Summary
כאן, המודל הניסיוני הטיפולי איסכמיה מוצג ואחריו סוללה של פונקציונלי, בדיקות היסטולוגית ומולקולרית כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים אנגיוגנטית.
Abstract
איסכמיה גפה קריטית (CLI) היא מצב חמור הכרוך בסיכון גבוה לקטיעה בגפיים התחתונות. למרות revascularization להיות טיפול בתקן זהב, מספר ניכר של מטופלים CLI אינם מתאימים או ניתוחי וכירורגי או אנדוסקולריזציה. טיפולים מגנטיים מתפתחים כאופציה למטופלים אלה, אך כיום הם עדיין תחת חקירה. לפני היישום בבני אדם, הטיפולים האלה חייבים להיבדק במודלים של בעלי חיים והמנגנון שלו חייב להיות מובן בבירור. מודל בעל חיים של איסכמיה הגוף (HLI) פותחה על ידי החיבור וכריתה של עורקי הירך החיצוניים ואת הוורידים ורידים בעכברים. פאנל מקיף של מבחנים התאספו כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול באיסכמיה ובטיפולים אנגיוגנטיים בתוך הפונקציונליות, היסטולוגית ורמות מולקולריות. לייזר דופלר שימש למדידת הזרימה והערכה פונקציונלית של perfusion. תגובת רקמות הוערך על ידי ניתוח של צפיפות נימי לאחר הצביעת עם הנוגדן anti-CD31 על סעיפים היסטולוגית של שריר השריר, ועל ידי מדידה של צפיפות כלי הקיבול הנלווה לאחר דיאפחונזציה. ביטוי של הגנים של אנגיוגנטית היה ככמת על ידי RT-PCR מיקוד גורמים מבוססי אנגיוגנטיים שנבחרו באופן בלעדי בתאי האנדותל (ECs) לאחר לכידת לייזר הניתוח של שרירי השרירים של העכבר. שיטות אלו היו רגישות בזיהוי הבדלים בין האיברים האיסכמי והלא-איסכמי ובין הגפיים הבלתי מטופלות. פרוטוקול זה מספק מודל מחודש של CLI ומסגרת לבדיקת טיפולים אנגיוגנטיים.
Introduction
מחלת עורקים היקפית (PAD) משפיעה בעיקר על הגפיים התחתונות. PAD נגרמת על ידי טרשת עורקים, חסם עורק שיכול לגרום להגבלה חמורה לזרימת הדם בגפיים התחתונות1. התפטרות לסירוגין הוא הביטוי הראשון של PAD ומתייחס כאב שרירים בעת הליכה. CLI הוא השלב החמור ביותר של PAD, להיות מאובחנים בחולים כי להראות כאבים מנוחה איסכמי, כיבים או נמק2. חולים עם CLI יש סיכון גבוה של קטיעה, במיוחד אם לא מטופל3. הגפיים התחתונות revascularization (או על ידי ניתוח פתוח או הליך אנדוכלי) היא כרגע הדרך היחידה להשיג הצלה איבר. עם זאת, בסביבות 30% מהחולים CLI אינם מתאימים הליכים אלה, מסיבות הכוללות את המיקום של נגעים, התבנית של סגר עורקים והיקף תחלואה נרחבת4,5. לכן, טיפולים חדשים נחוצים עבור אלה חולים שאינם ניתן לטיפול במקרים אחרים, עם קידום האנגיוגנזה להיות האסטרטגיה תחת חקירה אינטנסיבית יותר.
לפני בדיקה בבני אדם, את היעילות והבטיחות של טיפולים חדשים בvivo יש לשקול בדגמי חיות. מספר דגמים פותחו למחקר של CLI, בעיקר על ידי גרימת איסכמיה הגפיים האחרונות (hli) בעכברים6,7,8,9,10. עם זאת, מודלים אלה נבדלים במספר היבטים, כולל טבעו של העורקים המגורטים ו/או מרוטרים והאם הורידים והעצבים שמסביב מושלכות גם כן6,7,8, 9,10. יחד, היבטים אלה ישפיעו על חומרת הפציעה של איסכמיה-reperfusion בכל חיה, מה שהופך את התוצאות קשה להשוואה. לכן, זה קריטי לפתח פרוטוקול אפקטיבי שבו ההליך לגרום איסכמיה והערכה של מטרות שונות צריך להיות מתוקננת כדי להעריך אם טיפול אנגיוגנטי מסוים יהיה יעיל. פרוטוקול ניסיוני שנועד לכסות את כל ההיבטים הללו יספק הבנה מקיפה של המנגנונים שבהם טיפולים אנגיוגנטיים מפעילים את השפעתם ומידת יעילותם בכל אחת מהתוצאות. שתי יצירות נפרדות שפורסמו לאחרונה על ידי הצוות שלנו הם דוגמה טובה11,12, שבו גישות שונות כדי לגרום לאנגיוגנזה הטיפולית העריכו באמצעות אותו פרוטוקול אשר יתואר עם פרטים נוספים ב פרוטוקול.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר מודל ניסיוני הניתן לחיקוי שיכול לחקות את ההשפעות של CLI ולהטיל את הבסיס הניסיוני להערכה מקיפה של ההשפעות תפקודית, היסטולוגית ומולקולרית של אנגיוגנטי. סוכנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכים בעלי חיים הם בהתאם הוראה 2010/63/האיחוד האירופי אושרה על ידי גוף בעלי חיים מוסדיים רווחה ומורשה על ידי DGAV הרשות המוסמכת פורטוגזית להגנת בעלי חיים (רישיון מספר 023861/2013)
התראה: חלק מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקולים רעילים ומזיקים. אנא השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים וציוד הגנה אישי (כפפות, חלוק מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעלי הבוהן סגורות)
1. המודל המורין של איסכמיה החוצה
הערה: כל הניסויים מתבצעים ב-22 שבועות בן C57BL/6 עכברים נקבה.
- הכנת פתרונות
-
הכנת תמיסת הרדמה
הערה: שילוב זה הרדמה (medetomidine ו קטמין) מספק עד 30 דקות השתק וחלון כירורגי של 15 דקות. האפקט ניתן להחזירה על ידי הממשל של אטיפיאזול.- עם נקי, 1cc מזרק, משיכת 1 מ ל של medetomidine (1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף), לחסל בועות אוויר עבור מדידות מדויקות, ולהוסיף אותו לצינור 15 מ"ל פלקון.
- עם נקי, 1 cc מזרק, משיכת 0.75 mL של קטמין (75 mg/ק"ג משקל הגוף), לחסל בועות אוויר למדידות מדויקות ולהוסיף אותו לצינור 15 מ ל פלקון המכיל את medetomidine.
- הוסף 8.25 mL של תמיסת מלח סטרילי (0.9% הנאגל), על מנת לקבל 10 מ ל של פתרון הרדמה.
- זהה את הצינורית עם שם התרכובות, התאריך המעורב ותאריך התפוגה.
- חנות בחשכה ב -4 ° c.
-
הכנת התמיסה נגד הרגעה
- עם נקי, 1 cc מזרק, משיכת 1 מ ל של atipamezole (5 מ"ג/ק"ג משקל הגוף), לחסל בועות אוויר למדידות מדויקות, ולהוסיף אותו לצינור 15 מ"ל פלקון.
- הוסף 9 מ ל של תמיסת מלח סטרילי (0.9% הנאגל), כדי להשיג 10 מ ל של פתרון מחדש של הגרסה.
- זהה את הצינורית עם שם התרכובות, התאריך המעורב ותאריך התפוגה.
- חנות בחשכה ב -4 ° c.
-
הכנת תמיסת כאבים שלאחר הניתוח
- עם נקי, 1 cc מזרק, משיכת 0.5 mL של בופרנורפין (100 μl/15-30 גרם משקל הגוף), לחסל בועות אוויר למדידות מדויקות, ולהוסיף אותו לצינור 15 מ"ל פלקון.
- הוסף 9.5 mL של תמיסת מלח סטרילי (0.9% הנאגל), כדי להשיג 10 מ ל של פתרון כאבים.
- זהה את הצינורית עם שם התרכובות, התאריך המעורב ותאריך התפוגה.
- חנות בחשכה ב -4 ° c.
-
הכנת תמיסת הרדמה
- אינדוקציה כירורגית של איסכמיה הגוף
- כלים כירורגיים הדרושים להתערבות זו: מלקחיים מחודדים, מספריים קפיץ, מחזיק מחט אופטלמולוגית, מספריים כירורגיים ומחזיק מחט. לחטא את כל הכלים כירורגי בתוך החיטוי לפני השימוש. השתמש בדגימות כותנה. לניתוח של שומן תת עורי
- טען את המזרק עם פתרון ההרדמה לפני החזקת העכבר.
- לרסן את החיה על ידי הפעלת כוח מאחורי אוזניו נגד רשת של הכלוב, החזקת העור ככל האפשר כדי לשמור על העכבר משותק.
- השאר את החיה מוטה בראשה מופחת ולבצע הזרקה תוך הצפק של פתרון ההרדמה, לשמור את המזרק בזווית 45 ° עם הגוף של העכבר.
- לבדוק את העדר רפלקסים נסיגה פדלים, כדי להעריך את עומק ההרדמה.
- הסירו את השיער מהגפיים הימני בעזרת מכונת גילוח חשמלית. השתמש בפילינג סבון מחטא כלורקסאידין להכנת העור. השתמש במגבת נייר נקייה כדי להסיר את הקצף. החל לשפשף ניתוחי כלורהקאידין ולהגן על אזור העור עם כעטוף סטרילי לפני הובלת העכברים לסוויטה סטרילי כירורגי.
- הניחו את החיה בעלי הרגליים ועצרו אותו עם ארבעת הגפיים מפוזרים ומאובטחים בנייר דבק.
התראה: בצע את ההליך על משטח מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים יציב; ההליך הכירורגי מבוצע באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה בהגדלה של 10x או 20x. - להחיל פתרון חיטוי כלורהקאידין באמצעות גזה סטרילית כדי לסיים את ההכנה לעור. באמצעות מספר 11 להב אזמל כירורגי לבצע חתך העור 1 ס מ על הירך של הגפיים הימני הנכון.
- שומן תת-עורית חושף. את צרור הנוירונימי באמצעות המלקחיים המחודד, מספריים האביב ומחזיק המחט האופטלמולוגי, פתחו את מעטפת הירך הקרומי-זנב כדי לחשוף את כלי הירך החיצוניים.
- לנתח ולהפריד את כלי הקיבול (עורק והווריד) מן העצב. באמצעות 7.0 בלתי נספג פוליפרופילן תפר את העורק החיצוני והווריד ועורק הירך המרוחק והווריד.
- מעבר לקטע של עורק הירך והורידים בין הקשר המרוחק והאבותיים עם מספריים המעיין.
- סגרו את החתך בתפרים נספגים (למשל, 5.0 ויקאת תפר).
- טען את המזרק בתמיסה נגד הרגעה והשתמש באותה שיטה המפורטת ב1.2.3 ו1.2.4 לביצוע הזרקת הצפק תוך-הרדמה של התמיסה נגד ההרדמה.
- ניטור לאחר הניתוח
הערה: בעלי חיים נצפים בקפידה כל 15-20 דקות כדי לוודא שכל החיות להתאושש היטב מן האנטי הרגעה; חיות מורדם מעולם לא נותרו ללא השגחה.- להעריך את ההתאוששות מהרדמה: 1) לפקח על קצב ועומק של נשימה; 2) להעריך רפלקסים בעלי חיים (דוושה ומיקום העין)
- בצע הזרקה תת עורית של השככי כאבים שלאחר הניתוח כל 8-12 h.
- עקוב אחר בעלי החיים מדי יום לאחר הניתוח מקליט תיאור קצר של מצבו הבריאותי של בעל החיים ומראה אתר הניתוח, וודא שכל התפרים סגורים.
- , תפר מחדש את החתך. אם מתרחשת הדחיניות אם לא הצליחו, להחיל סרט מכשול העור על החתך כדי להגן מפני שתן, צואה הפרשות, חיכוך וגזירה של העור כדי לעזור לתהליך הריפוי.
2. הערכת אפקט האנגיוגנטי
הערה: לאחר האינדוקציה איסכמיה, להחיל את הסוכן התרפויטי במחקר ולהשיג את ההליכים הבאים. השלבים שבוצעו בזמן האחר מפורטים תחת הסעיף המתאים.
- הדמיית לייזר דופלר הדמיה
- הסירו את השיער משני הגפיים יום אחד לפני הניתוח באמצעות מכונת גילוח חשמלית ואחריה קרם להסרת שיער.
- שימוש בתמיסת ההרדמה.
- מניחים את החיה על משטח חימום 37 ° c עבור 5 דקות כדי להבטיח כי הטמפרטורה לא ישתנה במהלך ההליך
- מניחים את החיה במצב פרקדן עם הרגליים מאובטח בעמדה ממושכת. למדוד את המרחק בין רגליים ימין ושמאל רגליים לכל חיה, מאז מיקום החיה צריך להיות דומה בכל פעם שההליך חייב לחזור על מנת לעקוב אחר שינויים בפרזיה הגוף לאורך זמן.
- התחל לרכוש נתונים באמצעות לייזר דופלר האיפרזיה האננגר.
- לאחר הרכישה הושלמה, להחזיר את ההרדמה עם פתרון נגד הרגעה.
- פתח את תוכנת ניתוח התמונה ולצייר את האזור של עניין (ROI) סביב האיבר החוצה והוא התשואה המקבילה סביב הלא-איסכמי האיבר.
- שימו לב לערכי השטף וקבעו את הפרזיה כיחס של הפרזיה באיבר האיסכמי שאינו קשור לאיסכמי האיבר. שינויים ביחס הפרהיזיה נמדדים לאורך זמן.
- אימונוהיסטוכימיה, ניתוח צפיפות נימי
- לאחר ההרדמה, להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם.
- לקצור את שרירי הגקטמיאוס של שתי הרגליים, תחילה, הסירו את העור משני הגפיים האחוריות.
- לזהות את גיד אכילס ולהפריד את הגיד מהעצם בעזרת אזמל של 11 להב.
- להחזיק את גיד אכילס ולהפריד את השריר מן השוקה ואת הפיבולה עד מפרק הברך עם מספריים האביב.
- הפרד בין השרירים. משריר הגקטמיאוס
- להשתמש במספריים האביב כדי לחתוך את הוספות של שרירי הגקטמיוס ברמת מפרק הברך.
- הניחו את שרירי הגקטמיוס הקוצרים בכיוון רוחבי על דיסק שעם קטן בעזרת 10% tragacanth.
- הצמד להקפיא את הדגימות באיזופנטאן מקורר חנקן נוזלי ואחסן אותן ב-80 ° c עד שהוא מדבר.
- גזור 7 יקרומטר סעיפים של דגימות שריר על קריוסטט ועל הר על שקופיות זכוכית.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. - לתקן את שקופיות זכוכית בבקבוק המכיל אצטון טהור מקורר (כ 50 mL) עבור 10 דקות, ב-20 ° c.
- הוסף מימן peroxidase 0.3% מדולל מתנול (50 mL) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- כביסה פעמיים בתמיסת מלח באגירה (PBS) (50 mL) עבור סך של 10 דקות.
- השתמש בעט הידרופובי סביב הסעיפים.
הערה: השימוש בעט הידרופובי מאפשר להפחית את כמות הפתרונות שהושקע במהלך הפרוטוקול. עבור כל incubations להשתמש 100 μL של כל הפתרונות, לכל מקטע. - החלת פתרון חסימה של 5% סרום ארנב ב-PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- מעכלת את הדגימות עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם anti-CD31 החולדה מונובטיים נוגדן מדולל ב 1:500 1% בסרום שור (BSA) ב PBS.
- שטוף שלוש פעמים ב-PBS. לסכום של 30 דקות
- הוסף ארנב משני ביולוגי אנטי-עכברוש IgG נוגדן ב 1:200 בתוך 1% BSA ב PBS ו 5% סרום ארנב עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף ב-PBS כמו לפני ולהוסיף תווית avidin מperoxidase מורכבות עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3 פעמים ב-PBS עבור 5 דקות ולהוסיף diaminobenzidine (peroxidase) ערכת המצע לעוד 5 דקות.
- מנגד את הסעיפים עם המטאוקסילין עבור 10 s לפני הטעינה.
- למדוד את צפיפויות נימי באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד זקוף (כלומר, מספר נימים למספר של myocytes) ב 2 סעיפים שונים של 4 אזורים אנטומיים נפרדים בכל אחד מהדגימות.
- פרזיה של סוכן ניגודיות
- שימוש בתמיסת ההרדמה.
- בצע כריתת אונה חציון באמצעות להב מספר 15 של אזמל.
- לחשוף את אבי העורקים הבטן ואת ולבנה של caudal, לאחר שנסוג לאחר המעי הגס קטן באמצעות מספריים באביב.
- הכנס 1 26-למדוד קטטר בגולגולת לתוך אבי העורקים הבטן ועוד לתוך קאווה הבנה caudal באותו כיוון.
- מאובטח קטטרים במקום באמצעות תפר 5/0 משי לבצע תפר להישאר.
- שטוף את מערכת כלי הדם עם תמיסת מלוחים 37 ° c המכילה הפארין (500 יחידות/100 מ ל) דחף לתוך אבי העורקים בבטן באמצעות מזרק 10 מ"ל. המשיכו זלוף עדין עד פתרון ברור נראה יוצא מתוך הקטטר ממוקם בתוך הקורה הזנב caudal.
הערה: בדרך כלל 30 עד 40 מ"ל של פתרון מלוחים heparinized נדרשים לשטוף את מערכת כלי הדם של עכברוש מבוגר. - ניהול תערובת של אדנוזין (1 מ"ג/L) ו papaverine (4 מ"ג/L) עבור 2 דקות.
- הכנס לתוך קטטר אבי העורקים 10 מ ל של תערובת של 50% בריום סולפט ו 5% טין.
הערה: יש לשמור על הפתרון ב-60 ° צ' כדי להימנע מעיבוי. - השאירו את העכברים ב-4 ° c לפחות 4 h, על מנת לאפשר לשחקנים כלי הדם לגבש.
- להסיר את העור מהגוף התחתון של כל עכבר.
- דיאפהונזציה - טכניקת ספטהולץ
- לתקן את העכברים על ידי טבילה בפתרון פורמלדהיד 10% לפחות 72 h.
- אקונומיקה העכברים על ידי טבילה ב 30% חמצן מימן פתרון עבור 24 h.
- מייבשים את העכברים בטכניקת החלפת ההקפאה. מתודולוגיה זו מורכבת משליחת העכברים למעברים רצופים (בארבעה ממוצעים) של אצטון טהור ב-20 ° c עבור 24 שעות לכל אחד.
- הבהרת העכברים על-ידי היטבתן בתמיסה המכילה תערובת של 100% בנזיל בנזוסק ו-100% מתיל ביחס של 3:5 (תערובת זו ידועה גם כפתרון ספטיהולץ) 13.
- השאירו את העכברים שקועים בפתרון ספטהולץ בתוך תא ואקום עד שהוא הופך לדיאפ, אשר בדרך כלל לוקח 5 עד 7 ימים.
- החלף את הפתרון, אם הוא הופך כהה לפני הדגימה הופך להיות ברור.
- כלי כימות
- שימו לב לעכברים המושהים בתמיסת ספטהולץ באמצעות העברה באמצעות מיקרוסקופ סטריאוטקאלי. השתמש מלקחיים מיקרו ניתוח כדי לתפוס בעדינות להזיז אותו.
- לצלם את כל הגפיים באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ.
- להשיג תצלומים שלמים של הגפיים באמצעות התוכנה המתאימה.
- בצע פילוח ידני של כלי הקיבול הנלווה על-ידי הדגשת אותם באמצעות התוכנה המתאימה.
הערה: כלי הנלווה מוגדרים על פי הגדרתו של Longland, גזע מוגדר, אמצע האזור, ו-הנכנס מחדש, עם קוטר בין 20 ו 300 μm, למעט הירך, saphenous והעורקים popliteal ואת כל מבני הורידים. - הגדר ROIs בכל עכבר באותו אזור אנטומי ב adductor, סביב ומתחת לחסימה כירורגית.
- לכמת את צפיפות הכלי הנלווה (CVD) במקביל ROIs המתאים ל 20% מאזור הגפיים הכולל. ה-CVD מחושב כיחס בין אזור כלי הדם לבין אזורי ROIs. כל מדידות הדחיסות מתבצעות באמצעות תוכנת ImageJ.
הערה: ערך ה-CVD של האיבר הלא איסכמי עבור כל עכבר הוא הניח להתאים 100% כדי להוציא וריאציות של האנטומיה, הפרזיה או הדיאפזציה הליכים. אחוז ה-CVD באיבר האיסכמי היה, ולכן, מחושב ביחס לחוסר האיסכמי. - קבע את אחוזי ההגדלה של CVD כהפרש בין אחוז ה-CVD בין האיברים האיסכמי והלא-איסכמי.
- לכידת בלייזר של נימים
- לאחר ההרדמה, להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם.
- לקצור את שרירי הגקינמיוס של שתי הרגליים, להסיר את העור מעכברים הן האחוריות.
- לזהות את גיד אכילס ולהפריד את הגיד מהעצם בעזרת אזמל של 11 להב.
- להחזיק את גיד אכילס ולהפריד את השריר מן השוקה ואת הפיבולה עד מפרק הברך עם מספריים האביב.
- הפרד בין השרירים. משריר הגקטמיאוס
- להשתמש במספריים האביב כדי לחתוך את הוספות של שרירי הגקטמיוס ברמת מפרק הברך.
- הניחו את שרירי הגקטמיוס הקוצרים בכיוון רוחבי על דיסק שעם קטן בעזרת 10% tragacanth.
- הצמד להקפיא את הדגימות באיזופנטאן מקורר חנקן נוזלי ואחסן אותן ב-80 ° c עד שהוא מדבר.
- גזור בהקפאה 12 יקרומטר סעיפים של דגימות שריר הר על שקופיות זכוכית.
הערה: עבור הגנת RNA לקחת שקופית מקורר ולגעת בצד האחורי של השקופית עם האצבע (כפפות) כדי לחמם רק את האזור להצבת המקטע. מקטע העברה מסכין קריוסטט על ידי נגיעה עם האזור החמם ויבש ב-20 ° c ב קריוסטט עבור 2-3 דקות. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.- תקן את שקופיות הזכוכית בבקבוק המכיל אצטון טהור מקורר (כ 50 mL) עבור 5 דקות ב -20 ° c ומייבשים אותם באוויר.
- השתמש בעט הידרופובי סביב הסעיפים.
הערה: השימוש בעט הידרופובי מסייע בהפחתת כמות הפתרונות שהושקע במהלך הפרוטוקול. עבור כל incubations להשתמש 100 μL של כל הפתרונות, לכל מקטע. - מייבשים עם 2 M הנאל/PBS ב 4 ° c ו מודדת את הדגימות לילה ב 4 ° צ' עם אנטי CD31 לעכברוש נוגדן מונבטיים ב 1:500 ב 2M הנאל/PBS.
- כביסה פעמיים ב-2M הערוץ עבור סך של 6 דקות.
- הוסף הארנב הביוטיליס משני אנטי עכברוש נוגדן IgG ב 1:200 בתוך 2M הנאל/PBS ו 5% סרום ארנב עבור 30 דקות ב 4 ° c.
- לשטוף ב 2 מטרים בלבד/PBS כמו לפני ולהוסיף תווית avidin-מעלה מperoxidase קומפלקס עבור 30 דקות ב 4 ° c.
- שטפו והוסיפו ערכת מצע peroxidase במשך 5 דקות.
- מייבשים את הסעיפים בקרח קר 90% אתנול ואחריו 100% אתנול ולהשאיר אותם יבש.
- נתח 10 000 נימים לעכברים באמצעות מערכת מיקרודיסקציה לייזר מצויד מוצק פעמו מדינה 355 לייזר nm ו מעוט את הנימים לגזור לתוך microfuge צינור דבק-כובע.
- הפקת רנ א, סינתזה cDNA, טרום הגברה, ו-RT-PCR
- בודד RNA סה כ מן נימים מיקרו באמצעות ערכת מתאימה, RNA סה כ שהתקבלו היא בין 1.5-3 ng/μL.
- השתמש בערכת סינתזה של cDNA לסינתזה ושני סיבובים של הגברה מראש, באמצעות התחל המתואר בטבלה 1.
- בצע RT-PCR עבור אותן מטרות המתוארות בשלב הקודם. השתמש בתוכנית המורכבת משלב הדנטורציה הראשוני ב-95 ° c במשך 10 דקות, ואחריו 50 מחזורים ב-95 ° c במשך 15 ס מ ובשעה 60 ° c עבור 1 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות הפרוטוקול המתואר, בתאי גזע הטבור מסנצ'יאל וקרינה מייננת במינון נמוך (ldir) נבדקו כטיפולים אנגיוגנטיים של החבל 11,12. לייזר דופלר זלוף קריאות הושגו לפני האינדוקציה איסכמיה ו ב מראש מוגדר נקודות זמן החל מיד לאחר אינדוקציה איסכמיה כדי 45 ימים post-איסכמיה. קריאות של רקמות העור על ידי דופלר לייזר נרשמו כתמונות מקודדות בצבע, ללא פרזיה שהוצגה ככחול כהה ורמת פרפיוז הגבוהה ביותר המוצגת כאדומה. כפי שמוצג באיורים 2a ו -3a ו בכמת בדמויות 2b ו -3a, אובדן מלא של הפרזיה החודש נצפתה בכל העכברים מיד לאחר האינדוקציה של איסכמיה החוצה, להבטיח את ה שיטה של הטכניקה לגרימת איסכמיה הגוף. חשוב מכך, חומרת איסכמיה דומה בכל החיות. ROI היתה מצוירת סביב האיבר מעבר האיסכמי ו ROI דומה היה מצויר סביב הלא איסכמי הגפיים לבצע את כימות הפרזיה. זלוף מתבטאת כיחס של זלוף ב האיבר האיסכמי זה באיבר הלא איסכמי. שינויים ביחס הפרהיזיה נמדדים לאורך זמן.
אימונוהיסטוכימיה בוצעה בין 15 ל 90-ימים שלאחר איסכמיה. הדיאפחונזציה התבצעה בין 19 ל-90 ימים לאחר המוות ולניתוח מיקרו-איסכמיה בין 45 ל-70-ימים לאחר שלאחר איסכמיה, ומבטיחים כי הטיפולים השונים הפרו-אנגיוגנטיים שונים המושרה לאפקט proangiogenic מתמשך וממושך.
הכמת של CD31-חיוביים בסעיפים היסטלוגיים של שריר השריר העריכו את צפיפות נימי הכוח וזה התבטא כמספר נימים למספר של סיבי שריר. כפי שמוצג באיור 4, צפיפות נימי היה גדול יותר באיסכמי לעומת האיבר הלא-איסכמי.
על מנת להעריך את צפיפות כלי הקיבול, העכברים היו הדיאפגניים וההחזר המקביל, המתאים ל -20% מאזור הגפיים, נבחר עבור כימות. צפיפות כלי הקיבול העירבון גדל בעקביות האיבר האיסכמי, כך נתונים הנוגעים לאיברים מטופלים ושליטה הביעו ביטוי כאחוז של צפיפות הספינה העירבון להגדיל את האיבר איסכמי יחסית לא האיסכמי אחד (איור 5 ).
ביטוי של גנים פרו-אנגיוגנטיים על ידי ECs נותחו על ידי כמותית RT-PCR של תאים CD31-חיוביים. התעתיקים של Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf, ו- Met הראה וריאציה ברורה בביטוי בין איסכמי ואיברים לא-איסכמי, באופן בלעדי בעכברים חשופים הגירוי pro-אנגיוגנטי (איור 6).
איור 1 : אילוסטרציה סכמטית של האנטומיה של מחיצת העכבר המ, מראה את האתרים הליטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : Ldir מגביר את ההתאוששות זלוף. לאחר האינדוקציה כירורגית של HLI חד צדדית, שני הגפיים של C57BL/6 עכברים היו מזויפים לקרינה או לקרינה עם ארבעה שברים יומיים של 0.3 Gy, בימים רצופים ומותר להתאושש. (א) הנציג לייזר דופלר זרימה תמונות pre-HLI, ובימים 0 (d0) ו 15 (d15) פוסט HLI אינדוקציה. (ב) הערכה כמותית של זרימת הדם המתבטאת כיחס של ISC האיבר NISC הפגינו באופן משמעותי משופר דם הגפיים האיבר בעכברים הוקרן לעומת האלה הקרינה מוגברת הן בימים 15 (d15) ו 45 (d45) post-HLI. בין-קבוצות שינויים העריכו על ידי מדידות חוזרות דו-כליות ANOVA ואחריו מבחן בונפררוני post-הוק (n = 12 עכברים לכל קבוצה). המשמעות היא ± SEM מוצגים. P < 0.001; . לא משמעותיים HLI, איסכמיה החוצה האיבר; ISC, איסכמי; NISC, אי הסכמי; Pre-HLI, לפני איסכמיה שלפני האיבר. . מותאם מ -11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : חבל הטבור בתאי גזע (UCX) להגדיל את ההתאוששות הפרזיה. UCX או הרכב שלהם (כפקד) היו מנוהלים בשריר איסכמי היימיאוס 5 שעות לאחר האינדוקציה HLI. (א) מייצג לייזר דופלר זרימת תמונות לפני (PRE-HLI), מיד אחרי (d0 POST-HLI) ו ב 7, 14 ו 21 ימים post-HLI אינדוקציה (d7 POST-HLI, d14 פוסט-HLI, d21 POST-HLI). (ב) הערכה כמותית של זרימת הדם המתבטאת כיחס של isc האיבר nisc הפגינו באופן משמעותי משופר דם הגפיים זלוף בתאי גזע הטבור mesenchymal שטופלו עכברים ב 7, 14 ו 21 ימים post-hli. (n = 16 לכל קבוצה ניסיונית; D7: t (22.69) = 4.26; P ˂ 0.001; גודל האפקט היה 1.51 והכוח 0.98; D14: t (30) = 4.7; P ˂ 0.001; גודל האפקט היה 1.66 והכוח 0.99; D21: t (30) = 7.22; P ˂ 0.001; גודל האפקט היה 2.56 וכוח 0.99). HLI, איסכמיה החוצה האיבר; ISC, איסכמי; . ניסג, לא איסכמי . מותאם מ-11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : Ldir מגביר צפיפות נימי. (א) מחלקים נציגים של שרירי האיסכמי הקרינה הוקרן והוקרן ביום 45 POST-hli. נימים ומיוציטים זוהו על ידי CD31 אימונוהיסטוכימיה והמטאוקסילין, בהתאמה. סרגל בקנה מידה, 150 מ"מ. (ב) ניתוח כמותי חשף צפיפות נימי מוגברת (נימים/מיציט) בשרירי האיסכמי הקרינה שנחשפו בהשוואה לאיסכמי הקרינה שנחשפו בימים 15 ו 45 POST-hli. ANOVA מעורב ואחריו בונה בונפררוני לאחר הבדיקה נערכה עם גורם פנימי בנושא של ISC ובין גורמי הנושא של היום והקרנה (n = 6 עכברים לכל קבוצה). נתונים בודדים ואמצעים ± SEM מוצגים. P < 0.001; . לא משמעותיים ISC, איסכמי; . ניסג, לא איסכמי . מותאם מ-11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הפקודה ldir מגדילה את צפיפות העירבון. (א) המחשה תמונות של rois נבחר עבור עכברים שעברו הקרינה הוקרן והקרינה. הגפיים ISC ו NISC ביום 90 post-HLI מוצגים. סרגל קנה מידה, 300 mm. (ב) נתונים מיוצגים כאחוז של הגידול cvd של האיבר isc יחסית ל-nisc 1. בימים 15 ו 90 post-HLI, עכברים שעברו קרינה הציגו הגדלת CVD גבוה באופן משמעותי (%) לעומת עכברים שעברו הקרינה. ANOVA דו-כיוון נערך ואחריו מבחן בונפררוני לאחר הבדיקה עם מרכיבי הנושא של היום והקרנה (n = 6 עכברים לכל קבוצה). נתונים בודדים ואמצעים ± SEM מוצגים. * P < 0.05; P < 0.001; . לא משמעותיים HLI, איסכמיה החוצה האיבר; ISC, איסכמי; . ניסג, לא איסכמי . מותאם מ-11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : Ldir upregulates את הביטוי של גנים אנגיוגנטיים ב-ecs בודד מפני השרירים הניגולטים הקרינה. לאחר האינדוקציה כירורגית של HLI חד צדדית, שני הגפיים של C57BL/6 עכברים היו התחזות הקרינה או לקרינה עם ארבעה שברים יומיים של 0.3 Gy, בימים רצופים ומותר להתאושש. ביום 45 post-HLI, הביטוי של גורמים פרו-אנגיוגנטיים וקולטני שלהם הוערך על ידי רביעיית-PCR באופן בלעדי ב ECs. שרירי השריר המוכתמים היו מוכתמים בCD31. CD31 בודדים אנדותל התאים היו דמיינו, גזור, מבודדים באמצעות מערכת לייזר לנתיחה. כל בר מייצג את הביטוי הגנטי היחסי בבעל חיים אחד. ברים לבנים ואפורים מייצגים עכברים. שעברו הקרינה והקרינה, בהתאמה הערכים הנורמו ל-18S כדי לקבל רמות ביטוי יחסיות. התוצאות הביעו שינויים log2 קיפול בין האיסכמי לבין הדגימות שאינם איסכמי הראו את השפע היחסי של התעתיקים בעכברים שעברו הקרינה; לעומת זאת, התקנה למטה מנצפתה בעכברים שעברו הקרינה. . מותאם מ-11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| Vegfr1_ F (5 '-TTGAGGAGCTTTCACCGAACTCCA-3 '); |
| Vegfr1_ R (5)-מדריך לפיתוח והבראה (2); |
| Vegfr2_ F (5 '-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3 '); |
| Vegfr2_ R (5 '-AGACCATGTGGCTCTGTTTCTCCA-3 '); |
| Pdgf-c_ F (5 '-ATGCCACAG-3 '); |
| Pdgf-c_ R (5 '-AAGGPGTD_C-3 '); |
| הכירואת (5 '-AGTTGGGTA-3 '); |
| Met_ R (5 '-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3 '); |
| Fgf2_ F (5 '-באמצעות התנועה-3 '); |
| Fgf2_ R (5 '-AACAGCTHTPHTPGT-3 '); |
| Tgfb2_ F (5 '-GCTTTGCCT-3 '); |
| Tgfb2_ R (5 '-CTCCAGP_PP_P_4 '); |
| Ang2_ F (5 '-ATCCAACGATPT-3 '); |
| Ang2_ R (5 '-APTGCTCT-3 '); |
| (5 '-הגקטקיגאגאגג -3 '); |
| Hgf_ R (5 '-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA -3 '); |
| טוסי אף -18_ F (5 '-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT -3 '); |
| טוסי אף -18_ R (5 '-ccggaatcgaגנול att-3 '). |
שולחן 1: צבעי היסוד המשמשים למחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים murine של CLI היו בעיקר באמצעות הארכה של עורק הירך בדיוק המרוחק למקור של הראש העמוק מוריס 4,5,6,7,8,9. זה הראה להשאיר את רוב המחזור הנלווה ללא פגע, אשר מחזיר את זרימת הדם אל האיבר בתוך 7 ימים 9. ניתן להשיג את הסרת המיטה העירבון באמצעות כריתה של עורק הירך. עם זאת, עד שליש מזרימת הדם המקורית ניתן לשחזר ברגע 7 ימים לאחר ההליך, בהינתן כי הכלים העירבון ביותר נובעים עורק כסל הפנימי 7. Lejay ואח ' הציעו הטיות סדרתית עם הארכה השנייה בוצע על העורק כסל המשותף, ביעילות לצמצם את הפרזיה העירבון המסופק על ידי עורק כסל הפנימי 4. צעדים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים לא רק את הזיהוי של עורק כסל החיצוני מעל הרצועה המוקצת, אלא גם את החיבור והכריתה של עורקי הירך והעורק החיצוניים והורידים, המגישה מטרה כפולה: ל להגדיל את חומרת איסכמיה, כמו גם כדי לשפר את המצב הטכני של המודל, כמו חשיפה של עורק הירך לבד לעתים קרובות גורמת לקריעת הווריד.
מגבלה אחת של טכניקה זו היא הפרעה חריפה של זרימת הדם אל האיבר, אשר שונה מהתהליך ממושך הקשורים הצטברות של טרשת עורקים פלאק המוביל היצרות עורקים וסגר. עדיין, הפחתת זרימת הדם היתה היטב לאחר 2 שבועות, נקודת הזמן הוקמה לאבחון של איסכמיה כרונית. כמו כן, הוגדלה הקשר עם החטא האיסכמי בלבד, אשר מחקה את תהליך היווצרות העירבון נצפתה בגפיים כרוניות.
האננובאסקולריזציה של גפיים איסכמי כרוכה בגומלין מורכב של אירועים ביולוגיים, כלומר, אנגיוגנזה ו הריויוגנזה. פרוטוקול זה כולל מגוון רחב של מאמר שהעריך את ההפרעה של טיפולים באמצעות אנגיוגנטית על לבלוב אנגיוגנטי (צפיפות כלי הדם) ופיתוח כלי הקיבול הנלווה (עורק), המנגנון החשוב ביותר בסובלנות האנושית להורדת איסכמיה של גפיים. במקביל, דופלר לייזר משמש לחשיפת הפונקציה של אלה כלי חדש או מוגדל, ועבור ניתוח מיקרו לייזר בפעם הראשונה של נימים משמש כדי לאסוף ECs מחשוף את המנגנונים המולקולריים התאוששות תפקודית. פרוטוקול זה מניב מודל בעלי חיים שניתן לחקות, שיכול לחקה את ההשפעות של CLI ברמה של בדיקות כאשר החיות מטופלות עם טיפולים אנגיוגנטיים אפשריים שניתן ליישם בהקשר הקליני בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לחוסה רינו ולטיאניה קרבלהו, ראשי המכון הביודמיה והמעבדה לפתולוגיה של היסטולוגיה והשוואתי של המכון המולקולרי לובו אנטז, בהתאמה. אנחנו גם מודים ויאצ Sushchyk מהמחלקה לאנטומיה של בית הספר לרפואה של נובה/Faculdade דה Ciências מדיאס, אוניברסידייד נובה דה ליסבון.
התייחסות מימון: פרויקט ממומן על ידי UID/IC/0306/2016 הדיווה הטובה ביותר. פאולה דה אוליביירה נתמכת על ידי מלגת (SFRH/BD/80483/2011) מתוך הדיווה הישנה של האגודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
