Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bedömning av terapeutisk angiogenes i en murin modell av Hindlimb ischemia

Published: June 8, 2019 doi: 10.3791/59582
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

Summary

Här, en kritisk bakben ischemi experimentell modell presenteras följt av ett batteri av funktionella, histologiska och molekylära tester för att bedöma effektiviteten av angiogena terapier.

Abstract

Kritisk lem ischemi (CLI) är ett allvarligt tillstånd som innebär en hög risk för nedre extremiteten amputation. Trots revaskularisering är den guld-standard terapi, ett stort antal CLI-patienter är inte lämpade för antingen kirurgisk eller endovaskulär revaskularisering. Angiogena terapier växer fram som ett alternativ för dessa patienter men är för närvarande fortfarande under utredning. Före applicering på människor måste dessa terapier testas i djurmodeller och dess mekanismer måste förstås tydligt. En djurmodell av bakbenet ischemi (HLI) har utvecklats av ligering och excision av distala externa iliaca och femorala artärer och vener i möss. En omfattande panel av tester samlades för att bedöma effekterna av ischemi och förmodade angiogena terapier på funktionella, histologiska och molekylära nivåer. Laserdoppler användes för flödesmätning och funktionell bedömning av perfusion. Vävnads svar utvärderades genom analys av kapillärdensitet efter färgning med anti-CD31 antikropp på histologiska avsnitt av gastrocnemius muskler och genom mätning av säkerheter fartygets densitet efter diaphonization. Uttrycket av angiogena gener kvantifierades genom att RT-PCR inriktade sig på utvalda angiogena faktorer enbart i endotelceller (ECs) efter laserinfångning mikrodissektion från möss gastrocnemius muskler. Dessa metoder var känsliga för att identifiera skillnader mellan ischemiska och icke-ischemiska lemmar och mellan behandlade och icke-behandlade armar och ben. Detta protokoll ger en reproducerbar modell av CLI och ett ramverk för att testa angiogena terapier.

Introduction

Perifer arteriell sjukdom (PAD) drabbar främst de nedre extremiteterna. PAD orsakas av åderförkalkning, en artär obstruktion som kan orsaka allvarliga restriktioner för blodflödet i de nedre extremiteterna1. Claudicatio intermittens är den första manifestationen av PAD och hänvisar till muskelsmärta när man går. CLI är den allvarligaste etappen av PAD, diagnostiseras hos patienter som visar ischemisk vila smärta, sår eller kallbrand2. Patienter med CLI har en hög risk för amputation, särskilt om obehandlad3. Nedre extremiteterna revaskularisering (antingen genom öppen kirurgi eller en endovaskulär procedur) är för närvarande det enda sättet att uppnå lem bärgning. Emellertid, cirka 30% av CLI-patienter är inte lämpade för dessa förfaranden, av skäl som inkluderar placeringen av lesioner, mönstret av arteriell ocklusion och omfattande comorbiditet4,5. Därför, nya terapier behövs för dessa annars icke behandlingsbara patienter, med främjandet av angiogenes är strategin under intensivare utredning.

Före testning hos människor måste effektiviteten och säkerheten hos nya terapier in vivo övervägas i djurmodeller. Flera modeller har utvecklats för studiet av CLI, främst genom att framkalla bakbenet ischemi (HLI) hos möss6,7,8,9,10. Emellertid, dessa modeller skiljer sig i flera aspekter, inklusive arten av artärerna som är och ligaturer och/eller censurerade och om vener och nerver som omger dissekeras samt6,7,8, 9,10. Sammantaget kommer dessa aspekter att påverka svårighetsgraden av ischemia-reperfusion skada i varje djur, vilket gör resultaten svårt att jämföras. Därför är det viktigt att utveckla ett effektivt protokoll där förfarandet för att inducera ischemi och utvärderingen av olika mål bör standardiseras för att bedöma om en given angiogen terapi kommer att vara effektiv. Ett experimentellt protokoll som utformats för att täcka alla dessa aspekter skulle ge en omfattande förståelse av de mekanismer genom vilka angiogena terapier utövar sina effekter och ett mått på deras effektivitet vid varje resultat. Två distinkta verk som nyligen publicerats av vårt team är ett bra exempel11,12, där olika metoder för att inducera terapeutisk angiogenes bedömdes med hjälp av samma protokoll som kommer att beskrivas med mer i detalj i denna Protokollet.

Det övergripande målet med detta protokoll är att beskriva en reproducerbar experimentell modell som kan efterlikna effekterna av CLI och lägga den experimentella grunden för en heltäckande bedömning av de funktionella, histologiska och molekylära effekterna av Agenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök är förenliga med direktiv 2010/63/EU och har godkänts av det institutionella djurskyddsorganet och licensierats av DGAV, den portugisiska behöriga myndigheten för djurskydd (licensnummer 023861/2013).

FÖRSIKTIGHET: flera av de kemikalier som används i protokollen är giftiga och skadliga. Använd alla lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock, fullängds byxor och skor med sluten tå)

1. den murina modellen av bakbenet ischit

Obs: alla experiment utförs på 22-veckors gamla C57BL/6 honmöss.

  1. Beredning av lösningar
    1. Beredning av anestesi lösningen
      Anmärkning: denna anestesi kombination (Medetomidin och ketamin) ger upp till 30 min immobilisering och ett kirurgiskt fönster på 15 min. Effekten kan återställas genom administrering av atipamezole.
      1. Med en ren, 1 ml spruta, dra upp 1 ml Medetomidin (1 mg/kg kroppsvikt), eliminera luftbubblor för noggranna mätningar, och tillsätt den till en 15 ml Falcon Tube.
      2. Med en ren, 1 cc spruta, dra ut 0,75 mL ketamin (75 mg/kg kroppsvikt), eliminera luftbubblor för noggranna mätningar och tillsätt den till en 15 mL Falcon rör som innehåller Medetomidin.
      3. Tillsätt 8,25 mL steril saltlösning (0,9% NaCl) för att få 10 mL bedövningsmedel.
      4. Identifiera röret med namnet på föreningarna, datum blandat och utgångsdatum.
      5. Förvaras i mörker vid 4 ° c.
    2. Beredning av anti-sedativa lösningen
      1. Med en ren, 1 cc spruta, dra upp 1 ml atipamezol (5 mg/kg kroppsvikt), eliminera luftbubblor för noggranna mätningar, och tillsätt den till en 15 ml Falcon Tube.
      2. Tillsätt 9 mL steril saltlösning (0,9% NaCl) för att få 10 mL reversionslösning.
      3. Identifiera röret med namnet på föreningarna, datum blandat och utgångsdatum.
      4. Förvaras i mörker vid 4 ° c.
    3. Beredning av postoperativ analgesi lösning
      1. Med en ren, 1 cc spruta, dra ut 0,5 mL buprenorfin (100 μL/15-30 g kroppsvikt), eliminera luftbubblor för noggranna mätningar, och tillsätt den till en 15 mL Falcon Tube.
      2. Tillsätt 9,5 mL steril saltlösning (0,9% NaCl) för att få 10 mL smärtlindring.
      3. Identifiera röret med namnet på föreningarna, datum blandat och utgångsdatum.
      4. Förvaras i mörker vid 4 ° c.
  2. Kirurgisk induktion av bakbenet ischemi
    1. Kirurgiska verktyg som behövs för detta ingripande: spetsiga pinpett, våren sax, oftalmologiska nålhållare, kirurgisk sax och en nål hållare. Sterilisera alla kirurgiska verktyg i en autoklav före användning. Använd bomullsvabb för dissektion av subkutant fett.
    2. Ladda sprutan med anestesi lösningen innan du håller i musen.
    3. Begränsa djuret genom att tillämpa kraft bakom öronen mot burens rutnät, hålla så mycket hud som möjligt för att hålla musen orörlig.
    4. Håll djuret lutat med huvudet sänkt och utför en intraperitoneal injektion av anestesi lösningen, hålla sprutan i en 45 ° vinkel med musens kropp.
    5. Kontrollera om avsaknaden av pedal abstinens reflexer, att utvärdera djupet av anestesi.
    6. Ta bort håret från den högra bakbenen med hjälp av en rakapparat. Använd en klorhexidin desinfektionsmedel tvål Scrub för hud beredning. Använd en ren pappershandduk för att ta bort Suds. Applicera en klorhexidinkirurgisk skrubb och skydda hudområdet med en steril draperi innan du transporterar mössen till den kirurgiska sterila sviten.
    7. Placera djuret i dorsala Decubitus och hindra den med de fyra extremiteterna sprids isär och säkras med tejp.
      Varning: utför proceduren på en uppvärmd pad för att hålla djurets kroppstemperatur stabil; det kirurgiska ingreppet utförs med hjälp av en dissektion Mikroskop vid 10X eller 20x förstoring.
    8. Applicera en klorhexidin antiseptisk lösning med steril gasväv för att slutföra huden beredning. Använda ett nummer 11 kirurgiska skalpell blad utföra en 1-cm hud snitt överliggande låret av den högra bakbenen.
    9. Blunt dissekera subkutant fett utsätta neurovaskulära bunt. Med hjälp av spetsiga tång, våren saxen och oftalmologiska Nålhållaren, öppna membranös Ilio-femorala slida för att exponera distala externa iliaca och femorala fartyg.
    10. Dissekera och separera kärlen (artär och ven) från nerven. Använda en 7,0 icke-absorberbara polypropen sutur Ligat den distala externa iliaca artär och ven och den distala femorala artären och ven.
    11. Transect segmentet av Ilio-femoral artär och vener mellan distala och proximala knutar med våren saxen.
    12. Stäng snittet med en resorberbar sutur (t. ex. 5,0 Vicryl sutur).
    13. Fyll på sprutan med den antilugnande lösningen och Använd samma metod som beskrivs i 1.2.3 och 1.2.4 för att utföra en intraperitoneal injektion av den antilugnande lösningen.
  3. Postoperativ övervakning
    Obs: djuren observeras noggrant varje 15-20 min för att se till att alla djur återhämta sig väl från anti-lugnande medel; sövda djur lämnas aldrig utan uppsikt.
    1. Bedöm återhämtning från anestesi: 1) övervaka hastigheten och djupet av andning; 2) Bedöm djurens reflexer (pedal-och ögonläge)
    2. Utför en subkutan injektion av postoperativ analgesi var 8-12 h.
    3. Övervaka djuren dagligen efter operationen inspelning en kort beskrivning av djurets hälsostatus och kirurgi plats utseende, se till att alla suturer är stängda.
    4. Re-sutur snittet, om sårruptur uppstår. Om misslyckade, tillämpa en hudbarriär film på snittet för att skydda från urin, fekal avföring, friktion och skjuvning av huden och för att hjälpa läkningsprocessen.

2. bedömning av den angiogena effekten

Anmärkning: efter ischemi induktion, tillämpa det terapeutiska medlet i studien och uppnå följande procedurer. Åtgärder som vidtas vid andra tidpunkter beskrivs i motsvarande avsnitt.

  1. Laser Doppler perfusion Imaging
    1. Ta bort håret från båda bakbenen en dag före analysen med hjälp av en elektrisk rakapparat följt av hårborttagnings kräm.
    2. Anesthetize mössen med hjälp av anestesi lösningen.
    3. Placera djuret på en 37 ° c värmedyna i 5 min för att säkerställa att temperaturen inte kommer att förändras under förfarandet
    4. Placera djuret i ryggläge med benen säkrade i ett utsträckt läge. Mät avståndet mellan höger och vänster ben och fötter för varje djur eftersom placeringen av djuret bör vara likartad närhelst förfarandet måste upprepas för att följa förändringar i hindlem perfusion över tiden.
    5. Börja inhämta data genom att använda en laserdopplerperfusion-Imager.
    6. Efter förvärvet är klar, återgå anestesi med anti-sedativa lösningen.
    7. Öppna bildanalysprogram vara och dra regionen av intresse (ROI) runt den ischemiska bakbenet och en jämförbar ROI runt icke-ischemisk bakbenet.
    8. Observera Flux värden och bestämma perfusion som ett förhållande av perfusion i den ischemiska extremiteten till det i icke-ischemisk lem. Förändringar i per fusions förhållandet mäts över tiden.
  2. Immunohistokemi och kapillärdensitet analys
    1. Efter anesthetizing, offra möss av cervikal dislokation.
    2. För att skörda gastrocnemius musklerna i båda benen, först, ta bort huden från båda bakbenen.
    3. Identifiera hälsenan och separera senan från benet med hjälp av en 11-Blade skalpell.
    4. Håll hälsenan och separera muskeln från skenbenet och fibula upp till knäleden med våren sax.
    5. Separera biceps femoris från gastrocnemius muskeln.
    6. Använd våren sax för att skära infogningar av gastrocnemius musklerna på knäleden nivå.
    7. Placera skördade gastrocnemius muskler i en tvärgående orientering på en liten kork skiva med hjälp av 10% tragacanth.
    8. Snap frysa proverna i flytande kvävgaskylda isopentan och förvara dem vid-80 ° c tills snittning.
    9. Skär 7 μm delar av muskeln prover på en kryostat och montera på glas diabilder.
      Obs: protokollet kan pausas här.
    10. Fixera glas glasen i en flaska innehållande kyld ren aceton (ca 50 mL) i 10 min, vid-20 ° c.
    11. Tillsätt väteperoxidas 0,3% utspädd i metanol (50 mL) i 30 min vid rumstemperatur.
    12. Tvätta två gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (50 mL) i totalt 10 minuter.
    13. Använd en hydrofoba penna runt sektionerna.
      Obs: användningen av en hydrofoba penna kan minska mängden lösningar som spenderas under protokollet. För alla inkuberingar används 100 μL av alla lösningar, per sektion.
    14. Applicera en blockerande lösning av 5% kanin serum i PBS i 30 min vid rumstemperatur.
    15. Inkubera proverna i 1 h vid rumstemperatur med anti-CD31 råtta monoklonal antikropp utspädd vid 1:500 i 1% bovint serum albumin (BSA) i PBS.
    16. Tvätta tre gånger i PBS i totalt 30 minuter.
    17. Tillsätt en sekundär en kanin anti-råtta IgG antikropp vid 1:200 i 1% BSA i PBS och 5% kanin serum för 30 min vid rumstemperatur.
    18. Tvätta i PBS som tidigare och tillsätt märkt Avidin-konjugerat peroxidaskomplex i 30 minuter vid rumstemperatur.
    19. Skölj 3 gånger i PBS i 5 min och tillsätt Diaminobenzidin (DAB) peroxidas substrat kit för ytterligare 5 min.
    20. Motfärga avsnitten med hematoxylin för 10 s före montering.
    21. Mät kapillärdensiteterna genom att använda ett upprätt brightfield Mikroskop (dvs. antal kapillärer per antal myocyter) i 2 olika sektioner av 4 distinkta anatomiska områden i varje prov.
  3. Kontrastmedel perfusion
    1. Anesthetize mössen med hjälp av anestesi lösningen.
    2. Utför en median laparotomi med ett antal 15 skalpell blad.
    3. Exponera bukaorta och caudal Vena Cava, efter indragning i sidled den lilla tarmen och använda våren sax.
    4. Sätt in 1 26-gauge kateter kraniellt i bukaorta och en annan i caudal Vena Cava i samma riktning.
    5. Säkra katetrar på plats med en 5/0 Silk sutur för att utföra en vistelse sutur.
    6. Tvätta kärlsystemet med en 37 ° c saltlösning innehållande heparin (500 enheter/100 mL) som skjuts in i bukaorta med hjälp av en 10 mL spruta. Fortsätt försiktig perfusion tills en klar lösning ses komma ut ur katetern placeras inuti caudal vena cava.
      Anmärkning: vanligtvis 30 till 40 ml av en hepariniserad saltlösning krävs för att skölja kärlsystemet hos en vuxen råtta.
    7. Administrera en blandning av adenosin (1 mg/L) och papaverin (4 mg/L) i 2 min.
    8. Injicera i aorta katetern 10 mL av en blandning av 50% bariumsulfat och 5% gelatin.
      Anmärkning: lösningen måste hållas vid 60 ° c för att undvika förtjockning.
    9. Lämna möss vid-4 ° c i minst 4 h, för att låta vaskulär rösterna stelna.
    10. Ta bort huden från den nedre kroppen av varje mus.
  4. Diaphonization - Spalteholz teknik
    1. Fixera mössen genom nedsänkning i en 10% formaldehydlösning i minst 72 h.
    2. Bleka möss genom nedsänkning i en 30% Väteperoxidlösning för 24 h.
    3. Torka av mössen med hjälp av frys ersättnings tekniken. Denna metod består av att skicka in möss till successiva passager (i genomsnitt fyra) av ren aceton vid-20 ° c för 24 h vardera.
    4. Klargöra möss genom att doppa den i en lösning som innehåller en blandning av 100% bensylbensoat och 100% metylsalicylat i en 3:5 andel (denna blandning är också känd som Spalteholz lösning) 13.
    5. Lämna mössen nedsänkt i Spalteholz lösningen inne i en vakuumkammare tills den blir diaphanous, vilket vanligtvis tar 5 till 7 dagar.
    6. Byt ut lösningen om den blir mörk innan preparatet blir klart.
  5. Säkerhets fartygens kvantifiering
    1. Observera möss suspenderade i Spalteholz lösningen under genomlysning med hjälp av ett stereotaxic Mikroskop. Använd mikrokirurgi pincett att försiktigt greppa och flytta den.
    2. Fotografera hela lemmar med hjälp av en digitalkamera ansluten till mikroskopet.
    3. Hämta hela extremitets fotografier med hjälp av lämplig programvara.
    4. Utför en manuell segmentering av säkerhets fartygen genom att markera dem med hjälp av lämplig programvara.
      Anmärkning: säkerhets fartyg definieras enligt longland definition, en definierad stam, Mid-zon, och re-aktör, med en diameter mellan 20 och 300 μm, exklusive femoral, ytlig och pop lie tal lymfkärlen artärer och alla venösa strukturer.
    5. Definiera ROIs i varje mus i samma anatomiska regionen i adductor, omgivande och under den kirurgiska ocklusion.
    6. Kvantifiera säkerheten fartygets densitet (CVD) i motsvarande ROIs motsvarar 20% av den totala extremiteten område. CVD beräknas som förhållandet mellan det vaskulära området och Roareområdena. Alla densitet mätningar utförs med ImageJ programvara.
      Anmärkning: CVD värdet av icke-ischemisk lem för varje mus antas motsvara 100% att utesluta variationer i anatomi, perfusion eller diaphonization förfaranden. Den CVD procentsatsen i ischemisk lem var, därför, beräknas i förhållande till icke-ischemisk en.
    7. Bestäm procentsatsen av CVD ökning som skillnaden mellan CVD procenten bland de ischemiska och icke-ischemiska lemmar.
  6. Laserinfångnings mikrodissektion av kapillärer
    1. Efter anesthetizing, offra möss av cervikal dislokation.
    2. För att skörda gastrocnemius musklerna i båda benen, ta bort huden från möss både bakbenen.
    3. Identifiera hälsenan och separera senan från benet med hjälp av en 11-Blade skalpell.
    4. Håll hälsenan och separera muskeln från skenbenet och fibula upp till knäleden med våren sax.
    5. Separera biceps femoris från gastrocnemius muskeln.
    6. Använd våren sax för att skära infogningar av gastrocnemius musklerna på knäleden nivå.
    7. Placera skördade gastrocnemius muskler i en tvärgående orientering på en liten kork skiva med hjälp av 10% tragacanth.
    8. Snap frysa proverna i flytande kvävgaskylda isopentan och förvara dem vid-80 ° c tills snittning.
    9. Skär på en kryostat 12 μm delar av muskeln prover och montera på glas diabilder.
      Anmärkning: för RNA-skydd ta en förfuktad bild och tryck på baksidan av bilden med fingret (handskar) för att värma bara regionen för att placera avsnittet. Överförings sektion från kryostatkniven genom att vidröra med det värmda området och torka vid-20 ° c i kryostaten för 2-3 min. Protokollet kan pausas här.
      1. Fäst glas glasen i en flaska som innehåller kyld ren aceton (cirka 50 mL) i 5 min vid-20 ° c och lufttorka dem.
      2. Använd en hydrofoba penna runt sektionerna.
        Obs: användningen av hydrofoba pennan hjälper till att minska mängden lösningar som spenderas under protokollet. För alla inkuberingar används 100 μL av alla lösningar, per sektion.
      3. Rehydrera med 2 M NaCl/PBS vid 4 ° c och inkubera proverna över natten vid 4 ° c med anti-CD31 Rat monoklonal antikropp vid 1:500 i 2M NaCl/PBS.
      4. Tvätta två gånger i 2M NaCl/PBS för totalt 6 min.
      5. Tillsätt en sekundär biotinylerad kanin anti-råtta IgG antikropp vid 1:200 i 2M NaCl/PBS och 5% kanin serum i 30 min vid 4 ° c.
      6. Tvätta i 2 M NaCl/PBS som tidigare och Lägg till märkt Avidin-konjugerat peroxidaskomplex i 30 min vid 4 ° c.
      7. Skölj och tillsätt DAB peroxidassubstrat kit i 5 min.
      8. Torka av avsnitten i iskallt 90% etanol följt av 100% etanol och låt dem torkas.
      9. Dissekera 10 000 kapillärer per möss med hjälp av en laser microdissection system utrustad med en pulsad Solid-State 355 nm Laser och katapult dissekerade kapillärerna i en mikrofugrör röret lim-mössa.
  7. RNA-extraktion, cDNA-syntes, pre-amplifiering och RT-PCR
    1. Isolera totalt RNA från mikrodissekerade kapillärerna med hjälp av en lämplig sats, är det totala RNA som erhålls mellan 1.5-3 ng/μL.
    2. Använd en cDNA syntes sats för syntes och två omgångar av pre-amplifiering, med hjälp av primers som beskrivs i tabell 1.
    3. Utför RT-PCR för samma mål som beskrivs i föregående steg. Använd ett program som består av ett initialt denatureringssteg vid 95 ° c i 10 min, följt av 50 cykler vid 95 ° c i 15 s och vid 60 ° c i 1 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av det beskrivna protokollet, navel Strängs mesenkymala stamceller och lågdos joniseringsstrålning (LdiR) testades som förmodade angiogena terapier 11,12. Laser Doppler perfusion avläsningar erhölls innan ischemi induktion och vid förutbestämda tidpunkter alltifrån omedelbart efter ischemi induktion till 45 dagar efter ischemi. Avläsningar av vävnadsperfusion med Laser Doppler spelades in som färgkodade bilder, utan perfusion visas som mörkblå och den högsta per fusions nivå som visas som röd.  Som framgår av figurerna 2a och 3a och som kvantifierats i figurerna 2B och 3bobserverades en fullständig förlust av perfusion i bakbenen hos alla möss omedelbart efter induktion av reproducerbarhet av tekniken för att inducera bakbenet ischemia. Viktigt, svårighetsgraden av ischa är liknande i alla djur. En ROI drogs runt den ischemiska bakdelen och en jämförbar ROI drogs runt icke-ischemisk bakben att utföra kvantifiering av perfusion. Perfusion uttrycks som ett förhållande av perfusion i den ischemiska lemmen till det i icke-ischemisk lem. Förändringar i per fusions förhållandet mäts över tiden.

Immunohistokemi utfördes mellan 15 och 90-dagar efter ischemia. Diaphonization genomfördes mellan 19-och 90-dagar efter ischemia och kapillär microdissection mellan 45-och 70-dagar efter ischemia induktion se till att de olika Pro-angiogena terapier inducerade en ihållande och långvarig proangiogen effekt.

Kvantifiering av CD31-positiva kapillärer i histologiska avsnitt av gastrocnemius-muskeln bedömde kapillärtätheten och detta uttrycktes som antalet kapillärer per antal muskelfibrer. Som visas i figur 4, kapillär densitet var större i den ischemiska kontra icke-ischemisk lem.

För att utvärdera säkerheten fartygs täthet, möss var diaphonized och en motsvarande ROI, motsvarande 20% av extremiteterna området, valdes för kvantifiering. Säkerheter fartygets densitet konsekvent ökat i den ischemiska extremiteten, så data som hänför sig till behandlade och kontroll armar och ben uttrycktes som andelen säkerheter fartygs täthet ökning i den ischemiska extremiteten relativt till icke-ischemisk en (figur 5 ).

Uttryck för Pro-angiogena gener av ECs analyserades av kvantitativ RT-PCR av CD31-positiva celler. Avskrifter för Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, HGF och met visade en tydlig variation i uttryck mellan ischemisk och icke-ischemisk lemmar, exklusivt hos möss som exponerats för den Pro-angiogena stimulansen (figur 6).

Figure 1
Figur 1 : Schematisk illustration av anatomin av musen bakbenen kärlsystemet visar ligering platser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : LdiR ökar perfusion återhämtning. Efter kirurgisk induktion av ensidig HLI, var båda bakbenen av C57BL/6 möss simulerad bestrålade eller bestrålade med fyra dagliga fraktioner av 0,3 Gy, i dagar i följd och tillåtas återhämta sig. (A) representativa laserdopplerflödesbilder före HLI, och vid dag 0 (D0) och 15 (D15) post-HLI-induktion. (B) kvantitativ utvärdering av blodflödet uttryckt som förhållandet mellan ISC och NISC-extremiteterna visade signifikant förbättrad blod perfusion i extremiteter hos bestrålade möss jämfört med simulerad strålning både vid dag 15 (D15) och 45 (D45) post-HLI. Mellan-grupp förändringar bedömdes genom två-vägs upprepade mätningar ANOVA följt av Bonferroni post-hoc-test (n = 12 möss per grupp). Medel ± SEM visas.  P < 0,001; NS, icke-signifikanta. HLI, bakbenen ischemia; ISC, ischemisk; NISC, icke-ischemisk; Pre-HLI, före hindlem ischemia. Anpassad från 11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Navel Strängs mesenkymala stamceller (UCX) öka perfusion återhämtning. UCX eller deras fordon (som en kontroll) administrerades i den ischemiska gastrocnemius muskeln 5 timmar efter HLI induktion. A) representativa laserdopplerflödesbilder före (PRE-HLI), omedelbart efter (D0 efter HLI) och vid 7, 14 och 21 dagar efter HLI-induktion (D7 POST-HLI, D14 POST-HLI, D21 POST-HLI). (B) kvantitativ utvärdering av blodflödet uttryckt som förhållandet mellan ISC och NISC-extremiteterna visade signifikant förbättrad blod kropps perfusion i navel Strängs mesenkymala stamceller-behandlade möss vid 7, 14 och 21 dagar efter HLI. (n = 16 för varje experimentell grupp; D7: t (22,69) = 4,26; P ˂ 0,001; effektstorleken var 1,51 och effekt 0,98; D14: t (30) = 4,7; P ˂ 0,001; effektstorleken var 1,66 och effekt 0,99; D21: t (30) = 7,22; P ˂ 0,001; effekt storlek 2,56 och effekt 0,99). HLI, bakbenen ischemia; ISC, ischemisk; NISC, icke-ischemisk. Anpassad från11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : LdiR ökar kapillärtätheten. A) representativa sektioner från simulerad och bestrålad ischemisk gastrocnemius-mus på dag 45 efter HLI. Kapillärer och myocyter identifierades av CD31 immunohistokemi och hematoxylin, respektive. Skalbar, 150 mm. (B) kvantitativ analys avslöjade ökad kapillär densitet (kapillärer/myocyt) i bestrålade ischemiska gastrocnemius muskler jämfört med Sham-bestrålad ischemisk dem på dag 15 och 45 post-HLI. Blandade ANOVA följt av Bonferroni post-hoc test utfördes med en inom-ämne faktor ISC och mellan-ämne faktorer dag och bestrålning (n = 6 möss per grupp). Individuella data och medel ± SEM visas. P < 0,001; NS, icke-signifikanta. ISC, ischemisk; NISC, icke-ischemisk. Anpassad från11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: LdiR ökar säkerheten densitet. Aillustrativa bilder av utvalda Rois för simulerad och bestrålad mus. ISC och NISC extremiteter på dag 90 post-HLI visas. Skal stång, 300 mm.B) data representeras som procentandelen av CVD-ÖKNINGEN av ISC-extremiteterna relativt till nisc en. Vid dag 15 och 90 post-HLI, bestrålade möss presenterade en signifikant högre CVD-ökning (%) vs. Sham-bestrålade möss. Två-vägs ANOVA genomfördes följt av Bonferroni post-hoc-test med en mellan faktorer av dag och bestrålning (n = 6 möss per grupp).  Individuella data och medel ± SEM visas. * P < 0,05; P < 0,001; NS, icke-signifikanta. HLI, bakbenen ischemia; ISC, ischemisk; NISC, icke-ischemisk. Anpassad från11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : LdiR uppreglerar uttrycket av angiogena gener i ECs isolerade från bestrålade ischemiska gastrocnemius muskler. Efter kirurgisk induktion av ensidig HLI, båda bakbenen av C57BL/6 möss var simulerad-bestrålade eller bestrålades med fyra dagliga fraktioner av 0,3 Gy, i på varandra följande dagar och tilläts återhämta sig. På dag 45 efter HLI utvärderades uttrycket av Pro-angiogena faktorer och deras receptorer av qRT-PCR uteslutande på ECs. Gastrocnemius muskel sektioner var färgade för CD31. Enskilda endotelceller CD31 + celler visualiserades, dissekeras, och isolerade med hjälp av en laser microdissection system. Varje stapel representerar det relativa genuttrycket i ett djur. Vita och gråa staplar representerar simulerad och bestrålad mus. Värdena normaliserades till 18 s för att erhålla relativa uttrycks nivåer. Resultat uttryckta som log2 Fold förändringar mellan ischemiska och icke-ischemiska prover visade det relativa överflödet av avskrifter i bestrålade möss; Däremot observeras en down-förordning i simulerad-bestrålade möss. Anpassad från11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Vegfr1_ F (5 '-TTGAGGAGCTTTCACCGAACTCCA-3 ');
Vegfr1_ R (5 '-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGCTT-3 ');
Vegfr2_ F (5 '-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3 ');
Vegfr2_ R (5 '-AGACCATGTGGCTCTGTTTCTCCA-3 ');
PDGF-c_ f (5 '-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3 ');
PDGF-c_ R (5 '-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3 ');
Met_ F (5 '-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3 ');
Met_ R (5 '-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3 ');
Fgf2_ (5 '-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3 ');
Fgf2_ R (5 '-AACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGT-3 ');
Tgfb2_ (5 '-GCTTTGGATGCGGCCTATTGCTTT-3 ');
Tgfb2_ R (5 '-CTCCAGCACAGAAGTTGGCATTGT-3 ');
Ang2_ (5 '-ATCCAACACCGAGAAGATGGCAGT-3 ');
Ang2_ R (5 '-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3 ');
HGF_ F (5 '-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3 ');
HGF_ R (5 '-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA-3 ');
18s_ F (5 '-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3 ');
18s_ R (5 '-CCGGAATCGAACCCTGATT-3 ').

Tabell 1: primers som används för studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Murina modeller av CLI har mestadels bestod i ligering av femorala artären bara distalt till ursprunget för den profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Detta har visat sig lämna de flesta av säkerheten cirkulationen intakt, vilket återställer blodflödet till extremiteten inom 7 dagar 9. Avlägsnande av säkerheter sängen kan uppnås genom excision av femorala artären. Emellertid, upp till en tredjedel av det ursprungliga blodflödet kan återställas så snart 7 dagar efter ingreppet, med tanke på att de flesta säkerheter fartyg uppstår från den inre iliaca artären 7. Lejay et al har föreslagit sekventiella ligationer med en andra ligering utförs på den gemensamma iliaca artären, effektivt minska säkerheten perfusion som tillhandahålls av den interna iliaca artären 4. Kritiska steg inom detta protokoll omfattar inte bara identifiering av den externa iliaca artären strax ovanför ljumsk ligament, men också ligering och excision av distala externa iliaca och femorala artärer och vener, som tjänar ett dubbelt syfte: att öka svårighetsgraden av ischemi samt att förbättra den tekniska reproducerbarhet av modellen, som exponering av den femorala artären ensamt resulterar ofta i att riva av venen.

En begränsning av denna teknik är det akuta avbrottet i blodflödet till extremiteten, som skiljer sig från den långvariga processen i samband med uppbyggnaden av aterosklerotisk plack som leder till arteriell stenos och ocklusion. Fortfarande, minskning av blodflödet var närvarande väl efter 2 veckor, den fastställda tidspunkten för diagnos av kronisk ischit. Också, collateralization ökades med den ischemiska förolämpningen ensam, som härmar processen för säkerhet formation observerats i kroniskt ischemiska lemmar.

Neovascularization av ischemisk lemmar innebär ett komplext samspel av biologiska händelser, nämligen, angiogenes och arteriogenes. Detta protokoll innehåller en mängd olika analyser som utvärderade interferensen av förmodade angiogena terapier på angiogen groning (kapillär fartygs täthet) och säkerhet fartygs utveckling (arteriogenes), den viktigaste mekanismen i mänsklig tolerans till lägre extremiteter ischa. Samtidigt används Laser Doppler för att avslöja funktionen hos dessa nya eller förstorade fartyg, och för första gången laser mikrodissektion av kapillärer används för att samla in ECs avslöja molekylära mekanismer som ligger bakom funktionell återhämtning. Detta protokoll ger en reproducerbar djurmodell som kan efterlikna effekterna av CLI en provningsstandard när djuren behandlas med möjliga angiogena terapier som kan tillämpas i ett kliniskt sammanhang i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar José Rino och Tânia Carvalho, chefer för bioimaging anläggningen och histologi och jämförande patologi laboratorium Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, respektive. Vi tackar också Vyacheslav Sushchyk från Institutionen för anatomi Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.

Finansierings referens: projekt finansierat av UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia. Paula de Oliveira stöds av en gemenskap (SFRH/BD/80483/2011) från Fundação para a Ciência e Tecnologia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7500 Fast Real-Time PCR Applied Biosystems Instrument
Acetone Merk 1000141000 Reagent; Caution - highly flammable
Adenosine Valdepharm Reagent
Atipamezole OrionPharma Reagent
Barium sulphate (Micropaque) Guebert 8671404 (ref. Infarmed) Reagent
Buprenorphine RichterPharma Reagent
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit Qiagen 7335730 Reagent
Cryostat Leica CM Leica Microsystems 3050S Instrument
DAB peroxidase substrate kit DAKO;Vector Laboratories K3468 Reagent
hydrogen peroxidase Merk 1072090250 Reagent; Caution - nocif
hydrophobic pen Dako 411121 Reagent; Caution - toxic
Ketamidor Richterpharma CN:580393,7 630/01/12 Dfvf Reagent
Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK 5710 Instrument
Leica DM2500 upright brightfield microscope Leica Microsystems Instrument
Medetor Virbac 037/01/07RFVPT Reagent
methanol VWR UN1230 Reagent; Caution - toxic and highly flammable
Papaverine Labesfal Reagent
Pentano Isso Merk 1060561000 Reagent; Caution - highly flammable
Power SYBR® Green Applied Biosystems 4309155 Reagent
Purified rat anti-mouse CD31 Pharmingen 550274 Reagent
RNeasy Micro kit Qiagen 74004 Reagent
Surgic-Pro 6.0 Medtronic (Coviden) VP733X Suture
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) Vectastain ABC kit; Vector Laboratories PK-4004 Reagent
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 Medtronic (Covidien) UL202/ UL101 Suture
Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System Carl Zeiss Microscopy, Germany 1023290916 Instrument
Stereotaxic microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
Digital camera Linux Instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
  3. Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
  4. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  5. Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
  6. Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
  7. Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
  8. Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
  9. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  10. Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
  11. Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
  12. Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
  13. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).

Tags

Medicin angiogenes terapeutisk angiogenes kritisk Extremitets ischemia perifer arteriell sjukdom murina Bakextremitets ischemia modell CLI
Bedömning av terapeutisk angiogenes i en murin modell av Hindlimb ischemia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ministro, A., de Oliveira, P.,… More

Ministro, A., de Oliveira, P., Nunes, R. J., dos Santos Rocha, A., Ferreira, T., Goyri-O'Neill, J., Rosa Santos, S. C. Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (148), e59582, doi:10.3791/59582 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter