한 대부분의 효소 및 사전 아밀로이드 올리고머와 같은 수용성 자가 조립체는 너무 작고 이동성이 있어 표준 광 현미경 검사법으로 해결할 수 없습니다. 그들은 형광 상관 분광법과 같은 보다 정교한 접근법에 의해 검출될 수 있지만, 이들은 세포 수와 처리량에서 매우 제한적입니다.
FRET 및 분할 형광부 보완과 같은 단백질 조립의 근접 기반 어설션은 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결책을 제공합니다. 그러나, 이들은 일반적으로 FRET의 경우 보상적 태그-공여자 및 수용기 형광소에 융합된 관심의 단백질을 발현하는 2개의 상이한 구성물의 사용을 요구한다. 이것은 실험적인 처리량을 타협하고 또한 기증자와 수용자의 상대적인 수준에 있는 세포 간 변이로 인해 감도를 감소시킵니다. 이를 우회하기 위해, 우리는 하나의 구조가 기증자 및 수용자 태그 단백질을 모두 표현할 수 있도록 광전환 형광포, mEos3.111을사용하는 분석방법을 설계했습니다. 변환되지 않은 mEos3.1 (GFP와 같은 기증자)의 방출 스펙트럼은 분자가 근접할 때 FRET가 발생할 수 있도록 포토 컨버터블 mEos3.1 (dsRed와 같은 수용자)의 여기 스펙트럼과 충분히 겹칩니다(<10 nm). 따라서, 세포를 경험적으로 결정된 405 nm 광량에 노출시킴으로써, 총 mEos3.1의 최적 분율을 수용자 형태로 포토컨버터게 변환함으로써, 우리는 여러 샘플에 걸쳐 기증자 및 수용자의 일관되고 재현 가능한 상대적 수준을 달성하고, 표현 수준 및 실험을 할 수 있습니다. 우리는 561 nm 빛으로 직접 또는 간접적으로 (기증자로부터의 에너지 전송에 의해) 488 nm 빛 (즉, 과민 방출 FRET)으로 흥분 할 때 수용자 형광을 측정합니다. 우리는 이 두 값의 비율로 단백질 집합을 보고하고 양피불소화 FRET 또는 AmFRET를 기간합니다.
유세포분석으로 단백질 농도를 계산하기 위해 먼저 mEos3.1로 태그가 지정된 Spc42의 평균 형광 강도를 계산합니다. 효모 세포는 Spc42의 대략 1000 분자를 포함하기 때문에, 우리는 그 때 단 하나 형광 녹색 mEos3.1 분자의 형광 강도를 계산합니다. 모든 세포 농도에서 짝수 광변환을 활용함으로써(그림1E),우리는 광변환 다음의 모든 수용자 강도에 대한 총 mEos3.1 형광 값을 상관시낸다. 우리는 그 때 관심 있는 단백질의 총 세포토솔 농도를 얻기 위하여 대략적인 세포토솔성 부피 (화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 결정된 대로)에 의하여 형광 성 단백질의 총 두더지의 수를 분할할 수 있습니다. 정확한 계산은 원고 8을 참조하십시오.
효모에서 2μ 플라스미드에서 mEos3.1 융합 단백질을 발현함으로써, 우리는 모든 샘플 8에서 약천 배의 단백질 농도를 조사합니다. 우리는 형질전환 도중 플라스미드 섭취량에 있는 변이의 미덕에 의해 HEK293T 세포에서 동일을 달성하고, 그러므로 가변 복사 수.
수천 개의 세포에 대한 AmFRET 또는 DAmFRET의 결과 분포는 관심 있는 모든 단백질에 대해 시토솔에서 자가 조립의 농도 의존성을 밝혀낸다. 전반적으로 DAmFRET는 감도, 처리량 및 재현성의 전례없는 조합으로 단백질 자가 조립을 발견하고 특성화할 수 있는 방법을 나타냅니다.
이미징 세포계를 사용하면 생체 내 단백질 농도 측정을 얻을 수 있지만, 이러한 세포계는 아직 대부분의 연구 기관에서 사용할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, DAmFRET는 단백질 발현의 범위에 걸쳐 단백질 조립의 분포를 얻기 위해 전형적인 비 이미징 세포계에서도 실행될 수 있다.
DAmFRET는 생체 내에서 단백질 자가 조립을 검출하는 가장 포괄적인 방법입니다. DAmFRET는 단일 세포 분해능및 높은 처리량과 함께 광범위한 농도에 걸쳐 동종 단백질-단백질 상호 작용의 직접 판독을 결합합니다. DAmFRET의 직접적인 판독과 융합된 단백질이 특정 세포외 국소화 또는 불용성 상태를 필요로 하지 않는다는 사실은 거짓 긍정을 제거하고 그들의 기본 세포 내 소위치에서 광범위한 단백질에 적용가능성을 확장합니다. 특히, T-사파이어 및 mCardinal과 같은 mEos3.1과 관전적으로 호환되는 형광단으로 세포기관을 태그함으로써 수용성 및 조립된 형태의 단백질의 세포내국소화를 DAmFRET와 함께 결정할 수 있습니다.
여기에 설명된 바와 같이 이미징 유동 세포계를 사용하여, 웰당 약 20,000개의 문이 있는 세포를 가진 96웰 플레이트를 분석하는 데 8시간이 걸린다. 그러나, 우리는 또한 일상적으로 훨씬 더 높은 처리량 (분당 20 샘플)을 달성 표준 (비 이미징) 세포계와 DAmFRET를 수행합니다. 사실, 공간적으로 분리 된 모든 유량 세포계 488 및 561 nm 레이저로 로그 앰프 아티팩트가 없고 기증자, FRET 및 수용자 신호를 감지하기위한 적절한 PMT 및 필터가 DAmFRET를 수행하기에 충분합니다. 현재, 처리량의 이득은 현지화 정보 및 부피 결정의 비용으로 온다, 이러한 자기 조립은 농도보다는 단백질 발현의 함수로 분석되어야한다. 이는 정성적 분석에 문제가 되지 않습니다. 추가적으로, 그의 발현이 세포질 양과 단단히 상관관계가 있는 내인성 “하우스키핑” 단백질에 스펙트럼적으로 명백한 불소 를 융합해서 세포질 부피를 추정하는 것이 가능할 지도 모릅니다.
효모 및 포유류 세포에 DAmFRET의 배치를 통해 입증했듯이 DAmFRET는 다양한 발현 시스템에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이것은 단백질의 자기 집합이 그들의 네이티브 세포 문맥에서 공부될 수 있게 합니다. 더욱이, 단백질 자가 조립을 지배하는 기계장치의 보존을 연구하기 위하여 넓게 발산하는 세포 배양 모형에 걸쳐 단백질 집합을 비교하는 기능을 제안합니다.
The authors have nothing to disclose.
제프 랭, 제이 운루, 젠정 우, 타리크 칸, 엘렌 케터가 분석 개발을 위해 노력한 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 부분적으로, 오픈 대학에 등록 된 학생으로 T.S.K. 및 A.R.G에 대한 박사 학위 학위 연구에 대한 요구 사항을 충족하기 위해 수행되었다, 영국, 의학 연구 대학원에 대한 Stowers 연구소, 미국. 추가 분석 관련 정보는 https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016 찾을 수 있습니다. 이 원고의 기본 원본 데이터는 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372 Stowers 원본 데이터 저장소에서 액세스할 수 있습니다. 이 작품은 NIH 이사의 조기 독립 상 DP5-OD009152, Dimes 재단 보조금 제 5-FY17-32의 행진, 및 의학 연구를위한 Stowers 연구소에 의해 지원되었다.
작성자 기여는 다음과 같습니다. 개념화: T.S.K., S.V., 및 R.H.; 방법론: T.S.K., S.V., A.R.G., 및 A.B; 조사: S.V., T.S.K., 및 A.R.G.; 공식 분석: S.V., 및 T.S.K. ; 데이터 큐레이션: T.S.K.; 시각화: T.S.K, S.V., 쓰기(원본 초안): S.V., 및 T.S.K.; 쓰기 (검토, 편집): R.H., S.V., 및 T.S.K.; 및 자금 조달 인수: R.H.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |