Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb
Summary
Qui viene presentato un modello sperimentale critico di ischemia dell’arto posteriore seguito da una batteria di test funzionali, istologici e molecolari per valutare l’efficacia delle terapie angiogeniche.
Abstract
L’ischemia degli arti critici (CLI) è una condizione grave che comporta un alto rischio di amputazione degli arti inferiori. Nonostante la risvascolarizzazione sia la terapia gold-standard, un numero considerevole di pazienti CLI non è adatto per la vascolarizzazione chirurgica o endovascolare. Le terapie angiogeniche stanno emergendo come opzione per questi pazienti, ma sono attualmente ancora in fase di studio. Prima dell’applicazione nell’uomo, tali terapie devono essere testate in modelli animali e i suoi meccanismi devono essere chiaramente compresi. Un modello animale di ischemia dell’animale (HLI) è stato sviluppato dalla legatura e dall’escissione delle arterie e delle vene esterne distale nei topi. È stato assemblato un gruppo completo di test per valutare gli effetti dell’ischemia e delle terapie angiogeniche putative a livello funzionale, istologico e molecolare. Laser Doppler è stato utilizzato per la misurazione del flusso e la valutazione funzionale della perfusione. La risposta dei tessuti è stata valutata dall’analisi della densità capillare dopo la colorazione con l’anticorpo anti-CD31 sulle sezioni istologiche del muscolo gastrocnemio e dalla misurazione della densità dei vasi collaterali dopo la diafonizzazione. L’espressione di geni angiogenici è stata quantificata da RT-PCR mirando a fattori angiogenici selezionati esclusivamente nelle cellule endoteliali (EC) dopo la microdissezione di cattura laser dai muscoli gastrocnemius dei topi. Questi metodi erano sensibili nell’identificare le differenze tra gli arti ischemici e non ischemici e tra gli arti trattati e non trattati. Questo protocollo fornisce un modello riproducibile di CLI e un quadro per testare le terapie angiogeniche.
Introduction
La malattia arteriosa periferica (PAD) colpisce prevalentemente gli arti inferiori. La TORca è causata dall’aterosclerosi, un’ostruzione arteriosa che può causare gravi restrizioni al flusso sanguigno negli arti inferiori1. La claudicazione intermittente è la prima manifestazione del PAD e si riferisce al dolore muscolare quando si cammina. La CLI è lo stadio più grave del PAD, diagnosticata in pazienti che mostrano dolore ischemico di riposo, ulcere o cancrena2. I pazienti con CLI hanno un alto rischio di amputazione, soprattutto se non trattati3. La risanamento degli arti inferiori (sia per chirurgia aperta che per una procedura endovascolare) è attualmente l’unico modo per ottenere il recupero degli arti. Tuttavia, circa il 30% dei pazienti CLI non è adatto a queste procedure, per motivi che includono la localizzazione delle lesioni, il modello di occlusione arteriosa e l’ampia comorbilità4,5. Pertanto, sono necessarie nuove terapie per questi pazienti altrimenti non trattabili, con la promozione dell’angiogenesi è la strategia in un’indagine più intensa.
Prima di effettuare test nell’uomo, l’efficacia e la sicurezza delle nuove terapie in vivo devono essere considerate nei modelli animali. Diversi modelli sono stati sviluppati per lo studio di CLI, principalmente inducendo l’ischemia dell’arto posteriore (HLI) nei topi6,7,8,9,10. Tuttavia, questi modelli differiscono in diversi aspetti, tra cui la natura delle arterie che vengono legate e/o eccitate e se le vene e i nervi circostanti sono sezionati come pure6,7,8, 9,10. Nel loro insieme, questi aspetti influenzeranno la gravità della lesione ischemiera-reperfusione in ogni animale, rendendo i risultati difficili da confrontare. Pertanto, è fondamentale sviluppare un protocollo efficace in cui la procedura per indurre l’ischemia e la valutazione dei diversi obiettivi dovrebbe essere standardizzata per valutare se una determinata terapia angiogenica sarà efficace. Un protocollo sperimentale progettato per coprire tutti questi aspetti fornirebbe una comprensione completa dei meccanismi con cui le terapie angiogeniche esercitano i loro effetti e una misura della loro efficacia a ciascuno dei loro risultati. Due opere distinte recentemente pubblicate dal nostro team sono un buon esempio11,12, in cui diversi approcci per indurre l’angiogenesi terapeutica sono stati valutati utilizzando lo stesso protocollo che sarà descritto con più dettagli in questo protocollo.
L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere un modello sperimentale riproducibile in grado di imitare gli effetti della CLI e gettare le basi sperimentali per una valutazione completa degli effetti funzionali, istologici e molecolari della putagenia angiogenica Agenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
I modelli Murine di CLI sono per lo più costituiti in legatura dell’arteria femorale appena distale all’origine della profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Questo ha dimostrato di lasciare intatta la maggior parte della circolazione collaterale, che ripristina il flusso sanguigno all’arto entro 7 giorni 9. La…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo José Rino e Taria Carvalho, capi della struttura di bioimaging e Del Laboratorio di Patologia Materica e Patologia Comparata dell’Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes, rispettivamente. Ringraziamo anche Vyacheslav Sushchyk del Dipartimento di Anatomia della Nova Medical School/Faculdade de Cioncias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Finanziamento di riferimento: progetto finanziato da UID/IC/0306/2016 Fundao para a Ciància e a. Paula de Oliveira è sostenuta da una borsa di studio (SFRH/BD/80483/2011) di Fundao para a Ciància e Tecnologia.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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