Summary
ここで、重要な後肢虚血実験モデルを提示し、その後に血管新生療法の有効性を評価する機能的、血管学的および分子試験の電池が続く。
Abstract
臨界四肢虚血(CLI)は、下肢切断のリスクが高い重篤な状態である。再血管化はゴールドスタンダード療法であるにもかかわらず、かなりの数のCLI患者は外科的または血管内血管血管の再形成に適していない。血管新生療法は、これらの患者のためのオプションとして出現していますが、現在調査中です。ヒトに適用する前に、これらの治療法は動物モデルでテストされなければならず、そのメカニズムを明確に理解する必要があります。後肢虚血(HLI)の動物モデルは、マウスにおける遠位外腸骨および大腿動脈および静脈のライゲーションおよび切除によって開発された。虚血および造語血管新生療法の効果を機能的、血管学的および分子レベルで評価するために、包括的なテストパネルが組み立てられました。レーザードップラーは、灌流の流量測定および機能評価に使用されました。組織応答は、胃腸筋の組織学的セクション上の抗CD31抗体で染色した後の毛細血管密度の分析とダイアフォニング後の担保血管密度の測定によって評価された。血管新生遺伝子の発現は、マウスの胃腸筋からのレーザー捕捉微分解後に内皮細胞(IC)において排他的に選択された血管新生因子を標的とするRT-PCRにより定量した。これらの方法は、虚血性四肢と非虚血性四肢と治療されていない四肢の間の違いを同定する際に敏感であった。このプロトコルは、CLIの再現可能なモデルと血管新生療法をテストするためのフレームワークを提供します。
Introduction
末梢動脈疾患(PAD)は主に下肢に影響を与える。PADは、アテローム性動脈硬化によって引き起こされ、下肢1の血流に厳しい制限を引き起こす可能性のある動脈閉塞である。断続的な閉塞はPADの最初の症状であり、歩行時の筋肉痛を指す。CLIはPADの最も重篤な段階であり、虚血性休息痛、潰瘍または壊疽2を示す患者で診断される。CLI患者は切断のリスクが高く、特に未治療の場合は3.下肢血管再建(開開手術または血管内処置のいずれか)は、現在、四肢の救済を達成する唯一の方法です。しかしながら、CLI患者の約30%は、病変の位置、動脈閉塞および広範な併存のパターンを含む理由から、これらの処置には適していない4、5。したがって、これらのそうでなければ治療不可能な患者に対しては新しい治療法が必要であり、血管新生の促進はより厳しい調査の下で戦略である。
ヒトでの試験の前に、生体内の新しい治療法の有効性と安全性を動物モデルで考慮する必要があります。いくつかのモデルは、主にマウス6、7、8、9、10の後肢虚血(HLI)を誘導することによって、CLIの研究のために開発された。しかし、これらのモデルは、ライゲーションおよび/または切除された動脈の性質、周囲の静脈および神経も解剖されるかどうかを含むいくつかの側面で異なる6、7、8、 9,10.これらの態様を組み合わせると、各動物の虚血再灌流損傷の重症度に影響を与え、結果の比較が困難になります。したがって、虚血を誘発する手順と異なる標的の評価を標準化し、所定の血管新生療法が有効であるかどうかを評価する効果的なプロトコルを開発することが重要である。これらすべての側面をカバーするように設計された実験プロトコルは、血管新生療法がそれらの効果を発揮するメカニズムと、それぞれの結果における有効性の尺度を包括的に理解することを提供するであろう。私たちのチームが最近発表した2つの異なる作品は、治療血管新生を誘導する異なるアプローチが、この中でより詳細に説明される同じプロトコルを使用して評価された良い例11、12です。プロトコル。
このプロトコルの全体的な目標は、CLIの効果を模倣し、プタジアル血管新生の機能的、刺激的および分子的効果の包括的な評価のための実験基盤を築くことができる再現可能な実験モデルを記述することですエージェント。
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Protocol
すべての動物の手順は、指令2010/63/EUに準拠しており、機関動物福祉機関によって承認され、DGAV、動物保護のためのポルトガルの管轄当局(ライセンス番号023861/2013)によってライセンスされています
注意:プロトコルで使用される化学物質のいくつかは有毒で有害です。適切な安全対策や身の保護具(手袋、ラボコート、フルレングスパンツ、クローズドトーシューズ)をご使用ください。
1. 後肢虚血のマウスモデル
注:すべての実験は、22週齢のC57BL/6雌マウスで行われる。
- ソリューションの準備
-
麻酔液の調製
注:この麻酔の組み合わせ(メデトミジンとケタミン)は、最大30分の固定化と15分の外科窓を提供します。効果は、アティパメゾールの投与によって元に戻され得る。- クリーンな1ccシリンジで、1mLのメデトミジン(体重1mg/Kg)を引き出し、正確な測定のために気泡を除去し、15 mLファルコンチューブに追加します。
- クリーンな1ccシリンジで、ケタミンの0.75 mL(体重75mg/Kg)を引き出し、正確な測定のために気泡を除去し、メデトミジンを含む15 mLファルコンチューブに追加します。
- 無菌生理生理生理生の8.25 mL(0.9%NaCl)を加え、麻酔液の10mLを得る。
- 化合物の名前、混合日付と有効期限を持つチューブを識別します。
- 暗闇の中で4°Cに保管してください。
-
鎮静剤溶液の調製
- クリーンな1ccシリンジで、1mLのアティパメゾール(5mg/Kg体重)を引き出し、正確な測定のために気泡を除去し、15 mLファルコンチューブに追加します。
- 生殖不能生理生理生理生理生の9 mL(0.9%NaCl)を加え、10mLの再生液を得る。
- 化合物の名前、混合日付と有効期限を持つチューブを識別します。
- 暗闇の中で4°Cに保管してください。
-
術後鎮薬ソリューションの準備
- クリーンな1ccシリンジで、0.5mLのブプレノルフィン(100 μL/15-30gの体重)を引き出し、正確な測定のために気泡を除去し、15 mLファルコンチューブに追加します。
- 無菌生理生理生理生理生(0.9%NaCl)の9.5 mLを加え、鎮鎮薬溶液の10mLを得る。
- 化合物の名前、混合日付と有効期限を持つチューブを識別します。
- 暗闇の中で4°Cに保管してください。
-
麻酔液の調製
- 後肢虚血の外科的誘導
- この介入に必要な外科用具:尖った鉗子、ばねはさみ、眼科針ホルダー、外科はさみおよび針のホールダー。使用前にオートクレーブ内のすべての外科用具を殺菌します。皮下脂肪の解剖には綿棒を使用してください。
- マウスを保持する前に、麻酔溶液で注射器をロードします。
- ケージのグリッドに対して耳の後ろに力を加え、マウスを不動に保つためにできるだけ多くの皮膚を保持することによって、動物を拘束します。
- 動物を頭を下げて傾け、麻酔液の上皮注射を行い、注射器をマウスの体と45°の角度で保ちます。
- ペダル離脱反射の欠如をチェックし、麻酔の深さを評価する。
- 電気かき師を使って右後肢から髪を取り除きます。皮膚の調製にはクロルヘキシジン消毒石鹸スクラブを使用してください。清潔なペーパータオルを使用して、汚れを取り除きます。クロルヘキシジン外科スクラブを適用し、外科滅菌スイートにマウスを輸送する前に、無菌ドレープで皮膚領域を保護します。
- 動物を後部のデキュビタスに入れ、4本の手足を離してテープで固定して拘束します。
注意:動物の体温を安定させるために加熱されたパッド上で手順を実行します。外科処置は10xまたは20倍の倍率の解剖顕微鏡を使用して行われる。 - 無菌ガーゼを使用してクロルヘキシジン消毒液を塗布し、皮膚製剤を完成させます。番号11外科メスブレードを使用して、右後肢の大腿を覆う1cmの皮膚切開を行う。
- 神経血管束を露出する鈍い解剖皮脂肪。尖った鉗子、ばねはさみおよび眼科針ホルダーを使用して、膜外性腸骨鞘を開き、遠位外腸および大腿骨血管を露出させる。
- 血管(動脈と静脈)を解剖し、神経から分離する。7.0非吸収性ポリプロピレン縫合糸を使用して遠位外腸骨動脈および静脈および遠位大腿動脈および静脈を液化する。
- 遠位と近位の結び目の間のイリオ大腿動脈と静脈のセグメントを春のはさみで透過します。
- 吸収性縫合糸(例えば、5.0ビクリル縫合糸)で切開部を閉じます。
- 抗鎮静液で注射器をロードし、1.2.3および1.2.4で詳述されている同じ方法を使用して、鎮静液の米皮内注射を行います。
- 術後モニタリング
注:動物は慎重にすべての動物が抗鎮静剤からよく回復することを確認するために15〜20分ごとに観察されます。麻酔動物は決して放置されない。- 麻酔からの回復を評価する:1)呼吸の速度と深さを監視します。2)動物の反射神経(ペダルと目の位置)を評価します。
- 術後鎮鎮薬の皮下注射を8〜12時間毎に行う。
- 手術後毎日動物を監視し、動物の健康状態と手術部位の外観の簡単な説明を記録し、すべての縫合糸が閉じていることを確認します。
- 脱面が起こった場合は、切開部を再縫合する。失敗した場合は、尿、産前排泄物、皮膚の摩擦およびせん断から保護し、治癒プロセスを助けるために切開部に皮膚バリアフィルムを適用します。
2. 血管新生効果の評価
注:虚血誘導後、治療剤を試験に適用し、以下の手順を達成する。他の時点で実行される手順については、対応するセクションの下に詳細に説明します。
- レーザードップラー灌流イメージング
- 電気的な剃毛を使用して分析の前日に両方の後肢から髪を取り除き、その後に脱毛クリームを使用します。
- 麻酔液を用いてマウスを麻酔する。
- 37°Cの加熱パッドに動物を5分間置き、手順中に温度が変化しないようにします。
- 足を長い位置に固定して、動物をサフィンの位置に置きます。動物の位置は、時間の経過に応じた後肢灌流の変化に従うために手順を繰り返す必要があるときはいつでも同様でなければならないので、各動物の右と左の足の間の距離を測定します。
- レーザードップラー灌流イメージャーを使用してデータの取得を開始します。
- 取得が完了したら、鎮静剤溶液で麻酔を元に戻します。
- 画像解析ソフトウェアを開き、虚血後肢の周囲に関心領域(ROI)を描画し、非虚血性後肢の周りに同等のROIを描画します。
- フラックス値を観察し、虚血性四肢の灌流の比率として非虚血性四肢の灌流の比率として灌流を決定します。灌流率の変化は、時間の経過とともに測定されます。
- 免疫組織化学と毛細血管密度分析
- 麻酔後、子宮頸部脱臼によりマウスを犠牲にする。
- 両足の胃筋肉を収穫するには、まず、両方の後肢から皮膚を取り除きます。
- アキレス腱を同定し、11枚のメスを使用して腱を骨から分離する。
- アキレス腱を保持し、脛骨と脛骨から春のはさみで膝関節まで筋肉を分離します。
- 二頭筋の大腿骨を胃筋から分離する。
- スプリングハサミを使用して、膝関節レベルで胃腸筋の挿入をカットします。
- 10%のトラガカンスの助けを借りて、小さなコルクディスクの横方向に収穫された胃腸の筋肉を置きます。
- スナップは、液体窒素冷却イオペンタンで試料を凍結し、断断するまで-80 °Cでそれらを保存します。
- クライオスタット上の筋肉標本の7 μmのセクションを切断し、ガラススライドに取り付けます。
注: プロトコルはここで一時停止できます。 - 冷却された純粋なアセトン(約50 mL)を含むボトルのガラススライドを-20°Cで10分間固定します。
- メタノール(50mL)で0.3%希釈した水素ペルオキシダーゼを室温で30分間添加します。
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS)(50 mL)で2回、合計10分間洗浄します。
- セクションの周りに疎水性ペンを使用してください。
注:疎水性ペンを使用すると、プロトコル中に費やされるソリューションの量を減らします。すべてのインキュベーションでは、セクションごとに 100 μL のすべてのソリューションを使用します。 - 室温で30分間PBSに5%ウサギ血清の遮断液を塗布する。
- PBSで1%ウシ血清アルブミン(BSA)で1:500で希釈した抗CD31ラットモノクローナル抗体で室温で1時間の試料をインキュベートする。
- PBSで3回、合計30分間洗浄します。
- PBSでは1%BSAで1:200、室温で30分間5%のウサギ血清で1:200で二次ビオチン化ウサギ抗ラットIgG抗体を添加する。
- 以前のようにPBSで洗浄し、室温で30分間ラベル付きアビジン結合ペルオキシダーゼ複合体を追加します。
- PBSで3回5分間リンスし、さらに5分間ジアミノベンジジン(DAB)ペルオキシダーゼ基板キットを添加する。
- 取り付ける前に10sのヘマトキシリンでセクションをカウンターステインします。
- 各標本の4つの異なる解剖学的領域の2つの異なるセクションで直立した明視野顕微鏡(すなわち、筋細胞数当たりの毛細血管数)を使用して毛細血管密度を測定する。
- 造影剤灌流
- 麻酔液を用いてマウスを麻酔する。
- 番号15メスブレードを使用して中央値の腹腔内剥出術を行う。
- 腹部大動脈と口腔静脈カバを露出, 横に小腸を撤回し、春のはさみを使用した後.
- 1つの26ゲージのカテーテルを腹部大動脈に、もう1つを同じ方向に口腔内に挿入します。
- 5/0シルク縫合糸を使用してカテーテルを固定し、ステイ縫合糸を実行します。
- 10mL注射器を使用して腹部大動脈に押し込まれたヘパリン(500単位/100mL)を含む37°C生理生理膜溶液で血管系を洗浄する。カテーテルからカテーテルから透明な溶液が出てくるのが見えるまで、穏やかな灌流を続けます。
注:通常、ヘパリン化生理液の30~40mLは、成虫ラットの血管系をすすぐために必要とされる。 - アデノシン(1mg/L)とパパベリン(4mg/L)の混合物を2分間投与する。
- 50%の硫酸バリウムと5%のゼラチンの混合物の大動脈カテーテル10 mLに注入する。
注:溶液は、厚みを避けるために60 °Cに保つ必要があります。 - マウスを少なくとも4時間-4°Cに残し、血管キャストが固化できるようにする。
- 各マウスの下半身から皮膚を取り除きます。
- ダイアフォニゼーション-スパテホルツ技術
- マウスを少なくとも72時間10%ホルムアルデヒド溶液に浸漬して固定する。
- マウスを24時間30%過酸化水素溶液に浸漬して漂白する。
- 凍結置換技術を使用してマウスを脱水する。この方法論は、マウスを24時間20°Cの純粋なアセトンの連続した通路(平均4回)に送付することになる。
- マウスを3:5の割合で100%ベンジル安息香酸と100%のメチルサリチル酸塩の混合物を含む溶液に浸漬することによってマウスを明らかにする(この混合物は、スパテホルツ溶液としても知られている)13。
- マウスを真空室内に入れたままにしておき、通常5~7日かかります。
- 試料が明らかになる前に暗くなったら、溶液を交換してください。
- 担保容器定量
- 立体顕微鏡を用いて経過化下でスパテホルツ溶液に懸濁したマウスを観察する。マイクロ外科鉗子を使用して、穏やかに把握し、移動します。
- 顕微鏡に接続されたデジタルカメラを使用して、四肢全体を撮影します。
- 適切なソフトウェアを使用して、四肢の写真全体を取得します。
- 適切なソフトウェアを使用してそれらを強調表示することにより、担保容器の手動セグメンテーションを実行します。
注:担保容器は、大腿骨、サフェノースおよびポピライト動脈およびすべての静脈構造を除く20〜300 μmの間の直径で、ロングランドの定義、定義された茎、中間地帯、および再入発性に従って定義される。 - 付加体、外科的閉塞の周囲および下の同じ解剖学的領域のすべてのマウスでROIを定義する。
- 全四肢面積の20%に相当する同等のROIで担保容器密度(CVD)を定量化する。CVD は、血管領域と ROI 領域の比率として計算されます。すべての密度測定はImageJソフトウェアを使用して行われます。
注:各マウスの非虚血性四肢のCVD値は、解剖学、灌流またはダイアフォネーション手順の変動を除外するために100%に相当すると仮定される。したがって、虚血性四肢のCVDパーセンテージは、非虚血性の1に対して計算された。 - 虚血性四肢と非虚血性肢の CVD パーセンテージの差として、CVD 増加の割合を決定します。
- 毛細血管のレーザー捕捉微細解剖
- 麻酔後、子宮頸部脱臼によりマウスを犠牲にする。
- 両足の胃筋肉を収穫するには、マウスの両方の後肢から皮膚を取り除く。
- アキレス腱を同定し、11枚のメスを使用して腱を骨から分離する。
- アキレス腱を保持し、脛骨と脛骨から春のはさみで膝関節まで筋肉を分離します。
- 二頭筋の大腿骨を胃筋から分離する。
- スプリングハサミを使用して、膝関節レベルで胃腸筋の挿入をカットします。
- 10%のトラガカンスの助けを借りて、小さなコルクディスクの横方向に収穫された胃腸の筋肉を置きます。
- スナップは、液体窒素冷却イオペンタンで試料を凍結し、断断するまで-80 °Cでそれらを保存します。
- 筋肉標本のクライオスタット12 μmセクションに切断し、ガラススライドに取り付けます。
注:RNA保護のために、事前に冷却されたスライドを取り、指(手袋)でスライドの裏側をタッチして、セクションを配置するための領域のみを暖めます。クライオスタットナイフから切り取りセクションを温めた領域に触れ、クライオスタットで-20°Cで2〜3分間乾燥させます。プロトコルはここで一時停止できます。- 冷却された純粋なアセトン(約50 mL)を含むボトルのガラススライドを-20°Cで5分間固定し、空気乾燥させます。
- セクションの周りに疎水性ペンを使用してください。
注:疎水性ペンの使用は、プロトコル中に費やされる溶液の量を減らすのに役立ちます。すべてのインキュベーションでは、セクションごとに 100 μL のすべてのソリューションを使用します。 - 2M NaCl/PBSを4°Cで水分補給し、2M NaCl/PBSで1:500の抗CD31ラットモノクローナル抗体で4°Cで一晩試料をインキュベートします。
- 2M NaCl/PBSで2回洗浄し、合計6分間洗浄します。
- 2M NaCl/PBSに1:200で二次ビオチン化ウサギ抗ラットIgG抗体を添加し、4°Cで30分間5%のウサギ血清を添加する。
- 以前のように2M NaCl/PBSで洗浄し、4°Cで30分間ラベル付きアビジン結合ペルオキシダーゼ複合体を追加します。
- DABペルオキシダーゼ基板キットを5分間すすいで添加します。
- 氷冷90%エタノールの切片を100%エタノールで脱水し、乾燥させたままにしておきます。
- パルス固体355nmレーザーを搭載したレーザー微細解剖システムを用いてマウス1000本の毛細血管を解剖し、解剖した毛細血管をマイクロフュージチューブの粘着キャップにカタパルトする。
- RNA抽出、cDNA合成、プリアンプ、RT-PCR
- 適切なキットを用いて微小分化キャピラリーから全RNAを単離し、得られた全RNAは1.5〜3ng/μLの間である。
- cDNA合成キットを使用して合成し、2回の予備増幅を行い、表1に記載のプライマーを使用します。
- 前の手順で説明したのと同じターゲットに対して RT-PCR を実行します。最初の脱退ステップを95°Cで10分間、95°Cで15s、60°Cで1分間50サイクルで行うプログラムを使用します。
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Representative Results
記載されたプロトコルを用いて、臍帯間葉系幹細胞および低用量電分放射線(LDIR)は、栄養性血管新生療法11,12として試験した。レーザードップラー灌流の読み取り値は、虚血誘導の前および虚血誘発直後から虚血後45日までの事前に指定された時点で得られた。レーザードップラーによる組織灌流測定値は色分けされた画像として記録され、灌流は濃い青色で表示され、最も高い灌流レベルは赤で表示された。 図2A及び図2B及び3Bで定量化した図2A及び図3Aに示すように、後肢虚血の誘導直後に全てのマウスにおいて後肢灌流の完全な喪失が認められた。後肢虚血を誘導する技術の再現性。重要なことに、虚血の重症度はすべての動物で類似している。虚血性後肢の周りにROIが描かれ、非虚血性後肢の周りに同等のROIが描かれ、灌流の定量化を行った。灌流は、虚血性四肢における灌流の比と非虚血性肢の灌流の比率として表される。灌流率の変化は、時間の経過とともに測定されます。
免疫組織化学は虚血後15日から90日の間に行われた。異方化は、虚血後19日から90日間の間に行われ、虚血後70日間の微小切除は、異なる血管新生療法が持続的かつ長期にわたる前駆器効果を引き起こしたことを保証した。
胃筋の組織学的セクションにおけるCD31陽性毛細血管の定量化は毛細血管密度を評価し、これは筋線維数当たりの毛細血管数として表された。図4に示すように、毛細血管密度は虚血性四肢と非虚血性四肢において大きかった。
担保血管密度を評価するために、マウスをダイフォニゼーションし、同等のROI(四肢面積の20%に相当)を定量するために選択した。虚血性四肢における担保血管密度は一貫して増加しているので、処理および制御四肢に関するデータは、虚血性四肢に対する側因性血管密度増加の割合として表された(図5)).
ICによる血管新生遺伝子の発現をCD31陽性細胞の定量RT-PCRにより分析した。Vegfr2、Vegfr1、Fgf2、Angpt2、Pdgfc、Tgfb2、Hgf、およびMetの転写物は、虚血性および非虚血性四肢間の発現に明らかなばらつきを示した(図6)。
図 1:ライゲーション部位を示すマウス後肢血管系の解剖学の概略図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: LDIR は灌流回復を増加させます。一方的なHLIの外科的誘導後、C57BL/6マウスの両方の後肢を、0.3Gyの4つの毎日の分画で照射または照射し、連続して回復させ、回復させた。(A)代表的なレーザードップラー流量画像はHLI前、及び0日目(d0)および15(d15)ポストHLI誘導時に。(B)NISC四肢に対するISCの比率として表される血流の定量的評価は、照射マウス対シャム照射マウスの両方で有意に増強された四肢の灌流を有意に高めた四肢の灌流を示した(d15)および45(d45)ポストHLI。グループ間の変化は、双方向の繰り返し測定ANOVAに続いてボンフェローニポストホック試験(n=12マウス/グループ)によって評価された。平均±SEMが示されている。 P < 0.001;ns は、重要ではありません。HLI, 後肢虚血;ISC, 虚血;NISC, 非虚血;後肢虚血の前に、HLI前。11から適応.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 臍帯間葉系幹細胞(UCX)灌流回復を増加させる。UCXまたはその車両(対照として)は、HLI誘導の5時間後に虚血性胃腸筋に投与した。(A)代表的なレーザードップラーフロー画像の前(PRE-HLI)、直後(d0 POST-HLI)、および7、14および21日後のHLI誘導(d7 POST-HLI、d14 POST-HLI、d21 POST-HLI)。(B)ISCとNISC四肢の比率として発現した血流の定量的評価は、臍帯間葉系幹細胞における四肢輸血を有意に増強し、HLI後7、14及び21日目に処置したマウスを示した。(各実験グループの n=16;D7: t (22.69) = 4.26;P 0.001;効果のサイズは1.51とパワー0.98でした。D14: t (30) = 4.7;P 0.001;効果のサイズは1.66とパワー0.99でした。D21: t (30) = 7.22;P 0.001;効果サイズは2.56、パワーは0.99)。HLI, 後肢虚血;ISC, 虚血;NISC、非虚血。11から適応.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: LDIRは毛細血管密度を増加させる。(A) 45日後HLI日目にシャム照射および照射された虚血性胃腸筋からの代表的なセクション。毛細血管および筋細胞は、それぞれCD31免疫組織化学およびヘマトキシリンによって同定された。スケールバー,150 mm.(B) 定量分析では、照射された虚血性胃腸筋における毛細血管密度(毛細血管/筋細胞)の増加が、15日目および45日目の虚血性筋肉と比較して明らかになった。続いてボンフェローニポストホック試験を行った混合ANOVAは、ISCの被験者内因子および日次および照射の被験者間因子(群当たりn=6マウス)で行った。個々のデータおよび平均±SEMが示される。P<0.001;ns は、重要ではありません。ISC, 虚血;NISC、非虚血。11から適応.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:LDIR は担保密度を増加させます。(A) シャム照射および照射マウスに対する選択されたROIの図示図。90日後の90日目のISCおよびNISCの手足が示される。スケールバー、300 mm(B) データは、NISCに対するISC四肢のCVD増加のパーセンテージとして表されます。15日目および90日目のHLIでは、照射されたマウスは有意に高いCVD増加(%)を示した対シャム照射マウス。双方向分散分析を行い、その後、ボンフェローニのポストホック試験を行い、1日の被験者因子と照射(群当たりn=6マウス)を用いた。 個々のデータおよび平均±SEMが示される。*P<0.05;P<0.001;ns は、重要ではありません。HLI, 後肢虚血;ISC, 虚血;NISC、非虚血。11から適応.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: LDIRは、照射された虚血性胃腸筋から単離されたICにおける血管新生遺伝子の発現を調節する。一方的なHLIの外科的誘導後、C57BL/6マウスの両方の後肢を、0.3Gyの4つの毎日の分画でシャム照射または照射し、連続して回復させ、回復させた。45日後HLIでは、血管新生因子およびその受容体の発現を、QRT-PCRによってのみIC上で評価した。胃腸筋切片はCD31について染色した。個々の内皮CD31+細胞をレーザー顕微鏡解剖システムを用いて可視化、解剖、および単離した。各バーは、1匹の動物における相対遺伝子発現を表す。白と灰色のバーは、それぞれシャム照射および照射マウスを表します。値は、相対式レベルを得るために18Sに正規化されました。虚血性サンプルと非虚血サンプルの間のlog2倍の変化として表される結果は、照射されたマウスにおける転写物の相対的な存在量を示した。対照的に、シャム照射マウスではダウンレギュレーションが観察される。11から適応.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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表 1: スタディに使用するプライマー。
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Discussion
CLIのマウスモデルは、主にプロファンダフェモリス4、5、6、7、8、9の起源に遠位の大腿動脈のライゲーションで構成されている。これは、7日以内に四肢への血流を回復させる担保循環のほとんどをそのまま残すことを示しています 9. 担保ベッドの除去は、大腿動脈の切除によって達成することができる。しかし、ほとんどの側腸管血管が内部腸管動脈7から生じることを考えると、元の血流の3分の1までは、処置の7日後に直ちに回復することができる。Lejayらは、共通の腸内膜動脈に対して行われる第2のライゲーションを有する順次ライゲーションを提案し、内部腸内腸動脈4によって提供される担保灌流を効果的に減少する。このプロトコル内の重要なステップは、鼠径靭帯のすぐ上の外腸骨動脈の同定だけでなく、二重の目的を果たす遠位外腸および大腿動脈および静脈のライゲーションおよび切除も含まれる。虚血の重症度を高めるだけでなく、モデルの技術的な再現性を向上させる, 大腿動脈の暴露だけで、多くの場合、静脈の裂傷をもたらす.
この技術の1つの制限は、動脈狭窄および閉塞につながるアテローム硬化性プラークの蓄積に関連する長引くプロセスとは異なり、四肢への血流の急激な中断である。それでも、血流の低下は2週間後に十分に存在し、慢性虚血の診断のための確立された時点であった。また、虚血性侮辱だけでは、慢性虚血性四肢で観察される担保形成の過程を模倣する担保化が増加した。
虚血性四肢の新生血管形成は、生物学的事象、すなわち血管新生および動脈新生の複雑な相互作用を伴う。このプロトコルには、血管新芽(毛細血管密度)および側因性血管発達(動脈生発生)に対する造影血管新生療法の干渉を評価した様々なアッセイが含まれており、ヒト耐性における最も重要なメカニズムである。下肢虚血に。同時に、レーザードップラーは、これらの新しいまたは拡大された容器の機能を明らかにするために使用され、毛細血管の初めてのレーザー微細解剖のために機能的回復の根本となる分子機構を開示するICを収集するために使用されます。このプロトコルは、将来的に臨床コンテキストで適用できる可能性のある血管新生治療で動物が治療される場合に、CLIの効果を模倣することができる再現可能な動物モデルを生み出します。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
ホセ・リノとタニア・カルヴァーリョ、バイオイメージング施設とインスティトゥート・デ・メディチナ分子ジョアン・ロボ・アントゥンズの比較病理学研究所の責任者に感謝します。我々はまた、ノヴァ医科大学/ファカルダーデ・デ・シエンシアス・メディカス、ユニバーシダーデ・ノヴァ・デ・リスボアの解剖学科のヴィャチェスラフ・シュシチクに感謝します。
資金調達参照:UID/IC/0306/2016 Fundaçãoパラシエンシアeテノロジアによって資金提供されたプロジェクト。ポーラ・デ・オリベイラは、フンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジアのフェローシップ(SFRH/BD/80483/2011)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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