تقييم تكوين الأوعية العلاجية في نموذج مورين من نقص التروية الخلفية
Summary
هنا، يتم تقديم نموذج تجريبي نقص التروية الخلفية الحرجة تليها بطارية من الاختبارات الوظيفية والأنسجة والجزيئية لتقييم فعالية العلاجات الوعائية.
Abstract
نقص تروية الأطراف الحرجة (CLI) هو حالة خطيرة تنطوي على مخاطر عالية من بتر الأطراف السفلية. على الرغم من إعادة الأوعية الدموية كونها العلاج الذهب القياسية، وعدد كبير من المرضى CLI ليست مناسبة لإعادة الأوعية الدموية الجراحية أو داخل الأوعية الدموية. تظهر العلاجات الوعائية كخيار لهؤلاء المرضى ولكنلا حاليا قيد التحقيق. قبل التطبيق في البشر، يجب اختبار هذه العلاجات في النماذج الحيوانية ويجب أن تكون آلياتها مفهومة بوضوح. وقد تم تطوير نموذج حيواني من نقص التروية الخلفية (HLI) عن طريق ربط وختان الشرايين والأوردة الحرقفية الخارجية البعيدة في الفئران. تم تجميع فريق شامل من الاختبارات لتقييم آثار نقص التروية والعلاجات الوعائية المفترضة على المستويات الوظيفية والأنسجة والجزيئية. تم استخدام دوبلر الليزر لقياس التدفق والتقييم الوظيفي للتسريب. تم تقييم استجابة الأنسجة من خلال تحليل الكثافة الشعرية بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة CD31 على المقاطع النسيجية من العضلات المعدية وعن طريق قياس كثافة الأوعية الجانبية بعد diaphonization. تم تحديد التعبير عن الجينات الوعائية من قبل RT-PCR التي تستهدف عوامل وعائية مختارة حصرا في الخلايا البطانية (ECs) بعد التقاط الليزر microdissection من العضلات الجهاز الهضمي الفئران. وكانت هذه الأساليب حساسة في تحديد الاختلافات بين الأطراف الإقفارية وغير الإقفارية وبين الأطراف المعالجة والأطراف غير المعالجة. ويوفر هذا البروتوكول نموذجاً للنسخ من CLI وإطاراً لاختبار العلاجات الوعائية.
Introduction
يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD) في الغالب على الأطراف السفلية. يحدث مرض التصلب المتعدد بسبب تصلب الشرايين، وهو انسداد في الشريان يمكن أن يسبب تقييدًا شديدًا لتدفق الدم في الأطراف السفلية1. العرج المتقطع هو أول مظهر من مظاهر PAD ويشير إلى ألم العضلات عند المشي. CLI هي المرحلة الأكثر شدة من PAD، ويجري تشخيصها في المرضى التي تظهر آلام الراحة الإقفارية، والقرحة أو الغرغرينا2. المرضى الذين يعانون من CLI لديهم خطر كبير من بتر، وخاصة إذا لم يعالج3. إعادة الأوعية الدموية في الأطراف السفلية (إما عن طريق الجراحة المفتوحة أو إجراء داخل الأوعية الدموية) هي حاليا الطريقة الوحيدة لتحقيق إنقاذ الأطراف. ومع ذلك، فإن حوالي 30٪ من مرضى CLI غير مناسبين لهذه الإجراءات، لأسباب تشمل موقع الآفات، ونمط انسداد الشرايين والاعتلال المشترك واسعة النطاق4،5. لذلك، هناك حاجة إلى علاجات جديدة لهؤلاء المرضى الذين لا يمكن علاجهم، مع تعزيز تكوين الأوعية الدموية هي الاستراتيجية تحت تحقيق أكثر كثافة.
قبل الاختبار في البشر، يجب النظر في فعالية وسلامة العلاجات الجديدة في الجسم الحي في النماذج الحيوانية. وقد وضعت عدة نماذج لدراسة CLI, في الغالب عن طريق تحفيز نقص التروية الخلفية (HLI) في الفئران6,7,8,9,10. ومع ذلك، فإن هذه النماذج تختلف في عدة جوانب بما في ذلك طبيعة الشرايين التي يتم ربطها و / أو مقتطعة وما إذا كانت الأوردة والأعصاب المحيطة بها يتم تشريحها وكذلك6،7،8، 9،10. إذا ما أخذت هذه الجوانب مجتمعة، سوف تؤثر على شدة إصابة نقص التروية-التسريب في كل الحيوان، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج. ولذلك، من الأهمية بمكان وضع بروتوكول فعال ينبغي فيه توحيد إجراء الحث على نقص التروية وتقييم مختلف الأهداف لتقييم ما إذا كان العلاج الوعائي المعطى سيكون فعالاً. ومن شأن بروتوكول تجريبي مصمم لتغطية جميع هذه الجوانب أن يوفر فهما شاملا للآليات التي تمارس بها العلاجات الوعائية آثارها ومقياسا لفعاليتها في كل من نتائجها. عملين متميزين نشرمؤخرا من قبل فريقنا هي مثال جيد11،12، التي تم فيها تقييم نهج مختلفة للحث على تكوين الأوعية العلاجية باستخدام نفس البروتوكول الذي سيتم وصفه بمزيد من التفصيل في هذا البروتوكول.
الهدف العام لهذا البروتوكول هو وصف نموذج تجريبي قابل للاستنساخ يمكن أن يحاكي آثار CLI ويضع الأساس التجريبي لتقييم شامل للآثار الوظيفية والأنسجة والجزيئية للأوعية المفترضة وكلاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تألفت نماذج Murine من CLI في الغالب في ربط الشريان الفخذي فقط القاصي إلى أصل profunda femoris 4,5,6,7,8,9. وقد تبين أن هذا ترك معظم الدورة الدموية الجانبية سليمة، مما يعيد تدفق الدم …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر خوسيه رينو وتانيا كارفالهو، رئيسي مرفق التصوير البيولوجي ومختبر علم الأنسجة وعلم الأمراض المقارنة التابع لمعهد الطب الجزيئي جواو لوبو أنتونس، على التوالي. ونشكر أيضا فياتشيسلاف سوشيك من قسم التشريح في كلية نوفا الطبية/فاكولادي دي سيانسياس ميديكاس، جامعة نوفا دي ليسبوا.
مرجع التمويل: مشروع ممول من UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia. وتدعم بولا دي أوليفيرا زمالة (SFRH/BD/80483/2011) من مؤسسة المأكولات الخاصة.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
