Summary
Describimos un novedoso sistema de análisis de marcha, Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings (PrAnCER), un sistema automatizado de acceso abierto para la cuantificación de las características de la marcha en ratas que utiliza un nuevo piso semitransparente para cuantificar la marcha. Este sistema fue validado usando el modelo haloperidol de la enfermedad de Parkinson.
Abstract
El análisis de gait se utiliza para cuantificar los cambios en la función motora en muchos modelos de roedores de enfermedades. A pesar de la importancia de evaluar la marcha y la función motora en muchas áreas de investigación, las opciones comerciales disponibles tienen varias limitaciones, como el alto costo y la falta de código abierto accesible. Para abordar estos problemas, desarrollamos PrAnCER, Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings, para la cuantificación automatizada de la marcha. Las grabaciones mejoradas por contraste se producen mediante el uso de un suelo translúcido que oscurece los objetos que no están en contacto con la superficie, aislando efectivamente las impresiones de la pata de la rata mientras camina. Usando estos videos, nuestro sencillo programa de software mide de forma fiable una variedad de parámetros de marcha espaciotemporales. Para demostrar que PrAnCER puede detectar con precisión los cambios en la función motora, empleamos un modelo de haloperidol de la enfermedad de Parkinson (PD). Probamos ratas a dos dosis de haloperidol: dosis alta (0,30 mg/kg) y dosis baja (0,15 mg/kg). Haloperidol aumentó significativamente la duración de la postura y el área de contacto de la pata trasera en la condición de dosis baja, como cabría esperar en un modelo de PD. En la condición de dosis alta, encontramos un aumento similar en el área de contacto, pero también un aumento inesperado en la longitud de la zancada. Con más investigaciones, encontramos que este aumento de la longitud de zancada es consistente con el fenómeno de escape de refuerzo comúnmente observado en dosis más altas de haloperidol. Por lo tanto, PrAnCER fue capaz de detectar cambios esperados e inesperados en los patrones de marcha de roedores. Además, confirmamos que PrAnCER es consistente y preciso en comparación con la puntuación manual de los parámetros de la marcha.
Introduction
Los roedores se utilizan comúnmente como modelos para estudiar una amplia gama de enfermedades y lesiones incluyendo artritis1, Enfermedad de Parkinson (PD)2,3, trastornos neuromusculares4,5, hidrocefalia6 , y lesión de la médula espinal7. En estas condiciones, los síntomas como el dolor, el equilibrio y la función motora se pueden medir mediante el estudio de los patrones de marcha de los animales. Estos patrones se cuantifican utilizando un conjunto de parámetros de marcha espaciotemporales que resumen la ubicación y el momento de las impresiones de patas, así como el área de contacto de la pata en el suelo.
Aunque existen muchas opciones para el análisis de marcha, los sistemas actuales tienen varios inconvenientes. En las pruebas tradicionales de tinta y papel, las patas de un animal están recubiertas con tinta antes de caminar a través de una hoja de papel blanco (Figura1A). Las impresiones de pata resultantes se pueden medir para la longitud de zancada y la anchura de la postura, pero no se pueden evaluar los parámetros clave de la marcha temporal, como la velocidad o la duración del paso. Los sistemas modernos basados en vídeo son más fiables, pero el análisis devídeo requiere una puntuación laboriosa fotograma a fotograma a menos que se utilice un sistema automatizado adecuado 8. Hay muchos sistemas de puntuación automatizados comerciales actualmente disponibles, pero estos sistemas pueden ser prohibitivamente caros. Además, estos sistemas se basan en pisos claros o, en algunos casos, cintas de correr, que alteran el movimiento natural. Se ha demostrado que las cintas decorrer enmascaran los déficits motores en algunos modelos de enfermedad 9, mientras que el piso transparente (Figura1B)hace que los ratones pasen más tiempo en el perímetro de un campo abierto, lo que indica un aumento de la ansiedad10. Idealmente, un aparato de análisis de marcha no dependería de ninguno de los dos, produciendo los patrones de movimiento más naturales con menos estrés para el animal.
Las opciones comerciales y de código abierto disponibles utilizan una variedad de métodos para superar la dificultad de aislar una huella del cuerpo del animal a pesar de las condiciones de iluminación variables, el color animal y las formas de impresión. Algunos mejoran el contraste de las patas de contacto utilizando superficies que liberan luz en respuesta a la presión7,11,12, pero estas son costosas y técnicamente difíciles de construir. Otros sistemas utilizan múltiples ángulos de visión que permiten la observación de la coordinación de todo el cuerpo8,13. Si bien estas opciones ofrecen ventajas para medir parámetros adicionales del motor más allá de la marcha, son innecesariamente complejas para el análisis simple de la marcha. Además, todas estas técnicas se basan en pisos claros, lo que altera el comportamiento natural.
PrAnCER se basa en lo que llamamos Grabaciones mejoradas por contraste, que utilizan una combinación de iluminación y un suelo semitransparente para mejorar la detección de impresiones. Cuando se ve desde abajo, esto crea una imagen de alto contraste (impresión de pata) mientras oscurece la vista de objetos que no están en contacto con la superficie (el cuerpo del animal) (Figura1D). Cuando se ve desde arriba, el suelo parece opaco. La importancia resultante de las patas en nuestro método permite la identificación precisa de una variedad de características de marcha y locomotora por nuestro sistema automatizado recientemente desarrollado. En el presente estudio, describimos el aparato, nuestro protocolo de análisis de marcha y nuestro sistema automatizado de puntuación, PrAnCER. Nuestro aparato se monta fácilmente y PrAnCER se puede utilizar para evaluar los déficits motores en una amplia gama de modelos de enfermedades y lesiones.
Para demostrar que PrAnCER se puede utilizar para detectar patrones de marcha anormales, utilizamos un modelo haloperidol de PD, un modelo simple para la inducción transitoria de cambios de locomotora14. Haloperidol es un antagonista del receptor de dopamina ampliamente utilizado como un antipsicótico1. Afecta a los sistemas motores mediante la alteración de la señalización de dopamina en el estriado, un componente importante de la vía motora en los ganglios basales14. Incluso una sola dosis de haloperidol reduce rápidamente los niveles de dopamina extracelular en el estriado, causando defecaciones motoras de Parkinson15. Los efectos conductuales son rigidez muscular, akinesia y catalepsia, que se define como una incapacidad para volver a una postura normal después de ser colocado en una posición inusual11,16. Dosis agudas de haloperidol causan déficits locomotores identificables en la prueba rotarod de la función motora17. Razonamos que las deficiencias locomotoras mediadas por haloperidol también serían evidentes en una serie de características accesibles para el análisis automatizado de la marcha.
Aunque las respuestas al haloperidol varían ampliamente entre los estudios, los efectos catapépticos del haloperidol surgen a dosis de 0,5 mg/kg y superiores, mientras que la reducción de la capacidad de respuesta y el deterioro motor son detectables a dosis más bajas (0,1 - 0,3 mg/kg)16, 17. En un esfuerzo por evitar los efectos catapépticos del haloperidol, decidimos probar dos dosis de haloperidol: una dosis alta (0,30 mg/kg) y una dosis baja (0,15 mg/kg). Como se muestra en la Tabla 1, el Experimento 1 examinó los efectos del haloperidol de dosis alta, mientras que el Experimento 2 probó los efectos del haloperidol de dosis baja. Utilizamos un diseño dentro del sujeto en el que cada rata fue probada en las condiciones de alta dosis, dosis baja y control (salina). El orden de la condición se contrarrestó entre ratas. Pronosticamos que la administración aguda de haloperidol causaría deficiencias similares a las encontradas en otros modelos de DP como disminución de la velocidad, disminución de la longitud de zancada y mayor duración de la postura3,14,18 ,19. Observamos cambios de comportamiento incluyendo akinesia después de la administración de haloperidol en ambas dosis. En la condición de dosis baja, las ratas habían aumentado significativamente la duración de la postura y el área de contacto de la pata trasera, como se esperaba. Estos cambios en la marcha son comparables a los pasos lentos y de barajado comunes entre los pacientes con DP2,20. En la condición de dosis alta, sin embargo, vimos un aumento en la longitud de la zancada, así como un aumento en el área de contacto de la pata. Aunque el aumento en la longitud de zancada fue inesperado, una revisión adicional de la literatura indicó que es probablemente parte de una respuesta de escape de refuerzo inducida por haloperidol. Concluimos que PrAnCER es realmente capaz de detectar cambios similares al Parkinson en la marcha de roedores consistentes con el uso de neurolépticos.
Protocol
Todos los procedimientos se ajustaron a las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Brown.
1. Aparato de análisis de polainidad
- Preparar la pasarela de análisis de marcha que consta de una pasarela cerrada de plexiglás transparente (36" L x 3" W x 4.5" H) colocada en un suelo de plexiglás transparente (Figura2A). Haga que el suelo de plexiglás sea semitransparente cubriéndolo con un trozo de vitela de fibra de algodón de 16 LB cortada a la misma anchura que la pasarela.
NOTA: Existen otros métodos para hacer que el suelo sea semitransparente. - Coloque una cámara con una velocidad de fotogramas de al menos 30 fotogramas por segundo (fps) directamente debajo de la pasarela para capturar el centro de la pista (Figura2B).
- Asegure una tira de luces LED de 12 V con 18 LEDs/pie aproximadamente a 2 pulgadas de distancia y 1 pulgada por encima del suelo de la pasarela para iluminar la pista.
2. Preparación animal
- Permita que los animales se aclimaten al vivarium durante al menos 1 semana antes de su manipulación. Manipule las ratas durante al menos 5 días antes de comenzar el experimento. Este estudio utilizó 8 ratas macho Long Evans de aproximadamente 3 meses de edad.
-
Habituate a los animales a la sala de pruebas y la pasarela de la marcha con las luces de la habitación apagadas
- Coloque la jaula de inicio de la rata a la altura de la superficie al final de la pasarela de la marcha para servir como caja de gol. Tenga en cuenta que si la jaula doméstica es profunda, envejecida o con problemas de locomotora puede beneficiarse de una rampa o paso para facilitar el acceso a la jaula doméstica.
- Permita que la rata camine desde la mano del experimentador por la longitud de la pasarela para llegar a su jaula de origen.
- Las ratas a menudo se detienen al final de la pasarela para mirar a su alrededor antes de saltar hacia abajo en la jaula de casa. Si una rata tarda más de 1 minuto en salir de la pasarela, anímelo a entrar en su jaula de origen con un suave empujón.
- Si la rata se da la vuelta, utilice un pequeño trozo de plexiglás para bloquear el extremo "inicio" de la pasarela. Repita el proceso para un total de 3 corridas.
- Habituate durante al menos 2 días o hasta que las ratas se sientan cómodas cruzando la pasarela a un ritmo constante sin congelarse.
3. Procedimiento de prueba de Gait
- Ajuste la configuración del software de la cámara web para lograr la imagen más clara de las impresiones de la pata. Apague las luces de la habitación para todas las pruebas de marcha.
- Registre cada ejecución por separado y etiquete adecuadamente para su uso con el programa de análisis automatizado.
- Asegúrese de que no haya manchas ni escombros en el vitela. Comience a grabar unos segundos antes de que la rata entre en la pasarela y se detenga una vez que la rata salga de la pasarela y entre en su jaula de origen.
- Continúe hasta que se completen tres corridas aceptables o hayan transcurrido 10 minutos.
- Limpie la pasarela con etanol entre cada rata y reemplace la vitela según sea necesario.
NOTA: Un ensayo aceptable se define como uno en el que el animal camina de forma consistente y sin pausa para los primeros 4 pasos de la carrera. Si esto es difícil de lograr, ajuste los criterios para incluir ensayos en los que haya 4 pasos consecutivos en cualquier punto de la carrera que se produzcan sin pausas o aceleración abrupta.
4. Análisis automatizado PrAnCER
- Ponga todos los videos para ser analizados en una carpeta.
- Inicie PrAnCER ejecutando la secuencia de comandos de Python PrAnCER. PrAnCER analizará los videos basados en los pasos ilustrados en la Figura 3 y la Figura 4.
- En el menú emergente, seleccione la carpeta especificada pulsando el botón Elegir una carpeta. Seleccione opciones personalizadas para el análisis si lo desea. Las descripciones detalladas de cada parámetro se pueden encontrar haciendo clic en el signo de interrogación junto a ellos. Haga clic en Continuar cuando haya terminado.
- Defina una región de interés (ROI) en la imagen de la pasarela que aparece. Para ello, haga clic izquierdo para definir un borde superior y haga clic con el botón derecho para definir un borde inferior. Si el cuadro que aparece es correcto, pulse N para continuar. Si no es así, pulse Z para deshacer. Una vez presionado N, el programa se ejecutará automáticamente.
- Una vez completado PrAnCER, termine el programa pulsando Intro en el terminal.
- Para revisar manualmente la salida de resultados de PrAnCER, ejecute la secuencia de comandos de Python GaitEditorGUI y seleccione el archivo .mp4 adecuado para cada vídeo. Si es necesario, corrija las impresiones mal identificadas o combinadas.
- Para extraer parámetros de marcha espaciales y temporales, ejecute la secuencia de comandos de Python ParameterAnalyzer. Elija el número de impresiones posteriores que desea analizar y la carpeta de vídeos que desea analizar y, a continuación, haga clic en Continuar. Esto generará un archivo .csv para cada vídeo que contiene una serie de parámetros de marcha comunes, que se describen en la Tabla 2 y se ilustran en la Figura5.
NOTA: Los scripts completos, así como las instrucciones para leer y analizar datos, están disponibles en GitHub del autor (www.github.com/hayleybounds). Implementamos este algoritmo usando la biblioteca gratuita de código abierto de Python OpenCV21. También se incluyen en el GitHub son instrucciones para construir nuestra pasarela de análisis de marcha.
Representative Results
Procedimiento de Haloperidol
Desarrollamos este sistema de análisis de marcha para comparar los parámetros de la marcha en ratas de control con las ratas experimentales que se espera muestren una variedad de deterioros de locomomotor, marcha y equilibrio. Utilizamos un diseño dentro del sujeto en el que cada rata fue probada en las condiciones de salina, haloperidol de alta dosis y haloperidol de dosis baja. Las ratas se separaron en dos grupos (A y B) para permitir el contrapeso; Las pruebas de marcha se contrarrestó la hora del día y el orden de la condición. Cada prueba fue separada por 48 h. Las ratas fueron ligeramente anestesiadas con isoflurano antes de recibir inyecciones intraperitoneales (IP) de salina o haloperidol. Gait fue probado 1 h post-inyección, momento en el que el haloperidol debe estar en los niveles máximos15,16,17.
Resultados conductuales
Observamos cambios de comportamiento prominentes en animales tratados con haloperidol. En la condición de alta dosis, cinco de las ocho ratas tuvieron períodos de inmovilidad al inicio de la pasarela, durante los cuales no respondieron al experimentador que las tocaba y eran resistentes a ser trasladadas. En algunos casos, este estado persistió durante varios minutos hasta que la rata fue removida de la pasarela. En otros casos, la rata inmóvil se movería repentinamente rápidamente o se "atacaba" a través de la pasarela y luego volvería al estado inmóvil cerca del final. En la condición de dosis baja, 3 de las 8 ratas tuvieron períodos similares de inmovilidad. En esta dosis, sólo había una instancia de comportamiento delimitador. No se observó límite cuando los animales fueron tratados con salina.
Analizamos los efectos del haloperidol en los siguientes parámetros de marcha: base de soporte, longitud de zancada, velocidad de zancada, duración de la postura, relación postura a oscilación, área de contacto máxima y distancia entre las extremidades. Debido a que muchos parámetros de marcha para las extremidades delanteras y traseras son idénticos y el haloperidol generalmente tiene impactos uniformes en todas las extremidades, calculamos los parámetros solo para las extremidades posteriores y no separamos los datos de las extremidades izquierda y derecha. Para cada rata, calculamos la media de cada parámetro de marcha a partir de todas las corridas utilizables de cada día de prueba. Todos los parámetros (excepto la variabilidad de velocidad) se calcularon como la media para los primeros 4 pasos utilizables de una ejecución. Para evaluar si cada dosis de haloperidol impactó significativamente la marcha, utilizamos una prueba t de muestra emparejada. En el Experimento 1, se ha observado un aumento significativo de la longitud de la zancada (Figura6A;t(7) a -2,962, p a 0,021) y el área de contacto máxima (Figura6A;t(7) a -2,51, p a 0,04) en animales tratados con haloperidol de dosis alta. La base de apoyo, la velocidad, la duración de la postura y la relación posición-swing no fueron significativas. En el experimento 2, los animales a los que se administró haloperidol de dosis baja mostraron un aumento significativo en la duración de la postura (Figura6B;t(7) a -2.444, p a 0,044) y área de contacto máxima (Figura6B;t(7) a -3.085, p a 0,018) en comparación con la condición salina. Ningún otro parámetro de marcha fue significativo. Además, hubo una diferencia significativa entre las condiciones de dosis alta y dosis bajas de haloperidol en base al soporte (Figura6C;t(7) 2.651, p a 0,033), área de contacto máxima (Figura6C;t(7) a 4.635, p a 0,002) y distancia entre las extremidades ( Figura 6C; t(7) a 3.098, p a 0,017).
Su precisión de ubicación y errores en el sistema automatizado
Para evaluar la precisión de PrAnCER, comparamos su análisis automatizado con la puntuación manual de 21 videos seleccionados al azar de un grupo separado de 6 ratas de control. A efectos de puntuación manual, los vídeos se convirtieron en una secuencia de imágenes, que luego se utilizaron para marcar manualmente las ubicaciones de las impresiones. Para mayor eficiencia, centramos nuestro análisis en los datos espaciales medidos únicamente a partir de impresiones posteriores. Extrajimos la longitud media de zancada y BOS para cada vídeo y lo comparamos con los valores automatizados. Si bien la longitud media de la zancada no era significativamente diferente entre la puntuación manual y el análisis de PrAnCER (Figura7B;t(20) a -0,01, p a 0,99), la base de soporte fue significativa (Figura7A;t(20) - -2.21, p a 0,038). Aunque la puntuación automatizada y manual estaba generalmente bien correlacionada, el sistema automatizado reportó un 5% más grande BOS en promedio. Esta diferencia puede deberse a desviaciones en la selección centroide en lugar de errores de detección. Para la puntuación manual, la ubicación de impresión se marcó dibujando un óvalo alrededor de la base de cada impresión posterior, ya que sería difícil replicar manualmente el método de prAnCER de centro de estimación de masa. La clara tendencia era que PrAnCER sobreestimara bos, tal vez porque algunos animales pueden descuidar se los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de una manera asimétrica, haciendo que PrAnCER observe centroides más extremos que la puntuación manual. Otros sistemas también han observado aumentos significativos en BOS entre la puntuación manual y automatizada a pesar de las medidas consistentes de longitud de zancada17. Teniendo en cuenta las pequeñas diferencias observadas y la coherencia con otros sistemas, llegamos a la conclusión de que PrAnCER es una medida fiable de los parámetros de la marcha.
Es importante tener en cuenta que todo el análisis de precisión se produjo después de que la corrección manual de la salida automatizada se realizó utilizando la GUI de PrAnCER. Al igual que en los sistemas comerciales existentes, este paso es necesario tanto para corregir errores en la puntuación como para eliminar corridas que no cumplen los criterios22. Ajustamos PrAnCER para errar en el lado de los falsos positivos, ya que estos son más fáciles de corregir post-hoc. Nunca hemos observado PrAnCER dejar de detectar una impresión real durante la corrección manual de más de 5cientos videos. Sin embargo, se observaron otros tipos de errores. Estos se dividieron en 3 categorías: detecciones falsas (detección de una impresión no impresa como impresión), clasificaciones erróneas (impresión errónea como frontal/posterior o izquierda/derecha) y combinaciones falsas (dos impresiones fusionadas incorrectamente). Estos errores se corrigen fácilmente en la GUI que lo acompaña, y normalmente ocurren en sólo un pequeño porcentaje de videos filmados en condiciones normales. Incluso con tales correcciones, PrAnCER disminuye notablemente la cantidad de mano de obra manual involucrada en el análisis de la marcha. Estimamos que para cada vídeo se tarda aproximadamente 3 minutos en ejecutar PrAnCER y corregir cualquier error de salida (si es necesario), mientras que tomaría casi 10 minutos para puntuar y analizar manualmente el mismo vídeo.
Figura 1. Comparación de métodos de análisis de marcha. (A) El método tradicional de tinta y papel produce impresiones imprecisas de la forma y la ubicación de la pata. (B) La grabación de vídeo con un suelo transparente ofrece una vista detallada de las impresiones de las patas, pero contiene muchas características destacadas del cuerpo de la rata que complica la puntuación automatizada. (C) El papel ligero sobre un suelo transparente crea una imagen ruidosa y pierde detalles. (D) El uso de vitela para crear un suelo translúcido produce impresiones muy detalladas mientras se elimina visualmente el cuerpo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ilustración esquemática del aparato de la pasarela de la marcha y grabación de vídeo. (A) La rata camina a través de una pasarela clara con un piso translúcido hasta el cuadro de gol de la jaula doméstica mientras se registra desde abajo. En este caso, el vitela cubre un suelo transparente para hacerlo translúcido. La pasarela está iluminada por tiras LED colocadas a lo largo de su longitud a un nivel entre los pies y el cuerpo del animal. (B) Una captura de pantalla de una grabación de vídeo que demuestre los efectos del suelo translúcido. Dos patas son claramente visibles, pero el cuerpo de la rata es esencialmente indetectable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Proceso de detección de un fotograma de una impresión de pata. (A) La imagen original se desátula y luego se somete a la resta de fondo (B). (C) Se aplica un algoritmo de detección de bordes y los resultados se convierten en una serie de coordenadas X, Y denominadas contornos (D). (E) Los contornos se agrupan por proximidad y el casco convexo (caja delimitadora) del grupo se toma para producir un único contorno que abarque la impresión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Conversión de detecciones individuales en una impresión clasificada. (A) Las impresiones de patas se identifican por primera vez en un conjunto de marcos. (B) Las detecciones de objetos individuales reciben un número que los identifica como una impresión, que representa una sola colocación de una pata (C). (D) Por último, se clasifican como izquierda o derecha en función de su ubicación en relación con la línea media de la ruta del animal, y delante o en la parte trasera en función de su ubicación en relación con las huellas de patas anteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Ilustración de parámetros de marcha analizados. (A) Una salida de ejemplo que muestra la identificación y la ubicación de las huellas de la pata. Los bordes detectados originales se muestran en negro. Las patas detectadas finales y el área aproximada se muestran en colores que indican la clasificación de las patas. En esta figura, amarillo: frente izquierdo, verde: trasero izquierdo, cian: frente derecho, y magenta: hind right. Sin embargo, los colores se pueden cambiar en la secuencia de comandos de Python según las preferencias del usuario. (B) Una parcela que ilustra dos parámetros temporales principales: la cantidad de tiempo que cada pata está en contacto con el suelo (fase de posición) y en el aire (fase de oscilación). Los bloques de color indican la fase de postura y los espacios en blanco indican la fase de oscilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Efectos del haloperidol en la marcha. (A) Resultados del experimento 1: haloperidol de dosis alta (HalH) aumentó significativamente la longitud de la zancada y el área máxima de contacto en comparación con la condición salina (Sal). (B) El experimento 2 dio lugar a síntomas parkinsonianos más típicos; haloperidol de dosis baja (HalL) aumentó significativamente la duración de la postura y el área máxima de contacto. (C) Al comparar las condiciones tratadas con haloperidol de ambos experimentos, la dosis alta de haloperidol aumentó la base de apoyo, el área de contacto máxima y la distancia entre las extremidades en comparación con la condición de dosis baja. Los datos son medios: SEM, n.o 8. Las diferencias de las muestras en t de las muestras emparejadas fueron las siguientes: p < 0,05, p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Precisión del análisis automatizado. (A) El sistema automatizado difiere significativamente de la puntuación manual al medir BOS, aunque esto puede deberse a variaciones en la selección de centroides manuales en lugar de errores de detección. (B) El sistema automatizado no es significativamente diferente de la puntuación manual para la longitud de zancada. Estos resultados de precisión son consistentes con los de otros sistemas disponibles. Los datos son medios: SEM, n a 21. Las diferencias de las muestras emparejadas t-test fueron las siguientes: p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Comparación de parámetros temporales. Patrones temporales de marcha para un animal tratado con salina (A) y haloperidol de dosis baja (B). (C) Una ilustración de la respuesta de escape de refuerzo de una rata dada haloperidol de alta dosis. Al igual que en la Figura5, los bloques de color indican cuándo la pata estaba en contacto con el suelo (fase de postura) y los espacios en blanco indican cuándo la pata estaba en el aire (fase de oscilación). Abreviaturas: FL, frente a la izquierda; HL, trasero a la izquierda; FR, frente a la derecha; HR, trasero a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Experimento 1 | Experimento 2 | |||||||
| Prueba 1 | Prueba 2 | Prueba 3 | Prueba 4 | Prueba 5 | Prueba 6 | Prueba 7 | Prueba 8 | |
| Grupo A | HalH | Sal | HalH | Sal | Sal | HalL | Sal | HalL |
| Grupo B | Sal | HalH | Sal | HalH | HalL | Sal | HalL | Sal |
Tabla 1. Diseño experimental. Esta tabla ilustra el diseño experimental utilizado en este estudio. Utilizamos un diseño dentro del sujeto en el que cada rata fueprobada en las condiciones de haloperidol de alta dosis (Hal H), haloperidol de dosis baja (HalL)y salina (Sal). Las ratas se dividieron en dos grupos; pruebas se contrarrestó la hora del día y el orden de la condición.
| Parámetro | Definición |
| Longitud de zancada | Distancia entre contactos sucesivos de la misma pata |
| Longitud del paso | Distancia entre contactos sucesivos de patas delanteras o traseras contralaterales a lo largo del eje de la dirección de movimiento |
| Base de soporte (BOS) | Distancia entre las sucesivas patas delanteras o traseras contralaterales perpendiculares al eje de la dirección de movimiento |
| Zona de contacto máxima | El área máxima detectada de una impresión posterior |
| Distancia entre miembros | Distancia entre patas delanteras y traseras ipsilaterales |
| Duración de la postura | El tiempo que una pata estaba en contacto con el suelo |
| Duración del swing | El tiempo que una pata no estaba en el suelo |
| Stance to Swing Ratio (SSR) | Duración de la postura/duración del balanceo |
| Velocidad discreta | Longitud de zancada / (duración de la postura + duración de oscilación) para una pata |
| Velocidad media | Promedio de velocidades discretas en el período utilizado en el análisis |
| Variabilidad de velocidad | Porcentaje de cambio en las velocidades discretas durante una carrera |
| Velocidad de carrera | Tiempo para cruzar el túnel/longitud del túnel |
Cuadro 2. Descripción de los parámetros de marcha. Esta tabla describe los parámetros de marcha más utilizados; los utilizados en este estudio están indicados en negrita.
Discussion
En este estudio, probamos PrAnCER, un nuevo sistema automatizado de análisis de marcha que utiliza videos mejorados por contraste producidos utilizando un piso translúcido para oscurecer el cuerpo del animal y producir impresiones de patas claramente definidas para una simple detección automatizada. PrAnCER identifica con precisión las impresiones de las patas y es sensible a los cambios en la función del motor. Utilizamos PrAnCER para evaluar las alteraciones de la marcha en un modelo agudo de haloperidol de DP. Aunque el haloperidol no indujo los déficits motores esperados de un modelo de PD robusto, sin embargo pudimos demostrar que PrAnCER puede detectar con precisión los cambios en los patrones de marcha. Por último, cuantificamos la precisión de PrAnCER y demostramos que su medición de los parámetros clave de la marcha es comparable a la de la puntuación manual.
En ambas condiciones tratadas con haloperidol, observamos una alta incidencia de comportamiento de congelación (akinesia) seguida de una respuesta de escape de correr o delatar hacia adelante. Mientras que la acinesia se ha observado a una dosis similar (0,25 mg/kg) en varios estudios16,23, este comportamiento límite no es consistente con los síntomas típicos de Parkinson3,14,19, 24. Curiosamente, encontramos que el tratamiento con haloperidol de alta dosis dio lugar a un aumento significativo de la longitud de la zancada. Este hallazgo fue inicialmente sorprendente porque otros modelos de haloperidol de PD han mostrado una disminución en la longitud de zancada3,19. Sin embargo, tienen sentido a la luz del patrón de comportamiento de "bracing-escape" descrito por De Ryck et al. (1980), quienes informaron que las ratas corren para escapar después de períodos acinéticos, y que los gaits de alta velocidad como correr y delimitante están asociados con un mayor avance longitud4,25 (Figura8C). El tratamiento de dosis altas también dio lugar a un aumento significativo del área máxima de contacto de las patas traseras. El tratamiento con haloperidol de dosis baja dio lugar a alteraciones más características de la marcha pd, incluyendo un aumento significativo en la duración de la postura y el área máxima de contacto (Figura8A-B). Estos resultados pueden ser un reflejo de la rigidez muscular asociada con la acinesia inducida por haloperidol.
A pesar del inusual comportamiento de escape de refuerzos, pudimos demostrar que PrAnCER puede detectar alteraciones en la marcha. Mostramos que en las condiciones de iluminación correctas, un suelo translúcido puede producir una imagen muy contrastada y detallada de las patas. En el presente estudio, hicimos un suelo transparente translúcido cubriéndolo con vitela. El mismo efecto podría lograrse colocando otra cubierta translúcida, como Mylar, sobre un suelo transparente. Alternativamente, el suelo en sí podría ser translúcido mediante el uso, por ejemplo, de plexiglás esmerilado. El suelo translúcido y la sencilla pasarela de plexiglás son baratos y se pueden construir por la tarde. Nuestro sistema de análisis basado en la detección de bordes es resistente a muchas variaciones en el aparato y ofrece umbrales ajustables para adaptar el sistema a diferentes configuraciones, modelos de enfermedades o animales más pequeños como ratones.
Algunos análisis de parámetros de marcha fueron alterados de fórmulas convencionales debido a aspectos de la pasarela. Por ejemplo, nuestro método de cálculo de la velocidad difiere de otros estudios de marcha; el suelo translúcido combinado con la iluminación LED oscurece la vista del cuerpo, por lo que no es posible rastrear la posición del cuerpo para calcular la velocidad como se suele hacer. Para este estudio, la velocidad se calculó dividiendo la distancia recorrida entre dos contactos de la misma pata por el tiempo desde el primer contacto hasta el segundo contacto. Por supuesto, se podrían utilizar otras fórmulas. Por ejemplo, si se necesita una medida general de la velocidad, se podría dividir la distancia de la media de las ubicaciones de las patas delanteras al principio y al final de la ejecución por la duración de la ejecución.
Nuestro análisis confirma que, aunque no es idéntico a la puntuación manual, nuestro sistema automatizado funciona con alta precisión y genera medidas fiables de marcha. El aparato descrito aquí fue optimizado para un análisis simple y de bajo costo de la función del motor. Sin embargo, se podrían hacer varias alteraciones que ampliarían la utilidad de PrAnCER. Una limitación de nuestro sistema es que el suelo semitransparente, al tiempo que permite una excelente detección de la pata, oscurece el eje del cuerpo de los animales. Aunque no hemos encontrado necesario, esto podría abordarse añadiendo una cámara aérea al sistema. Otra mejora sería el uso de una cámara de vídeo con una mayor velocidad de fotogramas. Si bien pudimos obtener estimaciones consistentes de parámetros temporales, la precisión deestas medidas se ve comprometida a velocidades de fotogramas inferiores a 100 fps 8. Añadir una cámara de vídeo de alta velocidad no requeriría ninguna alteración del software de análisis al tiempo que aumenta la precisión y la precisión de las medidas temporales. Además, varios otros sistemas de marcha utilizan un espejo para registrar simultáneamente las vistas laterales y ventrales de la rata2,8,13. Añadir esta característica a nuestro aparato permitiría una cuantificación más precisa de la velocidad y una mejor observación del comportamiento durante las corridas.
En este estudio, mostramos que el uso de un suelo semitransparente aísla eficazmente las huellas de las patas bloqueando la visibilidad de objetos que no están en contacto con el suelo de la pasarela. Desarrollamos un sistema automatizado de puntuación que aprovecha esta impresión de pata de alto contraste para identificar con precisión las patas. Mostramos que este sistema, PrAnCER, cuantificaba los parámetros de marcha con una precisión comparable a los sistemas comerciales. Determinamos que la administración de una alta dosis de haloperidol aumentó la longitud de la zancada y el área máxima de contacto en comparación con la salina. Si bien este cambio es lo contrario de lo que esperábamos, una revisión adicional de la literatura existente indica que es probablemente parte del comportamiento de escape observado en respuesta a la administración aguda de haloperidol. El tratamiento con haloperidol en dosis bajas dio lugar a síntomas de DP más típicos, como una mayor duración de la postura y un área de contacto máxima. Concluimos que si bien la administración aguda de haloperidol de dosis altas es un modelo deficiente para estudiar las deficiencias de la marcha asociadas con la DP, nuestro estudio demostró, no obstante, la capacidad de PrAnCER para detectar con precisión los cambios en la función motora. En el futuro, esperamos validar aún más la PrAnCER mediante el estudio de los cambios locomotoras en otros modelos de enfermedades.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Carney Institute for Brain Science de la Universidad Brown.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
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| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
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| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
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| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
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| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
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| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
References
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