Summary
هنا، يتم تقديم نموذج تجريبي نقص التروية الخلفية الحرجة تليها بطارية من الاختبارات الوظيفية والأنسجة والجزيئية لتقييم فعالية العلاجات الوعائية.
Abstract
نقص تروية الأطراف الحرجة (CLI) هو حالة خطيرة تنطوي على مخاطر عالية من بتر الأطراف السفلية. على الرغم من إعادة الأوعية الدموية كونها العلاج الذهب القياسية، وعدد كبير من المرضى CLI ليست مناسبة لإعادة الأوعية الدموية الجراحية أو داخل الأوعية الدموية. تظهر العلاجات الوعائية كخيار لهؤلاء المرضى ولكنلا حاليا قيد التحقيق. قبل التطبيق في البشر، يجب اختبار هذه العلاجات في النماذج الحيوانية ويجب أن تكون آلياتها مفهومة بوضوح. وقد تم تطوير نموذج حيواني من نقص التروية الخلفية (HLI) عن طريق ربط وختان الشرايين والأوردة الحرقفية الخارجية البعيدة في الفئران. تم تجميع فريق شامل من الاختبارات لتقييم آثار نقص التروية والعلاجات الوعائية المفترضة على المستويات الوظيفية والأنسجة والجزيئية. تم استخدام دوبلر الليزر لقياس التدفق والتقييم الوظيفي للتسريب. تم تقييم استجابة الأنسجة من خلال تحليل الكثافة الشعرية بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة CD31 على المقاطع النسيجية من العضلات المعدية وعن طريق قياس كثافة الأوعية الجانبية بعد diaphonization. تم تحديد التعبير عن الجينات الوعائية من قبل RT-PCR التي تستهدف عوامل وعائية مختارة حصرا في الخلايا البطانية (ECs) بعد التقاط الليزر microdissection من العضلات الجهاز الهضمي الفئران. وكانت هذه الأساليب حساسة في تحديد الاختلافات بين الأطراف الإقفارية وغير الإقفارية وبين الأطراف المعالجة والأطراف غير المعالجة. ويوفر هذا البروتوكول نموذجاً للنسخ من CLI وإطاراً لاختبار العلاجات الوعائية.
Introduction
يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD) في الغالب على الأطراف السفلية. يحدث مرض التصلب المتعدد بسبب تصلب الشرايين، وهو انسداد في الشريان يمكن أن يسبب تقييدًا شديدًا لتدفق الدم في الأطراف السفلية1. العرج المتقطع هو أول مظهر من مظاهر PAD ويشير إلى ألم العضلات عند المشي. CLI هي المرحلة الأكثر شدة من PAD، ويجري تشخيصها في المرضى التي تظهر آلام الراحة الإقفارية، والقرحة أو الغرغرينا2. المرضى الذين يعانون من CLI لديهم خطر كبير من بتر، وخاصة إذا لم يعالج3. إعادة الأوعية الدموية في الأطراف السفلية (إما عن طريق الجراحة المفتوحة أو إجراء داخل الأوعية الدموية) هي حاليا الطريقة الوحيدة لتحقيق إنقاذ الأطراف. ومع ذلك، فإن حوالي 30٪ من مرضى CLI غير مناسبين لهذه الإجراءات، لأسباب تشمل موقع الآفات، ونمط انسداد الشرايين والاعتلال المشترك واسعة النطاق4،5. لذلك، هناك حاجة إلى علاجات جديدة لهؤلاء المرضى الذين لا يمكن علاجهم، مع تعزيز تكوين الأوعية الدموية هي الاستراتيجية تحت تحقيق أكثر كثافة.
قبل الاختبار في البشر، يجب النظر في فعالية وسلامة العلاجات الجديدة في الجسم الحي في النماذج الحيوانية. وقد وضعت عدة نماذج لدراسة CLI, في الغالب عن طريق تحفيز نقص التروية الخلفية (HLI) في الفئران6,7,8,9,10. ومع ذلك، فإن هذه النماذج تختلف في عدة جوانب بما في ذلك طبيعة الشرايين التي يتم ربطها و / أو مقتطعة وما إذا كانت الأوردة والأعصاب المحيطة بها يتم تشريحها وكذلك6،7،8، 9،10. إذا ما أخذت هذه الجوانب مجتمعة، سوف تؤثر على شدة إصابة نقص التروية-التسريب في كل الحيوان، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج. ولذلك، من الأهمية بمكان وضع بروتوكول فعال ينبغي فيه توحيد إجراء الحث على نقص التروية وتقييم مختلف الأهداف لتقييم ما إذا كان العلاج الوعائي المعطى سيكون فعالاً. ومن شأن بروتوكول تجريبي مصمم لتغطية جميع هذه الجوانب أن يوفر فهما شاملا للآليات التي تمارس بها العلاجات الوعائية آثارها ومقياسا لفعاليتها في كل من نتائجها. عملين متميزين نشرمؤخرا من قبل فريقنا هي مثال جيد11،12، التي تم فيها تقييم نهج مختلفة للحث على تكوين الأوعية العلاجية باستخدام نفس البروتوكول الذي سيتم وصفه بمزيد من التفصيل في هذا البروتوكول.
الهدف العام لهذا البروتوكول هو وصف نموذج تجريبي قابل للاستنساخ يمكن أن يحاكي آثار CLI ويضع الأساس التجريبي لتقييم شامل للآثار الوظيفية والأنسجة والجزيئية للأوعية المفترضة وكلاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات الحيوانية تتفق مع التوجيه 2010/63/EU وقد تمت الموافقة عليها من قبل الهيئة المؤسسية لرعاية الحيوان ومرخصة من قبل DGAV، الهيئة البرتغالية المختصة لحماية الحيوان (رقم الترخيص 023861/2013)
تحذير: العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في البروتوكولات سامة وضارة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية (القفازات، معطف المختبر، السراويل كاملة الطول، والأحذية المغلقة اصبع القدم)
1. نموذج مورين من نقص التروية الخلفية
ملاحظة: يتم إجراء جميع التجارب على الفئران الإناث C57BL/6 البالغة من العمر 22 أسبوعًا.
- إعداد الحلول
-
إعداد محلول التخدير
ملاحظة: يوفر هذا المزيج المخدر (الميدتوميدين والكيتامين) ما يصل إلى 30 دقيقة من الجمود ونافذة جراحية من 15 دقيقة. ويمكن إرجاع التأثير عن طريق إدارة atipamezole.- مع حقنة نظيفة، 1CC، وسحب 1 مل من medetomidine (1 ملغ / كغ من وزن الجسم)، والقضاء على فقاعات الهواء لقياسات دقيقة، وإضافته إلى أنبوب الصقر 15 مل.
- مع نظيفة، 1 سم مكعب حقنة، وسحب 0.75 مل من الكيتامين (75 ملغ / كغ وزن الجسم)، والقضاء على فقاعات الهواء لقياسات دقيقة وإضافته إلى أنبوب الصقر 15 مل التي تحتوي على medetomidine.
- إضافة 8.25 مل من المالحة المعقمة (0.9٪ NaCl)، من أجل الحصول على 10 مل من محلول التخدير.
- تحديد الأنبوب مع اسم المركبات، والتاريخ مختلطة وتاريخ انتهاء الصلاحية.
- يُحفظ في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
-
إعداد الحل المضاد للمهدئات
- مع نظيفة، 1 سم مكعب حقنة، وسحب 1 مل من atipamezole (5 ملغ / كغ من وزن الجسم)، والقضاء على فقاعات الهواء لقياسات دقيقة، وإضافته إلى أنبوب الصقر 15 مل.
- إضافة 9 مل من المالحة المعقمة (0.9٪ NaCl)، من أجل الحصول على 10 مل من محلول الارتداد.
- تحديد الأنبوب مع اسم المركبات، والتاريخ مختلطة وتاريخ انتهاء الصلاحية.
- يُحفظ في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
-
إعداد حل التسكين بعد العملية الجراحية
- مع نظيفة، 1 سم مكعب حقنة، وسحب 0.5 مل من البوبرينورفين (100 درجة مئوية / 15-30 غرام من وزن الجسم)، والقضاء على فقاعات الهواء لقياسات دقيقة، وإضافته إلى أنبوب الصقر 15 مل.
- إضافة 9.5 مل من المالحة المعقمة (0.9٪ NaCl)، من أجل الحصول على 10 مل من محلول التسكين.
- تحديد الأنبوب مع اسم المركبات، والتاريخ مختلطة وتاريخ انتهاء الصلاحية.
- يُحفظ في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
-
إعداد محلول التخدير
- الحث الجراحي لنقص تروية الطرف الخلفي
- الأدوات الجراحية اللازمة لهذا التدخل: ملقط مدبب، مقص الربيع، حامل إبرة العيون، مقص الجراحية وحامل إبرة. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف قبل الاستخدام. استخدام مسحات القطن لتشريح الدهون تحت الجلد.
- تحميل الحقنة مع محلول التخدير قبل عقد الماوس.
- كبح جماح الحيوان عن طريق تطبيق القوة وراء أذنيه ضد شبكة القفص، وعقد الجلد قدر الإمكان للحفاظ على الماوس غير متحرك.
- الحفاظ على الحيوان يميل مع خفض رأسه وإجراء حقن داخل الصفاق من محلول التخدير، والحفاظ على الحقنة في زاوية 45 درجة مع جسم الماوس.
- تحقق من عدم وجود ردود الفعل انسحاب دواسة، لتقييم عمق التخدير.
- إزالة الشعر من الطرف الخلفي الأيمن باستخدام حلاقة كهربائية. استخدام الكلورهيكسيدين مطهر الصابون فرك لإعداد الجلد. استخدام منشفة ورقية نظيفة لإزالة suds. تطبيق فرك الكلورهيكسيدين الجراحية وحماية منطقة الجلد مع الستائر المعقمة قبل نقل الفئران إلى جناح الجراحية المعقمة.
- وضع الحيوان في decubitus الظهرية وتقييده مع الأطراف الأربعة تنتشر بعيدا وتأمينها مع الشريط.
تحذير: إجراء الإجراء على لوحة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان مستقرة. يتم تنفيذ العملية الجراحية باستخدام مجهر تشريح في التكبير 10X أو 20x. - تطبيق محلول مطهر الكلورهيكسيدين باستخدام الشاش المعقم لوضع اللمسات الأخيرة على إعداد الجلد. باستخدام شفرة مشرط الجراحية رقم 11 إجراء شق الجلد 1 سم فوق الفخذ من الطرف الخلفي الأيمن.
- تشريح حاد ة الدهون تحت الجلد فضح حزمة الأوعية الدموية العصبية. باستخدام الملقط المدبب، مقص الربيع وحامل إبرة العيون، وفتح غمد الإلوالفخذ يبذير لفضح الأوعية الحرقفية والفخذية الخارجية البعيدة.
- تشريح وفصل الأوعية (الشريان والوريد) من العصب. باستخدام خياطة البولي بروبلين غير قابلة للامتصاص 7.0 ligate الشريان الحرقفي الخارجي القابي والوريد والشريان الفخذي القاصي والوريد.
- قطع الجزء من الشريان الفخذي ilio والأوردة بين العقد ة البعيدة والقريبة مع مقص الربيع.
- أغلق الشق بخياطة قابلة للامتصاص (على سبيل المثال، 5.0 خياطة فيكريل).
- تحميل الحقنة مع الحل المضاد للمهدئات واستخدام نفس الطريقة المفصلة في 1.2.3 و 1.2.4 لإجراء حقن داخل الصفاق من الحل المضاد للمهدئ.
- الرصد بعد العملية الجراحية
ملاحظة: يتم مراقبة الحيوانات بعناية كل 15-20 دقيقة للتأكد من أن جميع الحيوانات تتعافى بشكل جيد من المضادة للمهدئات. لا تترك الحيوانات التخدير أبدا دون مراقبة.- تقييم الانتعاش من التخدير: 1) رصد معدل وعمق التنفس. 2) تقييم ردود الفعل الحيوانية (دواسة وموقف العين)
- إجراء حقن تحت الجلد من التسكين بعد العملية الجراحية كل 8-12 ساعة.
- مراقبة الحيوانات يوميا بعد الجراحة تسجيل وصفا موجزا للحالة الصحية للالحيوان ومظهر موقع الجراحة، وضمان إغلاق جميع الغرز.
- إعادة خياطة الشق، إذا حدث الهسق. إذا لم تنجح، وتطبيق فيلم حاجز الجلد على شق للحماية من البول، إفرازات البراز، والاحتكاك والقص من الجلد وللمساعدة في عملية الشفاء.
2. تقييم تأثير الأوعية
ملاحظة: بعد تحريض نقص التروية، وتطبيق العامل العلاجي في الدراسة وتحقيق الإجراءات التالية. وترد تفاصيل الخطوات المتخذة في نقاط زمنية أخرى في إطار الفرع المقابل.
- الليزر دوبلر التسريب التصوير
- إزالة الشعر من كل من الأطراف الخلفية قبل يوم واحد من التحليل باستخدام حلاقة كهربائية تليها كريم مزيل الشعر.
- تخدير الفئران باستخدام محلول التخدير.
- ضع الحيوان على وسادة تدفئة بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لضمان عدم تغير درجة الحرارة أثناء الإجراء
- وضع الحيوان في موقف supine مع الساقين المضمون في موقف موسع. قياس المسافة بين الساقين والقدمين اليمنى واليسرى لكل الحيوان منذ تحديد المواقع من الحيوان يجب أن تكون مماثلة كلما كان الإجراء يجب أن تتكرر من أجل متابعة التغييرات في التسريب الخلفي مع مرور الوقت.
- بدء الحصول على البيانات باستخدام الليزر دوبلر perfusion الصور.
- بعد الانتهاء من عملية الشراء، أعد التخدير مع الحل المضاد للمهدئات.
- افتح برنامج تحليل الصورة وارسم المنطقة ذات الأهمية (ROI) حول الطرف الخلفي الإقفاري وعائد استثمار مماثل حول الطرف الخلفي غير الإقفاري.
- مراقبة قيم التدفق وتحديد التسريب كنسبة من التسريب في الطرف الإقفاري إلى ذلك في الطرف غير الإقفاري. وتقاس التغيرات في نسبة التسريب مع مرور الوقت.
- الكيمياء المناعية وتحليل الكثافة الشعرية
- بعد التخدير، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
- لحصاد العضلات المعدية المعدية لكلا الساقين، أولا، إزالة الجلد من كل من الأطراف الخلفية.
- حدد وتر أخيل وفصل الوتر عن العظام باستخدام مشرط 11 شفرة.
- عقد وتر أخيل وفصل العضلات من الساق والفيبولا حتى مفصل الركبة مع مقص الربيع.
- فصل العضلة ذات الرأسين femoris من العضلات المعدة.
- استخدام مقص الربيع لقطع الإدراج من العضلات المعدية في الركبة على مستوى مفصل الركبة.
- ضع عضلات الجهاز الهضمي المقطوعة في اتجاه عرضي على قرص فلين صغير بمساعدة 10٪ تراغاكانث.
- المفاجئة تجميد العينات في isopentane السائلة المبردة النيتروجين وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تقسيم.
- قطع 7 أقسام ميكرومتر من عينات العضلات على cryostat وجبل على الشرائح الزجاجية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. - إصلاح الشرائح الزجاجية في زجاجة تحتوي على الأسيتون النقي المبرد (حوالي 50 مل) لمدة 10 دقائق، عند -20 درجة مئوية.
- إضافة بيروكسيداز الهيدروجين 0.3٪ المخفف في الميثانول (50 مل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل مرتين في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) (50 مل) لما مجموعه 10 دقيقة.
- استخدام القلم الكاره للماء حول الأقسام.
ملاحظة: يسمح استخدام قلم كارهوي لتقليل مقدار الحلول التي تم إنفاقها أثناء البروتوكول. لجميع الحضانة استخدام 100 € L من جميع الحلول، لكل قسم. - تطبيق حل حجب من مصل الأرنب 5٪ في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع المضادة CD31 الفئران الأجسام المضادة أحادية النسيلة المخففة في 1:500 في 1٪ ألبوم المصل البقري (BSA) في PBS.
- اغسل ثلاث مرات في PBS لما مجموعه 30 دقيقة.
- إضافة أرنب ثانوي مضاد للفئران IgG في 1:200 في 1٪ BSA في PBS و 5٪ مصل الأرنب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل في PBS كما كان من قبل وإضافة المسمى avidin--مترافق مجمع بيروكسيداز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق وإضافة diaminobenzidine (DAB) بيروكسيداز الركيزة عدة لمدة 5 دقائق أخرى.
- مضاد وصمة عار المقاطع مع هيماتوإكسلين لمدة 10 ثوان قبل تصاعد.
- قياس الكثافات الشعرية باستخدام مجهر مشرق تستقيم (أي عدد من الشعيرات الدموية لكل عدد من الخلايا العضلية) في 2 أقسام مختلفة من 4 مناطق تشريحية متميزة في كل عينة.
- وكيل التباين التسريب
- تخدير الفئران باستخدام محلول التخدير.
- إجراء عملية استئصال البطن المتوسطة باستخدام شفرة مشرط رقم 15.
- كشف الشريان الأبهر البطني والوريد الكسي، بعد التراجع أفقيا الأمعاء الدقيقة واستخدام مقص الربيع.
- أدخل قسطرة من عيار 26 في الأبهر البطني وأخرى في الوريد الكُدفي في نفس الاتجاه.
- القسطرة الآمنة في مكان باستخدام خياطة الحرير 5/0 لإجراء خياطة البقاء.
- غسل نظام الأوعية الدموية مع محلول ملحي 37 درجة مئوية تحتوي على الهيبارين (500 وحدة / 100 مل) دفعت في الشريان الأبهر البطني باستخدام حقنة 10 مل. استمر في التسريب اللطيف حتى يُرى حل واضح يخرج من القسطرة الموضوعة داخل الوريد الكُدَي.
ملاحظة: عادة ما تكون هناك حاجة إلى 30 إلى 40 مل من محلول ملحي مملح مُعَرَّب لشطف نظام الأوعية الدموية للجرذ البالغ. - إدارة خليط من الأدينوزين (1 ملغ / لتر) وبابافيرين (4 ملغ / لتر) لمدة 2 دقيقة.
- حقن في القسطرة الأبهرية 10 مل من خليط من كبريتات الباريوم 50٪ و الجيلاتين 5٪.
ملاحظة: يجب الاحتفاظ بالحل عند 60 درجة مئوية لتجنب سماكة. - ترك الفئران في - 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعة على الأقل، من أجل السماح يلقي الأوعية الدموية لتترسخ.
- إزالة الجلد من الجزء السفلي من الجسم من كل ماوس.
- ديافونيأيشن - تقنية سالتهولز
- إصلاح الفئران عن طريق الغمر في محلول الفورمالديهايد 10٪ لمدة 72 ساعة على الأقل.
- تبييض الفئران عن طريق الغمر في محلول بيروكسيد الهيدروجين 30٪ لمدة 24 ساعة.
- تجفيف الفئران باستخدام تقنية استبدال التجميد. تتكون هذه المنهجية من تقديم الفئران إلى الممرات المتعاقبة (في المتوسط أربعة) من الأسيتون النقي في - 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لكل منهما.
- توضيح الفئران عن طريق غمرها في حل يحتوي على خليط من بنزوات البنزيل 100٪ و 100٪ من الساليسيلات الميثيل في نسبة 3:5 (ويعرف هذا الخليط أيضا باسم حل Spalteholz) 13.
- ترك الفئران مغمورة في الحل Spalteholz داخل في غرفة فراغ حتى يصبح diaphanous، والذي عادة ما يستغرق 5 إلى 7 أيام.
- استبدال الحل، إذا أصبح الظلام قبل أن تصبح العينة واضحة.
- تقدير كمية السفن الجانبية
- مراقبة الفئران علقت في حل Spalteholz تحت الإضاءة باستخدام مجهر مجسم. استخدام ملقط الجراحة المجهرية لفهم بلطف وتحريكه.
- تصوير الأطراف بأكملها باستخدام كاميرا رقمية متصلة بالمجهر.
- الحصول على صور الأطراف بأكملها باستخدام البرنامج المناسب.
- إجراء تجزئة يدوية للسفن الجانبية من خلال تسليط الضوء عليها باستخدام البرامج المناسبة.
ملاحظة: يتم تعريف الأوعية الجانبية وفقا لتعريف لونغلاند، الجذعية المحددة، ومنتصف المنطقة، والوافد يناح مرة أخرى، مع قطر يتراوح بين 20 و 300 ميكرومتر، باستثناء الشرايين الفخذية والسافينوية والبوبليتيال وجميع الهياكل الوريدية. - قم بتعريف ROIs في كل ماوس في نفس المنطقة التشريحية في المُتَوَكِّب، المحيط وتحت الانسداد الجراحي.
- تحديد كثافة الأوعية الجانبية (CVD) في ما يعادل ROIs المقابلة لـ 20% من إجمالي مساحة الأطراف. يتم حساب CVD كنسبة بين منطقة الأوعية الدموية ومناطق ROIs. يتم تنفيذ كافة قياسات الكثافة باستخدام برنامج ImageJ.
ملاحظة: من المفترض أن تكون قيمة CVD للأطراف غير الإقفارية لكل فأرة متوافقة مع 100% لاستبعاد الاختلافات في إجراءات التشريح أو التسريب أو التسريب. وبالتالي، كانت النسبة المئوية للـ CVD في الطرف الإقفاري محسوبة بالنسبة إلى الشخص غير الإقفاري. - تحديد النسبة المئوية لزيادة CVD كالفرق بين نسبة CVD بين الأطراف الإقفارية وغير الإقفارية.
- التقاط الليزر microdissection من الشعيرات الدموية
- بعد التخدير، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
- لحصاد العضلات المعدية المعدية لكلا الساقين، وإزالة الجلد من الفئران على حد سواء الأطراف الخلفية.
- حدد وتر أخيل وفصل الوتر عن العظام باستخدام مشرط 11 شفرة.
- عقد وتر أخيل وفصل العضلات من الساق والفيبولا حتى مفصل الركبة مع مقص الربيع.
- فصل العضلة ذات الرأسين femoris من العضلات المعدة.
- استخدام مقص الربيع لقطع الإدراج من العضلات المعدية في الركبة على مستوى مفصل الركبة.
- ضع عضلات الجهاز الهضمي المقطوعة في اتجاه عرضي على قرص فلين صغير بمساعدة 10٪ تراغاكانث.
- المفاجئة تجميد العينات في isopentane السائلة المبردة النيتروجين وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تقسيم.
- قطع على cryostat 12 أقسام ميكرومتر من عينات العضلات وجبل على الشرائح الزجاجية.
ملاحظة: لحماية RNA تأخذ شريحة تبريدها مسبقا ولمس الجانب الخلفي من الشريحة بإصبعك (قفازات) لتدفئة المنطقة فقط لوضع القسم. نقل القسم من سكين cryostat عن طريق لمس مع منطقة دافئة وجافة في -20 درجة مئوية في cryostat لمدة 2-3 دقيقة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.- إصلاح الشرائح الزجاجية في زجاجة تحتوي على الأسيتون النقي المبرد (حوالي 50 مل) لمدة 5 دقائق عند -20 درجة مئوية وتجفيف الهواء لهم.
- استخدام القلم الكاره للماء حول الأقسام.
ملاحظة: يساعد استخدام القلم الكاره للماء في تقليل مقدار الحلول التي تم إنفاقها أثناء البروتوكول. لجميع الحضانة استخدام 100 € L من جميع الحلول، لكل قسم. - إعادة ترطيب مع 2 M NaCl / PBS في 4 درجة مئوية واحتضان العينات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع المضادة للCD31 الفئران الأجسام المضادة أحادية النسيلة في 1:500 في 2M NaCl / PBS.
- غسل مرتين في 2M NaCl / PBS لما مجموعه 6 دقائق.
- إضافة أرنب ثانوي مضاد للفئران IgG في 1:200 في 2M NaCl /PBS و 5٪ مصل الأرنب لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
- غسل في 2 M NaCl / PBS كما كان من قبل وإضافة المسمى مجمع بيروكسيداز أفيديدات المترافق avidin لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- شطف وإضافة DAB بيروكسيداز الركيزة عدة لمدة 5 دقائق.
- تجفيف المقاطع في الجليد البارد90٪ الإيثانول تليها 100٪ الإيثانول وتركها لتجف.
- تشريح 10 000 الشعيرات الدموية لكل الفئران باستخدام نظام microdissection الليزر مجهزة بالليزر نبضت الحالة الصلبة 355 نانومتر الليزر والمنجنيق الشعيرات الدموية تشريح في أنبوب microfuge لاصقة كاب.
- استخراج الحمض النووي الريبي، تخليق cDNA، ما قبل التضخيم، وRT-PCR
- عزل الجيش الملكي النيبالي الكلي من الشعيرات الدموية microdissected باستخدام مجموعة مناسبة، ومجموع الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بين 1.5-3 نانوغرام / ميكرولتر.
- استخدام مجموعة توليف cDNA للتوليف وجولتين من ما قبل التضخيم، وذلك باستخدام المواد التمهيدية الموصوفة في الجدول1.
- تنفيذ RT-PCR لنفس الأهداف الموضحة في الخطوة السابقة. استخدام برنامج يتكون من خطوة denaturation الأولية في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 50 دورات في 95 درجة مئوية لمدة 15 ق و60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام البروتوكول الموصوف، تم اختبار الخلايا الجذعية mesenchymal الحبل السري والإشعاع المؤين جرعة منخفضة (LDIR) كعلاجات الأوعية المفترضة 11،12. تم الحصول على قراءات التسريب دوبلر الليزر قبل الحث نقص التروية وفي نقاط زمنية محددة مسبقا تتراوح من مباشرة بعد الحث نقص التروية إلى 45 يوما بعد نقص التروية. تم تسجيل قراءات التسريب الأنسجة بواسطة دوبلر الليزر كصور مرمزة بالألوان، مع عدم عرض التسريب باللون الأزرق الداكن وأعلى مستوى التسريب المعروض باللون الأحمر. كما هو مبين في الشكلين 2ألف و 3A وكميا في الشكلين 2B و 3B، لوحظ فقدان كامل من التسريب الخلفي في جميع الفئران مباشرة بعد الحث على نقص التروية الخلفية ، وضمان استنساخ تقنية لتحريض نقص التروية الخلفية. الأهم من ذلك ، فإن شدة نقص التروية مماثلة في جميع الحيوانات. تم رسم عائد الاستثمار حول الطرف الخلفي الإقفاري وتم رسم عائد استثمار مماثل حول الطرف الخلفي غير الإقفاري لإجراء التحديد الكمي للتسريب. يتم التعبير عن التسريب كنسبة من التسريب في الطرف الإقفاري إلى ذلك في الطرف غير الإقفاري. وتقاس التغيرات في نسبة التسريب مع مرور الوقت.
أجريت الكيمياء المناعية بين 15 و 90 يوما بعد نقص التروية. تم إجراء الاستئصال بين 19 و 90 يوما بعد نقص التروية وmicrodissection الشعرية بين 45- و 70 يوما بعد نقص التروية الحث ضمان أن العلاجات المختلفة المؤيدة للأوعية تسبب تأثير مسير وعائي مستمر وطويل الأمد.
تقييم القياس الكمي للشعيرات الدموية إيجابية CD31 في الأقسام النسيجية من العضلات المعدية وتقييم الكثافة الشعرية، وأعرب عن هذا كعدد من الشعيرات الدموية لكل عدد من ألياف العضلات. كما هو مبين في الشكل 4، كانت الكثافة الشعرية أكبر في الإقفاري مقابل الطرف غير الإقفاري.
ومن أجل تقييم كثافة الأوعية الجانبية، تم تشويه مستوى الفئران، وتم اختيار عائد استثمار مكافئ، يعادل 20 في المائة من مساحة الأطراف، من أجل التحديد الكمي. زيادة كثافة الأوعية الجانبية باستمرار في الطرف الإقفاري، لذلك تم التعبير عن البيانات المتعلقة بأطراف المعالجة والسيطرة كنسبة مئوية من زيادة كثافة الأوعية الجانبية في الطرف الإقفاري نسبيا ً إلى الطرف غير الإقفاري (الشكل5) ).
تم تحليل التعبير عن الجينات المؤيدة للأوعية من قبل ECs من قبل RT-PCR الكمية من الخلايا الإيجابية CD31. وأظهرت نسخ لVegfr2، Vegfr1، Fgf2، Angpt2، Pdgfc، Tgfb2، Hgf، وميت تباين واضح في التعبير بين الأطراف الإقفارية وغير الإقفارية، حصرا في الفئران المعرضة للتحفيز المؤيدة للأوعية (الشكل6).
الشكل 1 رسم تخطيطي لتشريح الأوعية الدموية الخلفية للفأر ة يظهر مواقع الربط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 LDIR يزيد من انتعاش التسريب. بعد الحث الجراحي من قبل واحد HLI، كل من الأطراف الخلفية من الفئران C57BL/6 كانت الشام المشععة أو المشععة مع أربعة كسور يوميا من 0.3Gy، في أيام متتالية، ويسمح للتعافي. (أ) صور تدفق دوبلر الليزرية التمثيلية قبل HLI، وفي اليومين 0 (د0) و15 (د15) ما بعد HLI التعريفي. (ب) أظهر التقييم الكمي لتدفق الدم معبراً عنه كنسبة من مركز الدراسات الدولية إلى أطراف هُجِّل من الـ "آي إس آي" زيادة كبيرة في ضخ دم الأطراف في الفئران المشععة مقابل الفئران المشععة بالشام في اليومين 15 (د15) و45 (د45) بعد مؤشر نقص المناعة البشرية. تم تقييم التغيرات بين المجموعات من خلال قياسات متكررة في اتجاهين ANOVA تليها اختبار بونفيرونى بعد الفحص (n = 12 فأرلكل مجموعة). يتم عرض الوسائل ± SEM. P < 0.001; ns، غير مهم. HLI, نقص تروية الطرف الخلفي; ISC, نقص تروية; جهاز الأمن والمخابرات الوطني، غير إقفاري؛ ما قبل HLI، قبل نقص تروية الطرف الخلفي. تكييفها من 11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 الخلايا الجذعية mesenchymal الحبل السري (UCX): زيادة الانتعاش التسريب. UCX أو سيارتهم (كسيطرة) تدار في العضلات المعدية الإقفارية 5 ساعات بعد الحث HLI. (أ) صور تدفق دوبلر الليزر التمثيلي ة قبل (PRE-HLI)، مباشرة بعد (d0 POST-HLI) وفي 7 و14 و21 يوماً بعد توجيه HLI (d7 POST-HLI, d14 POST-HLI, d21 POST-HLI). (ب) أظهر التقييم الكمي لتدفق الدم معبراً عنه كنسبة من مركز الدراسات الدولية إلى أطراف هُجِّم من الـ "آي إس آي" أن ضخدم الأطراف في الخلايا الجذعية النخاعية للحبل السري - الفئران المعالجة في 7 و14 و21 يوماً بعد الارتفاع غير الليفي. (n = 16 لكل مجموعة تجريبية؛ D7: t (22.69) = 4.26؛ P - 0.001; وكان حجم تأثير 1.51 والطاقة 0.98؛ D14: t (30) = 4.7؛ P - 0.001; وكان حجم تأثير 1.66 والطاقة 0.99؛ D21: t (30) = 7.22؛ P - 0.001; وكان حجم تأثير 2.56 والطاقة 0.99). HLI, نقص تروية الطرف الخلفي; ISC, نقص تروية; جهاز الأمن والمخابرات الوطني، غير إقفاري. تكييفها من11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 يزيد LDIR الكثافة الشعرية. (أ) أقسام تمثيلية من العضلات المعدية الإقفارية الشام ية والمشعة في اليوم 45 بعد HLI. تم التعرف على الشعيرات الدموية والخلايا العضلية من قبل CD31 الكيمياء المناعية والهيماتوكسيلين، على التوالي. شريط مقياس، 150ملم (ب) كشف التحليل الكمي زيادة الكثافة الشعرية (الشعيرات الدموية / الخلية) في العضلات المعدية المعدية المشعة بالمقارنة مع تلك الإقفارية الشام المشعة في اليومين 15 و 45 بعد HLI. وقد أُجري اختبار "أنوفا" المختلط الذي أعقبه اختبار "بونفيروني" بعد الفحص الخاص بعامل داخل الموضوع لـ ISC وبين العوامل بين العوامل اليومية والإشعاعية (n=6 فئران لكل مجموعة). يتم عرض البيانات والوسائل الفردية ± SEM. P<0.001; ns، غير مهم. ISC, نقص تروية; جهاز الأمن والمخابرات الوطني، غير إقفاري. تكييفها من11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: LDIR يزيد من كثافة الضمانات. (أ) صور توضيحية لـ ROIs مختارة للفئران الأشعة تحت أشعة الشام والمشععة. وتظهر أطراف مركز الأمن العام وجهاز الأمن والمخابرات الوطني في اليوم 90 بعد اللجنة. شريط مقياس، 300ملم (ب) يتم تمثيل البيانات كنسبة مئوية من زيادة CVD من أطراف مركز الدولة الإسلامية نسبيا إلى واحد NISC. في اليومين 15 و 90 بعد HLI، قدمت الفئران المشعة زيادة أعلى بكثير CVD (٪) مقابل الفئران الشام المشعة. وقد أجريت ANOVA في اتجاهين تليها Bonferroni اختبار ما بعد مخصص مع بين العوامل موضوع اليوم والتشعيع (n = 6 الفئران لكل مجموعة). يتم عرض البيانات والوسائل الفردية ± SEM. *P<0.05; P<0.001; ns، غير مهم. HLI, نقص تروية الطرف الخلفي; ISC, نقص تروية; جهاز الأمن والمخابرات الوطني، غير إقفاري. تكييفها من11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 LDIR upregulat التعبير عن الجينات الوعائية في ECs معزولة عن العضلات المعدية المعدية المشعة. بعد الحث الجراحي من قبل واحد HLI، كل من الأطراف الخلفية من الفئران C57BL/6 كانت الشام المشععة أو المشععة مع أربعة كسور يوميا من 0.3Gy، في أيام متتالية، وسمح للتعافي. في اليوم 45 بعد HLI، تم تقييم التعبير عن العوامل المؤيدة للأوعية ومستقبلاتها من قبل qRT-PCR حصرا على ECs. كانت أجزاء العضلات المعدية ملطخة CD31. تم تصور خلايا CD31+ البطانية الفردية، وتشريحها، وعزلها باستخدام نظام تشريح الليزر. يمثل كل شريط التعبير الجيني النسبي في أحد الحيوانات. وتمثل القضبان البيضاء والرمادية الفئران الأشعة الشامية والمشععة، على التوالي. تم تطبيع القيم إلى 18S للحصول على مستويات التعبير النسبي. وأظهرت النتائج المعرب عنها بوصفها تغيرات قابلة للطي log2 بين العينات الإقفارية وغير الإقفارية الوفرة النسبية للنصوص في الفئران المشععة؛ في المقابل، لوحظ انخفاض التنظيم في الفئران الشام المشعة. تكييفها من11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| Vegfr1_F (5'-TTGAGGAGCTTTCACCGAACTCCA-3')؛ |
| Vegfr1_R (5'-TATCTTCATGGGCCTTGGGCTT-3'); |
| Vegfr2_F (5'-AGGCCCATTGAGTCACACACA-3')؛ |
| Vegfr2_R (5'-AGACCATGTGTGTGTGTTTCTCCA-3')؛ |
| Pdgf-c_F (5'-ATGCCACAAGTCACAACCACG-3'); |
| Pdgf-c_R (5'-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3')؛ |
| التقى_F (5'-ACGTTGAAATGCGTGTGTGTCCC-3')؛ |
| التقى_R (5'-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTGTGA-3')؛ |
| Fgf2_F (5'-ACTCCAGTGTGTGTGTGTCACT-3')؛ |
| Fgf2_R (5'-AACAGTGTGCCTTTTGTGGT-3'); |
| Tgfb2_F (5'-GCTTTGGATGCGGCCTTTT-3'); |
| Tgfb2_R (5'-CTCCAGCACAGAAGTGtGTCATT-3')؛ |
| Ang2_F (5'-ATCCAACACCGAGAAGGTAGCAGT-3')؛ |
| Ang2_R (5'-AACTCATCGCCGCCAGTACT-3'); |
| Hgf_F (5'-GCATTCAAGGCAAGGAAGGGTT-3')؛ |
| Hgf_R (5'-TCATGCGTGTGTGTACTGCGAA-3')؛ |
| 18s_F (5'-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3'); |
| 18s_R (5'-CCGGAATCGAACCCTGATT-3'). |
الجدول 1: المواد التمهيدية المستخدمة في الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تألفت نماذج Murine من CLI في الغالب في ربط الشريان الفخذي فقط القاصي إلى أصل profunda femoris 4,5,6,7,8,9. وقد تبين أن هذا ترك معظم الدورة الدموية الجانبية سليمة، مما يعيد تدفق الدم إلى الطرف في غضون 7 أيام 9. يمكن إزالة السرير الجانبي عن طريق استئصال الشريان الفخذي. ومع ذلك، يمكن استعادة ما يصل إلى ثلث تدفق الدم الأصلي في أقرب وقت 7 أيام بعد الإجراء، نظرا لأن معظم الأوعية الجانبية تنشأ من الشريان الحرقفي الداخلي 7. وقد اقترح Lejay وآخرون الأربطة المتسلسلة مع الربط الثاني الذي يتم تنفيذه على الشريان الحرقفي المشترك، مما يقلل بشكل فعال من التسريب الجانبي الذي يوفره الشريان الحرقفي الداخلي 4. وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول ليس فقط تحديد الشريان الحرقفي الخارجي فقط فوق الرباط الأربي، ولكن أيضا ربط وختان الشرايين والأوردة الحرقفية الخارجية البعيدة، والتي تخدم غرضا مزدوجا: إلى زيادة شدة نقص التروية وكذلك لتحسين التكرار التقني للنموذج، كما التعرض للشريان الفخذي وحده غالبا ما يؤدي إلى تمزيق الوريد.
أحد قيود هذه التقنية هو الانقطاع الحاد لتدفق الدم إلى الطرف، والذي يختلف عن العملية المطولة المرتبطة بتراكم البلاك التصلب الشراييني الذي يؤدي إلى تضيق الشرايين وانسدادها. ومع ذلك ، كان الحد من تدفق الدم موجودا جيدا بعد 2 أسابيع ، ونقطة زمنية ثابتة لتشخيص نقص التروية المزمن. أيضا، تم زيادة الضمانات مع إهانة نقص الإقفارية وحدها، والتي تحاكي عملية تشكيل الضمانات لوحظ تلوحظ في الأطراف الإقفارية المزمنة.
الأوعية الدموية الجديدة للأطراف الإقفارية ينطوي على تفاعل معقد من الأحداث البيولوجية، وهي تكوين الأوعية الدموية وتكوين الشريان. يتضمن هذا البروتوكول مجموعة متنوعة من الاختبارات التي قيمت تداخل العلاجات الوعائية المفترضة على الانبت الوعائي (كثافة الأوعية الشعرية) وتطوير الأوعية الجانبية (تكوين الشرياني)، وهي أهم آلية في التسامح البشري إلى نقص تروية الطرف السفلي. في الوقت نفسه، يتم استخدام دوبلر الليزر للكشف عن وظيفة هذه السفن الجديدة أو الموسعة، ولأول مرة يتم استخدام قسم الليزر microdissection من الشعيرات الدموية لجمع ECs الكشف عن الآليات الجزيئية التي تكمن وراء الانتعاش الوظيفي. ينتج عن هذا البروتوكول نموذج حيواني قابل للاستنساخ يمكن أن يحاكي آثار CLI معيار الاختبار عندما يتم علاج الحيوانات مع العلاجات الوعائية المحتملة التي يمكن تطبيقها في سياق سريري في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونشكر خوسيه رينو وتانيا كارفالهو، رئيسي مرفق التصوير البيولوجي ومختبر علم الأنسجة وعلم الأمراض المقارنة التابع لمعهد الطب الجزيئي جواو لوبو أنتونس، على التوالي. ونشكر أيضا فياتشيسلاف سوشيك من قسم التشريح في كلية نوفا الطبية/فاكولادي دي سيانسياس ميديكاس، جامعة نوفا دي ليسبوا.
مرجع التمويل: مشروع ممول من UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia. وتدعم بولا دي أوليفيرا زمالة (SFRH/BD/80483/2011) من مؤسسة المأكولات الخاصة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
