Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Summary

Qui viene presentato un modello sperimentale critico di ischemia dell'arto posteriore seguito da una batteria di test funzionali, istologici e molecolari per valutare l'efficacia delle terapie angiogeniche.

Abstract

L'ischemia degli arti critici (CLI) è una condizione grave che comporta un alto rischio di amputazione degli arti inferiori. Nonostante la risvascolarizzazione sia la terapia gold-standard, un numero considerevole di pazienti CLI non è adatto per la vascolarizzazione chirurgica o endovascolare. Le terapie angiogeniche stanno emergendo come opzione per questi pazienti, ma sono attualmente ancora in fase di studio. Prima dell'applicazione nell'uomo, tali terapie devono essere testate in modelli animali e i suoi meccanismi devono essere chiaramente compresi. Un modello animale di ischemia dell'animale (HLI) è stato sviluppato dalla legatura e dall'escissione delle arterie e delle vene esterne distale nei topi. È stato assemblato un gruppo completo di test per valutare gli effetti dell'ischemia e delle terapie angiogeniche putative a livello funzionale, istologico e molecolare. Laser Doppler è stato utilizzato per la misurazione del flusso e la valutazione funzionale della perfusione. La risposta dei tessuti è stata valutata dall'analisi della densità capillare dopo la colorazione con l'anticorpo anti-CD31 sulle sezioni istologiche del muscolo gastrocnemio e dalla misurazione della densità dei vasi collaterali dopo la diafonizzazione. L'espressione di geni angiogenici è stata quantificata da RT-PCR mirando a fattori angiogenici selezionati esclusivamente nelle cellule endoteliali (EC) dopo la microdissezione di cattura laser dai muscoli gastrocnemius dei topi. Questi metodi erano sensibili nell'identificare le differenze tra gli arti ischemici e non ischemici e tra gli arti trattati e non trattati. Questo protocollo fornisce un modello riproducibile di CLI e un quadro per testare le terapie angiogeniche.

Introduction

La malattia arteriosa periferica (PAD) colpisce prevalentemente gli arti inferiori. La TORca è causata dall'aterosclerosi, un'ostruzione arteriosa che può causare gravi restrizioni al flusso sanguigno negli arti inferiori¹. La claudicazione intermittente è la prima manifestazione del PAD e si riferisce al dolore muscolare quando si cammina. La CLI è lo stadio più grave del PAD, diagnosticata in pazienti che mostrano dolore ischemico di riposo, ulcere o cancrena². I pazienti con CLI hanno un alto rischio di amputazione, soprattutto se non trattati³. La risanamento degli arti inferiori (sia per chirurgia aperta che per una procedura endovascolare) è attualmente l'unico modo per ottenere il recupero degli arti. Tuttavia, circa il 30% dei pazienti CLI non è adatto a queste procedure, per motivi che includono la localizzazione delle lesioni, il modello di occlusione arteriosa e l'ampia comorbilità^4,5. Pertanto, sono necessarie nuove terapie per questi pazienti altrimenti non trattabili, con la promozione dell'angiogenesi è la strategia in un'indagine più intensa.

Prima di effettuare test nell'uomo, l'efficacia e la sicurezza delle nuove terapie in vivo devono essere considerate nei modelli animali. Diversi modelli sono stati sviluppati per lo studio di CLI, principalmente inducendo l'ischemia dell'arto posteriore (HLI) nei topi^6,7,8,9,10. Tuttavia, questi modelli differiscono in diversi aspetti, tra cui la natura delle arterie che vengono legate e/o eccitate e se le vene e i nervi circostanti sono sezionati come pure^{6,7,8, 9,10}. Nel loro insieme, questi aspetti influenzeranno la gravità della lesione ischemiera-reperfusione in ogni animale, rendendo i risultati difficili da confrontare. Pertanto, è fondamentale sviluppare un protocollo efficace in cui la procedura per indurre l'ischemia e la valutazione dei diversi obiettivi dovrebbe essere standardizzata per valutare se una determinata terapia angiogenica sarà efficace. Un protocollo sperimentale progettato per coprire tutti questi aspetti fornirebbe una comprensione completa dei meccanismi con cui le terapie angiogeniche esercitano i loro effetti e una misura della loro efficacia a ciascuno dei loro risultati. Due opere distinte recentemente pubblicate dal nostro team sono un buon esempio^11,12, in cui diversi approcci per indurre l'angiogenesi terapeutica sono stati valutati utilizzando lo stesso protocollo che sarà descritto con più dettagli in questo protocollo.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere un modello sperimentale riproducibile in grado di imitare gli effetti della CLI e gettare le basi sperimentali per una valutazione completa degli effetti funzionali, istologici e molecolari della putagenia angiogenica Agenti.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono conformi alla direttiva 2010/63/EU e sono state approvate dall'Institutional Animal Welfare Body e autorizzate dalla DGAV, l'autorità competente portoghese per la protezione degli animali (numero di licenza 023861/2013)

AVVISO: Molte delle sostanze chimiche utilizzate nei protocolli sono tossiche e nocive. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e attrezzature protettive personali (guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera e scarpe chiuse)

1. Il modello murino dell'ischemia dell'arto posteriore

NOTA: Tutti gli esperimenti vengono eseguiti su topi di 22 settimane di vita femminile.

1. Preparazione delle soluzioni
   1. Preparazione della soluzione anestetica
      Nota: Questa combinazione anestetica (medetomidina e ketamina) fornisce fino a 30 min immobilizzazione e una finestra chirurgica di 15 min. L'effetto può essere annullato dalla somministrazione di atipamezolo.
      1. Con una siringa pulita da 1 cc, preleva 1 mL di medetomidina (1 mg/kg di peso corporeo), elimina le bolle d'aria per misurazioni accurate e aggiungilo a un tubo falco da 15 mL.
      2. Con una siringa pulita da 1 cc, preleva 0,75 mL di Ketamina (75 mg/kg di peso corporeo), elimina le bolle d'aria per misurazioni accurate e aggiungila a un tubo falco da 15 mL contenente la medetomina.
      3. Aggiungere 8,25 mL di salina sterile (0,9% NaCl), al fine di ottenere 10 mL di soluzione anestetica.
      4. Identificare il tubo con il nome dei composti, la data mista e la data di scadenza.
      5. Conservare al buio a 4 gradi centigradi.
   2. Preparazione della soluzione antiseddativa
      1. Con una siringa pulita da 1 cc, preleva 1 mL di atipamezolo (5 mg/kg di peso corporeo), elimina le bolle d'aria per misurazioni accurate e aggiungilo a un tubo falco da 15 mL.
      2. Aggiungere 9 mL di salina sterile (0,9% NaCl), al fine di ottenere 10 mL di soluzione di reversione.
      3. Identificare il tubo con il nome dei composti, la data mista e la data di scadenza.
      4. Conservare al buio a 4 gradi centigradi.
   3. Preparazione della soluzione analgesia post-operatoria
      1. Con una siringa pulita da 1 cc, preleva 0,5 mL di buprenorfine (100 l/15-30 g di peso corporeo), elimina le bolle d'aria per misurazioni accurate e aggiungile a un tubo di falco da 15 mL.
      2. Aggiungere 9,5 mL di salina sterile (0,9% NaCl), al fine di ottenere 10 mL di soluzione analgesia.
      3. Identificare il tubo con il nome dei composti, la data mista e la data di scadenza.
      4. Conservare al buio a 4 gradi centigradi.
2. Induzione chirurgica dell'ischemia dell'arto posteriore
   1. Strumenti chirurgici necessari per questo intervento: pinze appuntite, forbici a molla, porta aghi oftalmici, forbici chirurgiche e un supporto di aghi. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in un autoclave prima dell'uso. Utilizzare tamponi di cotone per la dissezione del grasso sottocutaneo.
   2. Caricare la siringa con la soluzione di anestesia prima di tenere premuto il mouse.
   3. Restringere l'animale applicando la forza dietro le orecchie contro la griglia della gabbia, tenendo più pelle possibile per mantenere il mouse immobile.
   4. Mantenere l'animale inclinato con la testa abbassata ed eseguire un'iniezione intraperitoneale della soluzione di anestesia, mantenendo la siringa ad un angolo di 45 gradi con il corpo del mouse.
   5. Verificare l'assenza di riflessi di ritiro del pedale, per valutare la profondità dell'anestesia.
   6. Rimuovere i capelli dall'arto posteriore destro utilizzando un rasoio elettrico. Utilizzare uno scrub per il sapone disinfettante al cloro per la preparazione della pelle. Utilizzare un tovagliolo di carta pulito per rimuovere il suds. Applicare uno scrub chirurgico clorhesidine e proteggere la zona della pelle con un drappo sterile prima di trasportare i topi nella suite sterile chirurgica.
   7. Posizionare l'animale in decubito dorsale e trattenerlo con i quattro arti divaripiati e fissati con nastro adesivo.
      AGGIORNAMENTO: Eseguire la procedura su un cuscinetto riscaldato per mantenere stabile la temperatura corporea dell'animale; la procedura chirurgica viene eseguita utilizzando un microscopio di dissezione a ingrandimento 10x o 20x.
   8. Applicare una soluzione antisettica clobroxidina utilizzando garza sterile per finalizzare la preparazione della pelle. Utilizzando una lama bisturi chirurgica numero 11 eseguire un'incisione cutanea di 1 cm sovrastante la coscia dell'arto posteriore destro.
   9. Grasso sottocutaneo contundente esponendo il fascio neurovascolare. Utilizzando le pinze appuntite, le forbici a molla e il supporto dell'ago oftalmico, aprono la membranosa diottuga il-femorale per esporre i vasi iliaci e femorali esterni distali.
   10. Dissezionare e separare i vasi (arteriosa e vena) dal nervo. Utilizzando un sutura in polipropilene 7.0 non assorbibile, legiano l'arteria e la vena iliache esterne distese e l'arteria e la vena femorale distale.
   11. Transettale il segmento dell'arteria ilio-femorale e le vene tra i nodi distale e prossimale con le forbici primaverili.
   12. Chiudere l'incisione con una sutura assorbibile (ad esempio, sutura Vicryl 5.0).
   13. Caricare la siringa con la soluzione antisederativa e utilizzare lo stesso metodo descritto in 1.2.3 e 1.2.4 per eseguire un'iniezione intraperitale della soluzione antisederativa.
3. Monitoraggio post-operatorio
   NOTA: Gli animali sono attentamente osservati ogni 15-20 min per assicurarsi che tutti gli animali si riprendano bene dall'anti-sedativo; animali anestesizzati non vengono mai lasciati incustoditi.
   1. Valutare il recupero dall'anestesia: 1) monitorare la velocità e la profondità della respirazione; 2) valutare i riflessi degli animali (posizione del pedale e degli occhi)
   2. Eseguire un'iniezione sottocutanea dell'analgesia post-operatoria ogni 8-12 h.
   3. Monitorare gli animali ogni giorno dopo l'intervento chirurgico che registra una breve descrizione dello stato di salute dell'animale e l'aspetto del sito chirurgico, assicurarsi che tutte le suture siano chiuse.
   4. Ri-sutura l'incisione, se si verifica la dehiscenza. In caso di esito negativo, applicare una pellicola di barriera cutanea sull'incisione per proteggere da urina, escrezioni fecali, attrito e taglio della pelle e per aiutare il processo di guarigione.

2. Valutazione dell'effetto angiogenico

NOTA: Dopo l'induzione dell'ischemia, applicare l'agente terapeutico nello studio e ottenere le seguenti procedure. Le misure intraprese in altri momenti sono descritte in dettaglio nella sezione corrispondente.

1. Immagini perfusione Laser Doppler
   1. Rimuovere i capelli da entrambe le zampe posteriori un giorno prima dell'analisi utilizzando un rasoio elettrico seguito da crema depilatoria.
   2. Anestetizza recitizzai i topi utilizzando la soluzione anestetica.
   3. Posizionare l'animale su una piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi per 5 min per garantire che la temperatura non cambi durante la procedura
   4. Posizionare l'animale in posizione supina con le gambe fissate in posizione estesa. Misurare la distanza tra le zampe e i piedi destro e sinistro per ogni animale poiché il posizionamento dell'animale deve essere simile ogni volta che la procedura deve essere ripetuta per seguire i cambiamenti nella perfusione dell'arto posteriore nel tempo.
   5. Iniziare ad acquisire dati utilizzando un imager perfusione Doppler laser.
   6. Al termine dell'acquisizione, ripristinare l'anestesia con la soluzione antisederativa.
   7. Aprire il software di analisi delle immagini e disegnare la regione di interesse (ROI) intorno all'arto posteriore ischemico e un ROI simile intorno all'arto posteriore non ischemico.
   8. Osservare i valori del flusso e determinare la perfusione come un rapporto tra la perfusione nell'arto ischemico a quella nell'arto non ischemico. Le variazioni del rapporto di perfusione vengono misurate nel tempo.
2. Analisi immunoistochimica e densità capillare
   1. Dopo l'anestesizzazione, sacrificare i topi con la lussazione cervicale.
   2. Per raccogliere i muscoli gastrocnemius di entrambe le gambe, in primo luogo, rimuovere la pelle da entrambe le zampe posteriori.
   3. Identificare il tendine d'Achille e separare il tendine dall'osso utilizzando un bisturi a 11 lama.
   4. Tenere il tendine d'Achille e separare il muscolo dalla tibia e dal perone fino all'articolazione del ginocchio con le forbici primaverili.
   5. Separare il bicipite femoris dal muscolo gastrocnemius.
   6. Utilizzare le forbici a molla per tagliare gli inserimenti dei muscoli gastrocnemius a livello articolare del ginocchio.
   7. Posizionare i muscoli gastrocnemius raccolti in un orientamento trasversale su un piccolo disco di sughero con l'aiuto del 10% di tragacanth.
   8. Agganciare i campioni in isopentane liquido raffreddato ad azoto e conservarli a -80 gradi fino alla sezionamento.
   9. Tagliare 7 sezioni di m degli esemplari muscolari su un criostato e montare su vetrini di vetro.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
   10. Fissare i vetrini di vetro in una bottiglia contenente acetone puro raffreddato (circa 50 mL) per 10 min, a -20 gradi centigradi.
   11. Aggiungere la perossia di idrogeno 0,3% diluita in metanolo (50 mL) per 30 min a temperatura ambiente.
   12. Lavare due volte in salina con buffer fosfato (PBS) (50 mL) per un totale di 10 min.
   13. Utilizzare una penna idrofobica intorno alle sezioni.
       NOTA: L'uso di una penna idrofobica consente di ridurre la quantità di soluzioni spese durante il protocollo. Per tutte le incubazioni utilizzare 100 l di tutte le soluzioni, per sezione.
   14. Applicare una soluzione di blocco del 5% di siero di coniglio in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
   15. Incubare gli esemplari per 1 h a temperatura ambiente con anticorpo monoclonale anti-CD31 diluito all'1:500 nell'1 % di albumina di siero bovino (BSA) in PBS.
   16. Lavare tre volte in PBS per un totale di 30 min.
   17. Aggiungere un anticorpo igG anti-ratto di coniglio biotinylato secondario a 1:200 in 1% BSA in PBS e 5% siero di coniglio per 30 min a temperatura ambiente.
   18. Lavare in PBS come prima e aggiungere etichettato complesso di perossidasi avidin-coniugato per 30 min a temperatura ambiente.
   19. Risciacquare 3 volte in PBS per 5 min e aggiungere diaminobenzidina (DAB) peroxidase kit substrato per altri 5 min.
   20. Controsta le sezioni con ematossilina per 10 s prima del montaggio.
   21. Misurare le densità capillari utilizzando un microscopio a campo luminoso verticale (cioè, numero di capillari per numero di miociti) in 2 diverse sezioni di 4 aree anatomiche distinte in ogni esemplare.
3. Perfusione agente di contrasto
   1. Anestetizza recitizzai i topi utilizzando la soluzione anestetica.
   2. Eseguire una laparotomia mediana utilizzando una lama bisturi numero 15.
   3. Esporre l'aorta addominale e la cavodale vena cava, dopo aver ritrattato lateralmente il piccolo intestino e utilizzando forbici primaverili.
   4. Inserire un catetere calibro 26 cranialmente nell'aorta addominale e un altro nella cava caudale nella stessa direzione.
   5. Cateteri sicuri in posizione utilizzando una sutura di seta 5/0 per eseguire una sutura di soggiorno.
   6. Lavare il sistema vascolare con una soluzione salina a 37 gradi centigradi contenente l'eparina (500 unità/100 mL) spinta nell'aorta addominale utilizzando una siringa da 10 mL. Continuare la perfusione delicata fino a quando non si vede una soluzione chiara che esce dal catetere posto all'interno della vena cava caudale.
      NOTA: Di solito sono necessari da 30 a 40 mL di una soluzione salina eparana per sciacquare il sistema vascolare di un ratto adulto.
   7. Somministrare una miscela di adenosina (1 mg/L) e papaverina (4 mg/L) per 2 min.
   8. Iniettare nel catetere aortico 10 mL di una miscela di 50% solfato di barium e 5% gelatina.
      NOTA: La soluzione deve essere mantenuta a 60 gradi centigradi per evitare l'ispessimento.
   9. Lasciare i topi a - 4 gradi centigradi per almeno 4 h, al fine di consentire al cast vascolare di solidificare.
   10. Rimuovere la pelle dal corpo inferiore di ogni mouse.
4. Diafonizzazione - Tecnica Spalteholz
   1. Fissare i topi per immersione in una soluzione di formaldeide 10% per almeno 72 h.
   2. Sbiancare i topi per immersione in una soluzione di perossido di idrogeno del 30% per 24 h.
   3. Disidratare i topi utilizzando la tecnica di sostituzione del congelamento. Questa metodologia consiste nel sottoporre i topi a passaggi successivi (in media quattro) di acetone puro a - 20 gradi centigradi per 24 h ciascuno.
   4. Chiarire i topi immergendoli in una soluzione contenente una miscela di benzoato 100% benzile e salicilato di metile 100% in una proporzione 3:5 (questa miscela è anche conosciuta come soluzione Spalteholz) ¹³.
   5. Lasciare i topi immersi nella soluzione Spalteholz all'interno di una camera a vuoto fino a quando non diventa diafano, che di solito richiede da 5 a 7 giorni.
   6. Sostituire la soluzione, se diventa scura prima che il campione diventi chiaro.
5. Quantificazione delle navi multilaterali
   1. Osservare i topi sospesi nella soluzione Spalteholz sotto traslazione utilizzando un microscopio stereotassico. Utilizzare pinze microchirurgiche per afferrare delicatamente e spostarlo.
   2. Fotografa interi arti utilizzando una fotocamera digitale collegata al microscopio.
   3. Ottenere intere fotografie dell'arto utilizzando il software appropriato.
   4. Eseguire una segmentazione manuale dei vasi collaterali evidenziandoli utilizzando il software appropriato.
      NOTA: I vasi collaterali sono definiti secondo la definizione di Longland, uno stelo definito, una zona intermedia e un rientrante, con un diametro compreso tra 20 e 300 m, escluse le arterie femorali, sapheno e popliteali e tutte le strutture venose.
   5. Definire i ROI in ogni topo nella stessa regione anatomica nell'adduttore, circostante e sotto l'occlusione chirurgica.
   6. Quantificare la densità dei recipienti collaterali (CVD) in ROI equivalenti pari al 20% della superficie totale degli arti. Il CVD viene calcolato come rapporto tra l'area vascolare e le aree ROI. Tutte le misurazioni della densità vengono eseguite utilizzando il software ImageJ.
      NOTA: Si presume che il valore CVD dell'arto non ischemico per ogni topo corrisponda al 100% per escludere le variazioni nelle procedure di anatomia, perfusione o diafonizzazione. La percentuale di CVD nell'arto ischemico è stata, quindi, calcolata rispetto a quella non ischemica.
   7. Determinare la percentuale di aumento CVD come differenza tra la percentuale di CVD tra gli arti ischemici e nonicimici.
6. Microdissezione laser di cattura dei capillari
   1. Dopo l'anestesizzazione, sacrificare i topi con la lussazione cervicale.
   2. Per raccogliere i muscoli gastrocnemius di entrambe le gambe, rimuovere la pelle dai topi entrambi gli arti posteriori.
   3. Identificare il tendine d'Achille e separare il tendine dall'osso utilizzando un bisturi a 11 lama.
   4. Tenere il tendine d'Achille e separare il muscolo dalla tibia e dal perone fino all'articolazione del ginocchio con le forbici primaverili.
   5. Separare il bicipite femoris dal muscolo gastrocnemius.
   6. Utilizzare le forbici a molla per tagliare gli inserimenti dei muscoli gastrocnemius a livello articolare del ginocchio.
   7. Posizionare i muscoli gastrocnemius raccolti in un orientamento trasversale su un piccolo disco di sughero con l'aiuto del 10 % tragacanth.
   8. Agganciare i campioni in isopentane liquido raffreddato ad azoto e conservarli a -80 gradi fino alla sezionamento.
   9. Tagliare su un criostat 12 sezioni m degli esemplari muscolari e montare su vetrini di vetro.
      NOTA: Per la protezione dell'RNA, prendere uno scivolo preraffreddato e toccare il retro del vetrino con il dito (guanti) per riscaldare solo la regione per posizionare la sezione. Trasferire la sezione dal coltello criostato toccando con la zona riscaldata e asciugare a -20 gradi centigradi nel criostato per 2-3 min. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
      1. Fissare i vetrini di vetro in una bottiglia contenente acetone puro raffreddato (circa 50 mL) per 5 min a -20 gradi centigradi e asciugarli ad aria.
      2. Utilizzare una penna idrofobica intorno alle sezioni.
         NOTA: L'uso della penna idrofobica aiuta a ridurre la quantità di soluzioni spese durante il protocollo. Per tutte le incubazioni utilizzare 100 l di tutte le soluzioni, per sezione.
      3. Reidratare con 2 M NaCl/PBS a 4 gradi centigradi e incubare i campioni durante la notte a 4 gradi con anticorpi monoclonali anti-CD31 ratto a 1:500 in 2M NaCl/PBS.
      4. Lavare due volte in 2M NaCl/PBS per un totale di 6 min.
      5. Aggiungere un anticorpo igG anti-ratto di coniglio biotinylato secondario a 1:200 in 2M NaCl/PBS e il 5% di siero di coniglio per 30 min a 4 gradi centigradi.
      6. Lavare in 2 M NaCl/PBS come prima e aggiungere etichettato complesso di perossidasi avidino per 30 min a 4 gradi centigradi.
      7. Sciacquare e aggiungere il kit substrato DAB perossidasi per 5 min.
      8. Disidratare le sezioni in etanolo freddo 90 % seguite dal 100 % di etanolo e lasciarle asciugare.
      9. Dissect 10 000 capillari per topi utilizzando un sistema di microdissezione laser dotato di un laser a stato solido pulsato 355 nm e catapultare i capillari sezionati in un adesivo-cap tubo di microfuge.
7. Estrazione di RNA, sintesi cDNA, pre-amplificazione e RT-PCR
   1. Isolare l'RNA totale dai capillari microotteded utilizzando un kit appropriato, l'RNA totale ottenuto è compreso tra 1,5-3 ng/L.
   2. Utilizzare un kit di sintesi cDNA per la sintesi e due cicli di pre-amplificazione, utilizzando i primer descritti nella Tabella 1.
   3. Eseguire RT-PCR per le stesse destinazioni descritte nel passaggio precedente. Utilizzare un programma composto da una fase di denaturazione iniziale a 95 gradi centigradi per 10 min, seguito da 50 cicli a 95 gradi centigradi per 15 s e a 60 gradi centigradi per 1 min.

Representative Results

Utilizzando il protocollo descritto, le cellule staminali mesenchymal del cordone ombelicale e le radiazioni ionizzanti a basse dosi (LDIR) sono state testate come terapie angiogeniche putative ^11,12. Le letture della perfusione di Laser Doppler sono state ottenute prima dell'induzione dell'ischemia e a tempi pre-specificati che vanno da subito dopo l'induzione dell'ischemia a 45 giorni dopo l'ischemia. Le letture perfusione di tessuti di Doppler laser sono state registrate come immagini codificate a colori, senza perfusioni visualizzate come blu scuro e il più alto livello di perfusione visualizzato come rosso.  Come mostrato nelle figure 2A e 3A e quantificato nelle figure 2B e 3B, è stata osservata una perdita completa di perfusione dell'arto posteriore in tutti i topi immediatamente dopo l'induzione dell'ischemia dell'arto posteriore, riproducibilità della tecnica per indurre l'ischemia dell'arto posteriore. È importante sottolineare che la gravità dell'ischemia è simile in tutti gli animali. Un ROI è stato disegnato intorno all'arto posteriore ischemico ed è stato disegnato un ROI simile intorno all'arto posteriore non ischemico per eseguire la quantificazione della perfusione. La perfusione è espressa come rapporto tra la perfusione nell'arto ischemico e quella dell'arto non ischemico. Le variazioni del rapporto di perfusione vengono misurate nel tempo.

L'immunohistochimica è stata eseguita tra i 15 e i 90 giorni dopo l'ischemia. La diafonizzazione è stata intrapresa tra 19 e 90 giorni dopo l'ischemia e la microdissezione capillare tra l'induzione post-ischemia di 45 e 70 giorni, assicurando che le diverse terapie pro-angiogeniche indussero in un effetto proangiogenico prolungato e prolungato.

La quantificazione dei capillari positivi CD31 nelle sezioni istologiche del muscolo gastrocnemio ha valutato la densità capillare e questo è stato espresso come il numero di capillari per numero di fibre muscolari. Come mostrato nella Figura4, la densità capillare era maggiore nell'ischemico rispetto all'arto non ischemico.

Per valutare la densità dei vasi collaterali, i topi sono stati diafonizzati ed è stato selezionato un ROI equivalente, corrispondente al 20 % dell'area degli arti. La densità dei vasi collaterali è costantemente aumentata nell'arto ischemico, quindi i dati relativi agli arti trattati e di controllo sono stati espressi come percentuale dell'aumento della densità del recipiente collaterale nell'arto ischemico relativamente a quello non ischemico (Figura5 ).

L'espressione dei geni pro-angiogenici da parte degli EC è stata analizzata dalla quantità RT-PCR delle cellule CD31-positive. Le trascrizioni per Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf e Met hanno mostrato una chiara variazione nell'espressione tra arti ischemici e non ischemici, esclusivamente nei topi esposti allo stimolo pro-angiogenico (Figura 6).

Figura 1 : Illustrazione schematica dell'anatomia della vascolatura degli arti posteriori del topo che mostra i siti di legatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : LDIR aumenta il recupero della perfusione. Dopo l'induzione chirurgica di HLI unilaterale, entrambi gli arti posteriori dei topi C57BL/6 sono stati simulati o irradiati con quattro frazioni giornaliere di 0,3Gy, in giorni consecutivi e lasciati recuperare. (A) Immagini di flusso Doppler laser rappresentative prima dell'HLI e nei giorni 0 (d0) e 15 (d15) post-HLI. (B) La valutazione quantitativa del flusso sanguigno espressa come rapporto tra ISC e limb NISC ha dimostrato una perfusione di sangue degli arti significativamente migliorata in topi irradiati contro quelli irradiati di finzione sia ai giorni 15 (d15) che 45 (d45) post-HLI. Le modifiche tra gruppi sono state valutate mediante misurazioni ripetute bidirezionali ANOVA, seguite da Bonferroni post-hoc test (n - 12 topi per gruppo). Mezzi: vengono visualizzati i mezzi seM.  P < 0.001; ns, non significativo. HLI, ischemia dell'arto posteriore; ISC, ischemico; NISC, non ischemica; Pre-HLI, prima dell'ischemia dell'arto posteriore. Adattato da ¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : cellule staminali mesenchymale del cordone ombelicale (UCX) aumentare il recupero della perfusione. UCX o il loro veicolo (come controllo) sono stati somministrati nel muscolo gastrocnemius ischemico 5 ore dopo l'induzione di HLI. (A) Immagini di flusso doppler laser rappresentative prima (PRE-HLI), immediatamente dopo (d0 POST-HLI) e a 7, 14 e 21 giorni di induzione post-HLI (d7 POST-HLI, d14 POST-HLI, d21 POST-HLI). (B) La valutazione quantitativa del flusso sanguigno espressa come rapporto tra ISC e arti NISC ha dimostrato una perfusione significativamente migliorata del sangue degli arti nelle cellule staminali mesenchymale trattate con gravidi trattati a 7, 14 e 21 giorni dopo LLI. 16 per ogni gruppo sperimentale; D7: t (22,69) - 4,26; 0,001 USD; la dimensione dell'effetto era 1,51 e la potenza 0,98; D14: t (30) - 4,7; 0,001 USD; la dimensione dell'effetto era 1,66 e la potenza di 0,99; D21: t (30) - 7,22; 0,001 USD; dimensione dell'effetto era 2,56 e potenza 0,99). HLI, ischemia dell'arto posteriore; ISC, ischemico; NISC, non ischemica. Adattato da¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : LDIR aumenta la densità capillare. (A) Sezioni rappresentative dei muscoli gastrocnemii ippici irradiati in finzione e irradiati al giorno 45 dopo l'HLI. I capillari e i miociti sono stati identificati rispettivamente da immunohistochimica e ematossinoina CD31. Barra della scala, 150 mm.(B) L'analisi quantitativa ha rivelato una maggiore densità capillare (capillari/miociti) nei muscoli gastrocnemius imiciti irradiati rispetto a quelli ischemici irradiati dalla famale nei giorni 15 e 45 post-HLI. L'ANOVA mista seguita dal test post hoc di Bonferroni è stata condotta con un fattore all'interno del soggetto dell'ISC e tra i fattori del giorno e dell'irradiazione (n. 6 topi per gruppo). Vengono visualizzati i singoli dati e i mezzi: SEM. P<0.001; ns, non significativo. ISC, ischemico; NISC, non ischemica. Adattato da¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: LDIR aumenta la densità collaterale. (A) Immagini illustrative di ROI selezionati per topi irradiati in porità e irradiati. Vengono mostrati gli arti ISC e NISC al giorno 90 post-HLI. Barra di scala, 300 mm.(B) I dati sono rappresentati come la percentuale di aumento CVD dell'arto ISC relativamente a quello NISC. Ai giorni 15 e 90 post-HLI, i topi irradiati presentavano un aumento significativamente più elevato della CVD (%) contro i topi con ammaraggio. ANOVA bidirezionale è stata condotta seguita da Bonferroni test post-hoc con un tra i fattori del soggetto del giorno e l'irradiazione (n. 6 topi per gruppo).  Vengono visualizzati i singoli dati e i mezzi: SEM. <0,05; P<0.001; ns, non significativo. HLI, ischemia dell'arto posteriore; ISC, ischemico; NISC, non ischemica. Adattato da¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : LDIR upregulates l'espressione di geni angiogenici nelle EC isolati da muscoli gastrocnemius ischemici irradiati. Dopo l'induzione chirurgica di HLI unilaterale, entrambe le zampe posteriori dei topi C57BL/6 sono state irradiate o irradiate con quattro frazioni giornaliere di 0,3Gy, in giorni consecutivi e lasciate recuperare. Al giorno 45 post-HLI, l'espressione di fattori pro-angiogenici e dei loro recettori è stata valutata da qRT-PCR esclusivamente su EC. Le sezioni muscolari gastrocnemius sono state macchiate per CD31. Le singole cellule endoteliali CD31 sono state visualizzate, sezionate e isolate utilizzando un sistema di microdissezione laser. Ogni barra rappresenta l'espressione genica relativa in un animale. Le barre bianche e grigie rappresentano rispettivamente topi irradiati e irradiati in finta. I valori sono stati normalizzati a 18S per ottenere livelli di espressione relativi. I risultati espressi come cambiamenti di piegatura log2 tra campioni ischemici e non ischemici hanno dimostrato l'abbondanza relativa delle trascrizioni nei topi irradiati; al contrario, si osserva un down-regulation nei topi ammalati. Adattato da¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Vegfr1_R (5'-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGCTT-3');

Vegfr2_F (5'-AGGCCTGAGTCCAACTACACA-3');

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Tabella 1: Primer utilizzati per lo studio.

Discussion

I modelli Murine di CLI sono per lo più costituiti in legatura dell'arteria femorale appena distale all'origine della profunda femoris ^4,5,6,7,8,9. Questo ha dimostrato di lasciare intatta la maggior parte della circolazione collaterale, che ripristina il flusso sanguigno all'arto entro 7 giorni ⁹. La rimozione del letto collaterale può essere ottenuta mediante escissione dell'arteria femorale. Tuttavia, fino a un terzo del flusso sanguigno originale può essere ripristinato non appena 7 giorni dopo la procedura, dato che la maggior parte dei vasi collaterali derivano dall'arteria iliaca interna ⁷. Lejay et al hanno proposto legature sequenziali con una seconda legatura eseguita sull'arteria iliaca comune, riducendo di fatto la perfusione collaterale fornita dall'arteria iliaca interna ⁴. I passaggi critici all'interno di questo protocollo includono non solo l'identificazione dell'arteria iliaca esterna appena sopra il legamento inguinale, ma anche la legatura e l'escissione delle arterie e vene esterne distali, che serve a un duplice scopo: aumentare la gravità dell'ischemia e migliorare la riproducibilità tecnica del modello, poiché l'esposizione dell'arteria femorale da sola spesso provoca strappi della vena.

Una limitazione di questa tecnica è l'interruzione acuta del flusso sanguigno all'arto, che differisce dal processo prolungato associato all'accumulo di placca aterosclerotica che porta alla stenosi arteriosa e all'occlusione. Ancora, riduzione del flusso sanguigno era presente bene dopo 2 settimane, il momento stabilito per la diagnosi di ischemia cronica. Inoltre, la collateralizzazione è stata aumentata con l'insulto ischemico da solo, che imita il processo di formazione collaterale osservato negli arti cronici ischemici.

La neovascolarizzazione degli arti ischemici comporta un complesso gioco di eventi biologici, vale a dire l'angiogenesi e l'arteriogenesi. Questo protocollo include una varietà di analisi che hanno valutato l'interferenza delle terapie angiogeniche putative sulla germogliazione angiogenica (densità dei vasi capillari) e sullo sviluppo di vasi collaterali (arteriogenesi), il meccanismo più importante nella tolleranza umana all'ischemia dell'arto inferiore. Contemporaneamente, il laser Doppler viene utilizzato per svelare la funzione di questi vasi nuovi o allargati, e per la prima volta la microdissezione laser dei capillari viene utilizzata per raccogliere Le EC che rivelano i meccanismi molecolari alla base del recupero funzionale. Questo protocollo produce un modello animale riproducibile in grado di imitare gli effetti della CLI uno standard di test quando gli animali vengono trattati con possibili terapie angiogeniche che potrebbero essere applicate in un contesto clinico in futuro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7500 Fast Real-Time PCR	Applied Biosystems		Instrument
Acetone	Merk	1000141000	Reagent; Caution - highly flammable
Adenosine	Valdepharm		Reagent
Atipamezole	OrionPharma		Reagent
Barium sulphate (Micropaque)	Guebert	8671404 (ref. Infarmed)	Reagent
Buprenorphine	RichterPharma		Reagent
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope	Carl Zeiss Microscopy, Germany		Instrument
cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit	Qiagen	7335730	Reagent
Cryostat Leica CM	Leica Microsystems	3050S	Instrument
DAB peroxidase substrate kit	DAKO;Vector Laboratories	K3468	Reagent
hydrogen peroxidase	Merk	1072090250	Reagent; Caution - nocif
hydrophobic pen	Dako	411121	Reagent; Caution - toxic
Ketamidor	Richterpharma	CN:580393,7 630/01/12 Dfvf	Reagent
Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR	MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK	5710	Instrument
Leica DM2500 upright brightfield microscope	Leica Microsystems		Instrument
Medetor	Virbac	037/01/07RFVPT	Reagent
methanol	VWR	UN1230	Reagent; Caution - toxic and highly flammable
Papaverine	Labesfal		Reagent
Pentano Isso	Merk	1060561000	Reagent; Caution - highly flammable
Power SYBR® Green	Applied Biosystems	4309155	Reagent
Purified rat anti-mouse CD31	Pharmingen	550274	Reagent
RNeasy Micro kit	Qiagen	74004	Reagent
Surgic-Pro 6.0	Medtronic (Coviden)	VP733X	Suture
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG)	Vectastain ABC kit; Vector Laboratories	PK-4004	Reagent
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0	Medtronic (Covidien)	UL202/ UL101	Suture
Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System	Carl Zeiss Microscopy, Germany	1023290916	Instrument
Stereotaxic microscope	Carl Zeiss Microscopy, Germany		Instrument
Digital camera	Linux		Instrument