ヒンドリム虚血のマウスモデルにおける治療血管新生の評価
Summary
ここで、重要な後肢虚血実験モデルを提示し、その後に血管新生療法の有効性を評価する機能的、血管学的および分子試験の電池が続く。
Abstract
臨界四肢虚血(CLI)は、下肢切断のリスクが高い重篤な状態である。再血管化はゴールドスタンダード療法であるにもかかわらず、かなりの数のCLI患者は外科的または血管内血管血管の再形成に適していない。血管新生療法は、これらの患者のためのオプションとして出現していますが、現在調査中です。ヒトに適用する前に、これらの治療法は動物モデルでテストされなければならず、そのメカニズムを明確に理解する必要があります。後肢虚血(HLI)の動物モデルは、マウスにおける遠位外腸骨および大腿動脈および静脈のライゲーションおよび切除によって開発された。虚血および造語血管新生療法の効果を機能的、血管学的および分子レベルで評価するために、包括的なテストパネルが組み立てられました。レーザードップラーは、灌流の流量測定および機能評価に使用されました。組織応答は、胃腸筋の組織学的セクション上の抗CD31抗体で染色した後の毛細血管密度の分析とダイアフォニング後の担保血管密度の測定によって評価された。血管新生遺伝子の発現は、マウスの胃腸筋からのレーザー捕捉微分解後に内皮細胞(IC)において排他的に選択された血管新生因子を標的とするRT-PCRにより定量した。これらの方法は、虚血性四肢と非虚血性四肢と治療されていない四肢の間の違いを同定する際に敏感であった。このプロトコルは、CLIの再現可能なモデルと血管新生療法をテストするためのフレームワークを提供します。
Introduction
末梢動脈疾患(PAD)は主に下肢に影響を与える。PADは、アテローム性動脈硬化によって引き起こされ、下肢1の血流に厳しい制限を引き起こす可能性のある動脈閉塞である。断続的な閉塞はPADの最初の症状であり、歩行時の筋肉痛を指す。CLIはPADの最も重篤な段階であり、虚血性休息痛、潰瘍または壊疽2を示す患者で診断される。CLI患者は切断のリスクが高く、特に未治療の場合は3.下肢血管再建(開開手術または血管内処置のいずれか)は、現在、四肢の救済を達成する唯一の方法です。しかしながら、CLI患者の約30%は、病変の位置、動脈閉塞および広範な併存のパターンを含む理由から、これらの処置には適していない4、5。したがって、これらのそうでなければ治療不可能な患者に対しては新しい治療法が必要であり、血管新生の促進はより厳しい調査の下で戦略である。
ヒトでの試験の前に、生体内の新しい治療法の有効性と安全性を動物モデルで考慮する必要があります。いくつかのモデルは、主にマウス6、7、8、9、10の後肢虚血(HLI)を誘導することによって、CLIの研究のために開発された。しかし、これらのモデルは、ライゲーションおよび/または切除された動脈の性質、周囲の静脈および神経も解剖されるかどうかを含むいくつかの側面で異なる6、7、8、 9,10.これらの態様を組み合わせると、各動物の虚血再灌流損傷の重症度に影響を与え、結果の比較が困難になります。したがって、虚血を誘発する手順と異なる標的の評価を標準化し、所定の血管新生療法が有効であるかどうかを評価する効果的なプロトコルを開発することが重要である。これらすべての側面をカバーするように設計された実験プロトコルは、血管新生療法がそれらの効果を発揮するメカニズムと、それぞれの結果における有効性の尺度を包括的に理解することを提供するであろう。私たちのチームが最近発表した2つの異なる作品は、治療血管新生を誘導する異なるアプローチが、この中でより詳細に説明される同じプロトコルを使用して評価された良い例11、12です。プロトコル。
このプロトコルの全体的な目標は、CLIの効果を模倣し、プタジアル血管新生の機能的、刺激的および分子的効果の包括的な評価のための実験基盤を築くことができる再現可能な実験モデルを記述することですエージェント。
Protocol
Representative Results
Discussion
CLIのマウスモデルは、主にプロファンダフェモリス4、5、6、7、8、9の起源に遠位の大腿動脈のライゲーションで構成されている。これは、7日以内に四肢への血流を回復させる担保循環のほとんどをそのまま残すことを示しています 9. <sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ホセ・リノとタニア・カルヴァーリョ、バイオイメージング施設とインスティトゥート・デ・メディチナ分子ジョアン・ロボ・アントゥンズの比較病理学研究所の責任者に感謝します。我々はまた、ノヴァ医科大学/ファカルダーデ・デ・シエンシアス・メディカス、ユニバーシダーデ・ノヴァ・デ・リスボアの解剖学科のヴィャチェスラフ・シュシチクに感謝します。
資金調達参照:UID/IC/0306/2016 Fundaçãoパラシエンシアeテノロジアによって資金提供されたプロジェクト。ポーラ・デ・オリベイラは、フンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジアのフェローシップ(SFRH/BD/80483/2011)によってサポートされています。
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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