Summary

הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה

Published: June 08, 2019
doi:

Summary

כאן, המודל הניסיוני הטיפולי איסכמיה מוצג ואחריו סוללה של פונקציונלי, בדיקות היסטולוגית ומולקולרית כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים אנגיוגנטית.

Abstract

איסכמיה גפה קריטית (CLI) היא מצב חמור הכרוך בסיכון גבוה לקטיעה בגפיים התחתונות. למרות revascularization להיות טיפול בתקן זהב, מספר ניכר של מטופלים CLI אינם מתאימים או ניתוחי וכירורגי או אנדוסקולריזציה. טיפולים מגנטיים מתפתחים כאופציה למטופלים אלה, אך כיום הם עדיין תחת חקירה. לפני היישום בבני אדם, הטיפולים האלה חייבים להיבדק במודלים של בעלי חיים והמנגנון שלו חייב להיות מובן בבירור. מודל בעל חיים של איסכמיה הגוף (HLI) פותחה על ידי החיבור וכריתה של עורקי הירך החיצוניים ואת הוורידים ורידים בעכברים. פאנל מקיף של מבחנים התאספו כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול באיסכמיה ובטיפולים אנגיוגנטיים בתוך הפונקציונליות, היסטולוגית ורמות מולקולריות. לייזר דופלר שימש למדידת הזרימה והערכה פונקציונלית של perfusion. תגובת רקמות הוערך על ידי ניתוח של צפיפות נימי לאחר הצביעת עם הנוגדן anti-CD31 על סעיפים היסטולוגית של שריר השריר, ועל ידי מדידה של צפיפות כלי הקיבול הנלווה לאחר דיאפחונזציה. ביטוי של הגנים של אנגיוגנטית היה ככמת על ידי RT-PCR מיקוד גורמים מבוססי אנגיוגנטיים שנבחרו באופן בלעדי בתאי האנדותל (ECs) לאחר לכידת לייזר הניתוח של שרירי השרירים של העכבר. שיטות אלו היו רגישות בזיהוי הבדלים בין האיברים האיסכמי והלא-איסכמי ובין הגפיים הבלתי מטופלות. פרוטוקול זה מספק מודל מחודש של CLI ומסגרת לבדיקת טיפולים אנגיוגנטיים.

Introduction

מחלת עורקים היקפית (PAD) משפיעה בעיקר על הגפיים התחתונות. PAD נגרמת על ידי טרשת עורקים, חסם עורק שיכול לגרום להגבלה חמורה לזרימת הדם בגפיים התחתונות1. התפטרות לסירוגין הוא הביטוי הראשון של PAD ומתייחס כאב שרירים בעת הליכה. CLI הוא השלב החמור ביותר של PAD, להיות מאובחנים בחולים כי להראות כאבים מנוחה איסכמי, כיבים או נמק2. חולים עם CLI יש סיכון גבוה של קטיעה, במיוחד אם לא מטופל3. הגפיים התחתונות revascularization (או על ידי ניתוח פתוח או הליך אנדוכלי) היא כרגע הדרך היחידה להשיג הצלה איבר. עם זאת, בסביבות 30% מהחולים CLI אינם מתאימים הליכים אלה, מסיבות הכוללות את המיקום של נגעים, התבנית של סגר עורקים והיקף תחלואה נרחבת4,5. לכן, טיפולים חדשים נחוצים עבור אלה חולים שאינם ניתן לטיפול במקרים אחרים, עם קידום האנגיוגנזה להיות האסטרטגיה תחת חקירה אינטנסיבית יותר.

לפני בדיקה בבני אדם, את היעילות והבטיחות של טיפולים חדשים בvivo יש לשקול בדגמי חיות. מספר דגמים פותחו למחקר של CLI, בעיקר על ידי גרימת איסכמיה הגפיים האחרונות (hli) בעכברים6,7,8,9,10. עם זאת, מודלים אלה נבדלים במספר היבטים, כולל טבעו של העורקים המגורטים ו/או מרוטרים והאם הורידים והעצבים שמסביב מושלכות גם כן6,7,8, 9,10. יחד, היבטים אלה ישפיעו על חומרת הפציעה של איסכמיה-reperfusion בכל חיה, מה שהופך את התוצאות קשה להשוואה. לכן, זה קריטי לפתח פרוטוקול אפקטיבי שבו ההליך לגרום איסכמיה והערכה של מטרות שונות צריך להיות מתוקננת כדי להעריך אם טיפול אנגיוגנטי מסוים יהיה יעיל. פרוטוקול ניסיוני שנועד לכסות את כל ההיבטים הללו יספק הבנה מקיפה של המנגנונים שבהם טיפולים אנגיוגנטיים מפעילים את השפעתם ומידת יעילותם בכל אחת מהתוצאות. שתי יצירות נפרדות שפורסמו לאחרונה על ידי הצוות שלנו הם דוגמה טובה11,12, שבו גישות שונות כדי לגרום לאנגיוגנזה הטיפולית העריכו באמצעות אותו פרוטוקול אשר יתואר עם פרטים נוספים ב פרוטוקול.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר מודל ניסיוני הניתן לחיקוי שיכול לחקות את ההשפעות של CLI ולהטיל את הבסיס הניסיוני להערכה מקיפה של ההשפעות תפקודית, היסטולוגית ומולקולרית של אנגיוגנטי. סוכנים.

Protocol

כל הליכים בעלי חיים הם בהתאם הוראה 2010/63/האיחוד האירופי אושרה על ידי גוף בעלי חיים מוסדיים רווחה ומורשה על ידי DGAV הרשות המוסמכת פורטוגזית להגנת בעלי חיים (רישיון מספר 023861/2013) התראה: חלק מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקולים רעילים ומזיקים. אנא השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים וציוד…

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול המתואר, בתאי גזע הטבור מסנצ’יאל וקרינה מייננת במינון נמוך (ldir) נבדקו כטיפולים אנגיוגנטיים של החבל 11,12. לייזר דופלר זלוף קריאות הושגו לפני האינדוקציה איסכמיה ו ב מראש מוגדר נקודות זמן החל מיד לאחר אינדוקציה איסכמיה כדי 45 ימים post-איסכמיה. קרי…

Discussion

מודלים murine של CLI היו בעיקר באמצעות הארכה של עורק הירך בדיוק המרוחק למקור של הראש העמוק מוריס 4,5,6,7,8,9. זה הראה להשאיר את רוב המחזור הנלווה ללא פגע, אשר מחזיר את זרימת הדם אל האיבר בתוך 7…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחוסה רינו ולטיאניה קרבלהו, ראשי המכון הביודמיה והמעבדה לפתולוגיה של היסטולוגיה והשוואתי של המכון המולקולרי לובו אנטז, בהתאמה. אנחנו גם מודים ויאצ Sushchyk מהמחלקה לאנטומיה של בית הספר לרפואה של נובה/Faculdade דה Ciências מדיאס, אוניברסידייד נובה דה ליסבון.

התייחסות מימון: פרויקט ממומן על ידי UID/IC/0306/2016 הדיווה הטובה ביותר. פאולה דה אוליביירה נתמכת על ידי מלגת (SFRH/BD/80483/2011) מתוך הדיווה הישנה של האגודה.

Materials

7500 Fast Real-Time PCR Applied Biosystems Instrument
Acetone Merk 1000141000 Reagent; Caution – highly flammable
Adenosine Valdepharm Reagent
Atipamezole OrionPharma Reagent
Barium sulphate (Micropaque) Guebert 8671404 (ref. Infarmed) Reagent
Buprenorphine RichterPharma Reagent
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit Qiagen 7335730 Reagent
Cryostat Leica CM Leica Microsystems 3050S Instrument
DAB peroxidase substrate kit DAKO;Vector Laboratories K3468 Reagent
hydrogen peroxidase Merk 1072090250 Reagent; Caution – nocif
hydrophobic pen Dako 411121 Reagent; Caution – toxic
Ketamidor Richterpharma CN:580393,7 630/01/12 Dfvf Reagent
Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK 5710 Instrument
Leica DM2500 upright brightfield microscope Leica Microsystems Instrument
Medetor Virbac 037/01/07RFVPT Reagent
methanol VWR UN1230 Reagent; Caution – toxic and highly flammable
Papaverine Labesfal Reagent
Pentano Isso Merk 1060561000 Reagent; Caution – highly flammable
Power SYBR® Green Applied Biosystems 4309155 Reagent
Purified rat anti-mouse CD31 Pharmingen 550274 Reagent
RNeasy Micro kit Qiagen 74004 Reagent
Surgic-Pro 6.0 Medtronic (Coviden) VP733X Suture
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) Vectastain ABC kit; Vector Laboratories PK-4004 Reagent
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 Medtronic (Covidien) UL202/ UL101 Suture
Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System Carl Zeiss Microscopy, Germany 1023290916 Instrument
Stereotaxic microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
Digital camera Linux Instrument

References

  1. Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
  3. Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
  4. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  5. Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
  6. Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
  7. Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
  8. Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
  9. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  10. Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
  11. Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
  12. Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
  13. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ministro, A., de Oliveira, P., Nunes, R. J., dos Santos Rocha, A., Ferreira, T., Goyri-O’Neill, J., Rosa Santos, S. C. Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (148), e59582, doi:10.3791/59582 (2019).

View Video