הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה
Summary
כאן, המודל הניסיוני הטיפולי איסכמיה מוצג ואחריו סוללה של פונקציונלי, בדיקות היסטולוגית ומולקולרית כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים אנגיוגנטית.
Abstract
איסכמיה גפה קריטית (CLI) היא מצב חמור הכרוך בסיכון גבוה לקטיעה בגפיים התחתונות. למרות revascularization להיות טיפול בתקן זהב, מספר ניכר של מטופלים CLI אינם מתאימים או ניתוחי וכירורגי או אנדוסקולריזציה. טיפולים מגנטיים מתפתחים כאופציה למטופלים אלה, אך כיום הם עדיין תחת חקירה. לפני היישום בבני אדם, הטיפולים האלה חייבים להיבדק במודלים של בעלי חיים והמנגנון שלו חייב להיות מובן בבירור. מודל בעל חיים של איסכמיה הגוף (HLI) פותחה על ידי החיבור וכריתה של עורקי הירך החיצוניים ואת הוורידים ורידים בעכברים. פאנל מקיף של מבחנים התאספו כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול באיסכמיה ובטיפולים אנגיוגנטיים בתוך הפונקציונליות, היסטולוגית ורמות מולקולריות. לייזר דופלר שימש למדידת הזרימה והערכה פונקציונלית של perfusion. תגובת רקמות הוערך על ידי ניתוח של צפיפות נימי לאחר הצביעת עם הנוגדן anti-CD31 על סעיפים היסטולוגית של שריר השריר, ועל ידי מדידה של צפיפות כלי הקיבול הנלווה לאחר דיאפחונזציה. ביטוי של הגנים של אנגיוגנטית היה ככמת על ידי RT-PCR מיקוד גורמים מבוססי אנגיוגנטיים שנבחרו באופן בלעדי בתאי האנדותל (ECs) לאחר לכידת לייזר הניתוח של שרירי השרירים של העכבר. שיטות אלו היו רגישות בזיהוי הבדלים בין האיברים האיסכמי והלא-איסכמי ובין הגפיים הבלתי מטופלות. פרוטוקול זה מספק מודל מחודש של CLI ומסגרת לבדיקת טיפולים אנגיוגנטיים.
Introduction
מחלת עורקים היקפית (PAD) משפיעה בעיקר על הגפיים התחתונות. PAD נגרמת על ידי טרשת עורקים, חסם עורק שיכול לגרום להגבלה חמורה לזרימת הדם בגפיים התחתונות1. התפטרות לסירוגין הוא הביטוי הראשון של PAD ומתייחס כאב שרירים בעת הליכה. CLI הוא השלב החמור ביותר של PAD, להיות מאובחנים בחולים כי להראות כאבים מנוחה איסכמי, כיבים או נמק2. חולים עם CLI יש סיכון גבוה של קטיעה, במיוחד אם לא מטופל3. הגפיים התחתונות revascularization (או על ידי ניתוח פתוח או הליך אנדוכלי) היא כרגע הדרך היחידה להשיג הצלה איבר. עם זאת, בסביבות 30% מהחולים CLI אינם מתאימים הליכים אלה, מסיבות הכוללות את המיקום של נגעים, התבנית של סגר עורקים והיקף תחלואה נרחבת4,5. לכן, טיפולים חדשים נחוצים עבור אלה חולים שאינם ניתן לטיפול במקרים אחרים, עם קידום האנגיוגנזה להיות האסטרטגיה תחת חקירה אינטנסיבית יותר.
לפני בדיקה בבני אדם, את היעילות והבטיחות של טיפולים חדשים בvivo יש לשקול בדגמי חיות. מספר דגמים פותחו למחקר של CLI, בעיקר על ידי גרימת איסכמיה הגפיים האחרונות (hli) בעכברים6,7,8,9,10. עם זאת, מודלים אלה נבדלים במספר היבטים, כולל טבעו של העורקים המגורטים ו/או מרוטרים והאם הורידים והעצבים שמסביב מושלכות גם כן6,7,8, 9,10. יחד, היבטים אלה ישפיעו על חומרת הפציעה של איסכמיה-reperfusion בכל חיה, מה שהופך את התוצאות קשה להשוואה. לכן, זה קריטי לפתח פרוטוקול אפקטיבי שבו ההליך לגרום איסכמיה והערכה של מטרות שונות צריך להיות מתוקננת כדי להעריך אם טיפול אנגיוגנטי מסוים יהיה יעיל. פרוטוקול ניסיוני שנועד לכסות את כל ההיבטים הללו יספק הבנה מקיפה של המנגנונים שבהם טיפולים אנגיוגנטיים מפעילים את השפעתם ומידת יעילותם בכל אחת מהתוצאות. שתי יצירות נפרדות שפורסמו לאחרונה על ידי הצוות שלנו הם דוגמה טובה11,12, שבו גישות שונות כדי לגרום לאנגיוגנזה הטיפולית העריכו באמצעות אותו פרוטוקול אשר יתואר עם פרטים נוספים ב פרוטוקול.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר מודל ניסיוני הניתן לחיקוי שיכול לחקות את ההשפעות של CLI ולהטיל את הבסיס הניסיוני להערכה מקיפה של ההשפעות תפקודית, היסטולוגית ומולקולרית של אנגיוגנטי. סוכנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים murine של CLI היו בעיקר באמצעות הארכה של עורק הירך בדיוק המרוחק למקור של הראש העמוק מוריס 4,5,6,7,8,9. זה הראה להשאיר את רוב המחזור הנלווה ללא פגע, אשר מחזיר את זרימת הדם אל האיבר בתוך 7…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחוסה רינו ולטיאניה קרבלהו, ראשי המכון הביודמיה והמעבדה לפתולוגיה של היסטולוגיה והשוואתי של המכון המולקולרי לובו אנטז, בהתאמה. אנחנו גם מודים ויאצ Sushchyk מהמחלקה לאנטומיה של בית הספר לרפואה של נובה/Faculdade דה Ciências מדיאס, אוניברסידייד נובה דה ליסבון.
התייחסות מימון: פרויקט ממומן על ידי UID/IC/0306/2016 הדיווה הטובה ביותר. פאולה דה אוליביירה נתמכת על ידי מלגת (SFRH/BD/80483/2011) מתוך הדיווה הישנה של האגודה.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
