Summary
新しい半透明床を利用したラットの歩行特性を定量化するオープンアクセス自動化システム「コントラスト強化記録の足印解析(PrAnCER)」について説明します。歩行を定量化します。このシステムは、パーキンソン病のハロペリドールモデルを用いて検証された。
Abstract
歩行分析は、疾患の多くのげっ歯類モデルにおける運動機能の変化を定量するために使用される。研究の多くの分野で歩行と運動機能を評価することの重要性にもかかわらず、利用可能な商用オプションには、高コストやアクセス可能なオープンコードの欠如など、いくつかの制限があります。これらの問題に対処するため、歩行の自動定量化のために、コントラスト強化録音のPaw-Print解析PrAnCERを開発しました。コントラスト強化された録音は、表面に接触していない物体を隠す半透明の床を使用して生成され、ラットの足のプリントを歩きながら効果的に分離します。これらのビデオを使用して、私たちのシンプルなソフトウェアプログラムは、確実に様々な時空間歩行パラメータを測定します。PrAnCERが運動機能の変化を正確に検出できることを実証するために、パーキンソン病(PD)のハロペリドールモデルを採用しました。私たちは、ハロペリドールの2つの用量でラットをテストしました: 高用量 (0.30 mg/kg) と低用量 (0.15 mg/kg).ハロペリドールは、PDモデルで予想されるように、低用量状態でのスタンス持続時間および後足接触領域を有意に増加させた。高用量条件では、接触面積の同様の増加だけでなく、ストライド長の予想外の増加を発見しました。さらなる研究により、この増加したストライド長さは、ハロペリドールの高用量で一般的に観察されるブレースエスケープ現象と一致することがわかった。これにより、PrAnCERはげっ歯類の歩行パターンの予期せぬ変化と予期しない変化の両方を検出することができました。さらに、歩行パラメータの手動スコアリングと比較してPrAnCERが一貫性があり、正確であることを確認しました。
Introduction
げっ歯類は、関節炎1、パーキンソン病(PD)2、3、神経筋障害4、5、水頭症6を含む広範囲の疾患や傷害を研究するためのモデルとして一般的に使用されています。、および脊髄損傷7.これらの条件では、痛み、バランス、運動機能などの症状は、動物の歩行パターンを研究することによって測定することができます。これらのパターンは、足のプリントの位置とタイミング、および地面上の足の接触領域を要約する一連の時空間歩行パラメータを使用して定量化されます。
歩行分析には多くのオプションがありますが、現在のシステムにはいくつかの欠点があります。従来のインクと紙のテストでは、動物の足は白い紙のシートを横切る前にインクでコーティングされています(図1A)。結果として得られる足のプリントは、ストライドの長さとスタンス幅を測定できますが、速度やステップの持続時間などの主要な時間歩行パラメータは評価できません。最新のビデオベースのシステムはより信頼性が高いですが、適切な自動化システムを使用しない限り、ビデオ分析には手間のかかるフレームバイフレームスコアリングが必要です 8.現在、多くの商用自動採点システムが利用可能ですが、これらのシステムは非常に高価になる可能性があります。さらに、これらのシステムは、明確な床や場合によっては、トレッドミルに依存し、どちらも自然な動きを変えます。トレッドミルは、一部の疾患モデル9において運動障害をマスクすることが示されているが、クリアフローリング(図1B)は、マウスが開いているフィールドの周囲により多くの時間を費やす原因となり、不安10の増加を示す。理想的には、歩行分析装置はどちらにも依存せず、動物に対するストレスが最も少ない最も自然な運動パターンを作り出す。
利用可能なオープンソースと商用オプションは、さまざまな方法を使用して、さまざまな照明条件、動物の色、および印刷形状にもかかわらず、動物の体から足跡を分離する難しさを克服します。いくつかは圧力7、11、12に応答して光を放出する表面を使用して足に接触するコントラストを高めるが、これらは高価で技術的に構築が困難である。他のシステムは、全身のコーディネーション8、13の観察を可能にする複数の視野角を利用する。これらのオプションは、歩行を超えて追加のモータパラメータを測定するための利点を提供しますが、単純な歩行解析では不必要に複雑です。さらに、これらの技術のすべては、自然な行動を変更する明確な床に依存しています。
PrAnCERは、照明と半透明の床を組み合わせてプリントの検出を強化するコントラスト拡張録音と呼ばれるものに基づいています。下から見ると、表面(動物の体)に接触しない物体の視界を隠しながら、コントラストの高い画像(足のプリント)が作成されます(図1D)。上から見ると、床は不透明に見えます。この方法の足の結果の顕著な顕著な特徴は私たちの新しく開発された自動化されたシステムによっていろいろな歩行およびロコモーターの特徴の正確な識別を可能にする。本研究では、装置、歩行解析プロトコル、および自動採点システムPrAnCERについて述べた。私たちの装置は容易に組み立てられ、PrAnCERは病気および傷害モデルの広い範囲のモーターの欠陥を査定するために使用することができる。
PrAnCERが異常な歩行パターンを検出するために使用できることを実証するために、PDのハロペリドールモデル、ロコモータ変化14の一過性誘導のための単純なモデルを使用した。ハロペリドールは、抗精神病薬1として広く使用されているドーパミン受容体拮抗薬である。これは、基底神経節14における運動経路の重要な構成要素である線条体におけるドーパミンシグナル伝達を変化させることによって運動システムに影響を与える。ハロペリドールの単回投与でも急速に線条体の細胞外ドーパミンレベルを減少させ、パーキンソニアン様運動排便15を引き起こす。行動効果は、筋肉の剛性、アキネシア、およびカタレプシーであり、異常な位置11、16に置かれた後に正常な姿勢に戻ることができないと定義される。ハロペリドールの急性用量は、運動機能17のロタロッド試験で識別可能なロコ運動欠損を引き起こす。我々は、ハロペリドール媒介性の運動障害は、自動歩行分析にアクセス可能な多くの特性においても明らかであると推論した。
ハロペリドールに対する応答は研究によって大きく異なりますが、ハロペリドールのカタレプティック効果は0.5mg/kg以上の用量で出現し、応答性の低下と運動障害は低用量(0.1 - 0.3 mg/kg)で検出可能です16、 17.ハロペリドールのカタレプティック効果を避けるために, 我々はハロペリドールの2つの用量をテストすることを決めました: 高用量 (0.30 mg/kg) と低用量 (0.15 mg/kg).表1に示すように、実験1は高用量ハロペリドールの効果を調べ、実験2は低用量ハロペリドールの効果を試験した。我々は、すべてのラットが高用量、低用量、および制御(生理)条件で試験された被験者内設計を使用した。条件の順序はラット間で相殺された。ハロペリドールの急性投与は、速度の低下、ストライド長の減少、スタンス期間3、14、18などのPDの他のモデルと同様の歩行障害を引き起こすと予測しました。 、19.両方の用量でハロペリドール投与後のアキネシアを含む行動変化を観察した.低用量状態では、ラットは予想通り、スタンス持続時間と後足接触領域を有意に増加させた。これらの歩行変化は、PD患者2、20の間で一般的な遅い、シャッフルステップに匹敵する。しかし、高用量条件では、歩幅の長さの増加と足の接触面積の増加が見られました。ストライドの長さの増加は予想外であったが、文献のさらなるレビューは、ハロペリドール誘発ブレースエスケープ応答の一部である可能性が高いことを示した。PrAnCERは、神経レプティクスの使用と一致するげっ歯類の歩行におけるパーキンソン病様変化を検出することができると結論付ける。
Protocol
すべての手順は、ブラウン大学の機関動物ケアと使用委員会のガイドラインに従っていました.
1. 歩行分析装置
- 透明なプレキシガラス床に配置された透明なプレキシガラス囲まれた歩道(36"L x 3" W x 4.5"H)からなる歩行分析歩道を準備します(図2A)。プレキシガラスの床を、歩道と同じ幅にカットした16LB綿繊維製図ベラムで覆うことで半透明にします。
注:床を半透明にするための他の方法があります。 - フレームレートが少なくとも 30 フレーム/秒 (fps) のカメラを歩道の真下に配置して、トラックの中央をキャプチャします (図 2B)。
- 18個のLED/フィートを約2インチ離れ、歩道の床から1インチ上に1インチのストリップを固定し、トラックを照らします。
2. 動物の準備
- 動物が取り扱いの少なくとも1週間ビバリウムに順応することを許可する。実験開始前に少なくとも5日間ラットを取り扱う。この研究は、生後約3ヶ月の雄ロングエバンスラット8匹を用いて行った。
-
実験室に動物を習慣化し、部屋のライトをオフにして歩行歩道
- ゴールボックスとして機能するように、歩行歩道の端に表面レベルにラットのホームケージを配置します。ホームケージが深い場合、老化または運動障害を持つラットは、ホームケージへのアクセスを容易にするためにランプまたはステップの恩恵を受ける可能性があることに注意してください。
- ラットが実験者の手から歩道の長さまで歩いてホームケージに到達できるようにします。
- ネズミは、ホームケージに飛び込む前に周りを見回すために歩道の端に立ち止まることがよくあります。ネズミが歩道を出るのに1分以上かかる場合は、穏やかなプッシュでホームケージに入るように勧める。
- ラットが振り向く場合は、小さなプレキシガラスを使用して、歩道の「開始」端をブロックします。合計 3 回実行を繰り返します。
- 少なくとも2日間、またはラットが凍結することなく安定したペースで歩道を横断するまで習慣化してください。
3. 歩行試験手順
- ウェブカメラソフトウェアの設定を調整して、足のプリントの最も明確な画像を実現します。すべての歩行テストのルーム ライトをオフにします。
- 各実行を個別に記録し、自動分析プログラムで使用するために適切にラベルを付けます。
- ベラムに斑点や破片がないことを確認します。ラットが歩道に入る数秒前に記録を開始し、ラットが歩道を出てホームケージに入ると停止します。
- 3 つの許容実行が完了するか、10 分が経過するまで続行します。
- 各ラットの間にエタノールで歩道を拭き取り、必要に応じてベリウムを交換します。
注:許容される試験は、動物が一貫して歩き、実行の最初の4ステップを一時停止せずに歩くものとして定義されます。これが達成しにくい場合は、一時停止または突然の加速なしで発生する実行の任意の時点で 4 つの連続したステップがある試行を含むように基準を調整します。
4. PrAnCER自動分析
- 分析するすべてのビデオをフォルダに配置します。
- Python スクリプトPrAnCERを実行して PrAnCER を起動します。PrAnCER は、図 3および図 4に示す手順に基づいてビデオを分析します。
- ポップアップメニューで、[フォルダの選択]ボタンを押して、指定したフォルダを選択します。必要に応じて、分析用のカスタム オプションを選択します。各パラメータの詳細な説明は、その横にある疑問符をクリックして見つけることができます。[完了したら続行]をクリックします。
- 表示される歩道のイメージ上に対象領域 (ROI) を定義します。これを行うには、左クリックして上端を定義し、右クリックして下端を定義します。表示されるボックスが正しい場合は、N キーを押して続行します。 そうでない場合は、Z キーを押して元に取り消します。 Nを押すと、プログラムは自動的に実行されます。
- PrAnCER が完了したら、端末のEnterキーを押してプログラムを終了します。
- PrAnCER の出力を手動で確認するには、Python スクリプトGaitEditorGUIを実行し、各ビデオに適した .mp4 ファイルを選択します。必要に応じて、誤った識別または差し込み印刷を修正します。
- 空間および時間的な歩行パラメータを抽出するには、Python スクリプトパラメータアナライザを実行します。分析する後続の印刷物の数と分析するビデオのフォルダを選択し、[続行]をクリックします。これにより、表 2に示し、図 5に示す多数の一般的な歩行パラメータを含む各ビデオの .csv ファイルが出力されます。
注: 完全なスクリプトとデータの読み取りと分析の手順は、作成者の GitHub (www.github.com/hayleybounds) で入手できます。私たちは、無料のオープンソースPythonライブラリOpenCV21を使用して、このアルゴリズムを実装しました。また、GitHub には歩行分析用の歩道を構築する手順も含まれています。
Representative Results
ハロペリドール手順
この歩行解析システムを開発し、コントロールラットの歩行パラメータを、様々な運動、歩行、バランス障害を示す実験ラットの歩行パラメータを比較した。我々は、すべてのラットが生理生理生理生理生理、高用量ハロペリドールおよび低用量ハロペリドール条件で試験された被験者内設計を使用した。ラットは、カウンターバランシングを可能にするために2つのグループ(AとB)に分けました。歩行試験は、時間帯と状態の順序に対して相殺されました。各試験は48時間で分離し、ラットは生理生理生殖量またはハロペリドールのいずれかの経頭膜内(IP)注射を受け取る前にイソフランで軽く麻酔した。歩行は1時間の注射後に試験され、その時点でハロペリドールはピークレベル15、16、17にする必要があります。
行動結果
ハロペリドールで治療した動物の顕著な行動変化を観察した。高用量状態では、8匹のラットのうち5匹が歩道の開始時に不動の期間を有し、その間、実験者がそれらに触れ、動かすのに抵抗力があった。いくつかのケースでは、この状態は、ラットが歩道から取り除かれるまで数分間持続しました。他のケースでは、不動のラットは突然急に速く移動するか、または歩道を横切って「バインド」し、その後、終わりに近い不動状態に戻ります。低用量条件では、8匹のラットのうち3匹が同様の不動期間を持っていた。この投与量で, 境界動作のインスタンスは 1 つだけでした。.動物を生理生理で治療した場合、境界は認められなかった。
サポートのベース、ストライド長さ、ストライド速度、スタンス持続時間、スタンス対スイング比、最大接触面積、および四肢距離の下でのハロペリドールの効果を分析しました。前肢と後肢の歩行パラメータの多くは同一であり、ハロペリドールは一般的にすべての四肢に均一な影響を与えるため、後肢のみのパラメータを計算し、左右の手足のデータを分離しませんでした。各ラットについて、各試験日から使用可能なすべての実行から各歩行パラメータの平均を計算しました。すべてのパラメータ(速度変動を除く)は、実行の最初の4つの使用可能なステップの平均として計算されました。ハロペリドールの各投与量が歩行に大きな影響を与えたかどうかを評価するために、ペアサンプルt検定を使用した。実験1では、高用量ハロペリドールで処理された動物において、歩幅の長さ(図6A;t(7)=-2.962、p=0.021)および最大接触面積(図6A;t(7)=-2.51、p=0.04)の有意な増加があった。支持、スピード、スタンス持続時間、スイング比に対するスタンスのベースは重要ではありませんでした。実験2では、低用量ハロペリドールを与えられた動物は、生理生殖条件と比較して、スタンス持続時間(図6B;t(7)=-2.444、p=0.044)および最大接触面積(図6B;t(7)=-3.085、p=0.018)の有意な増加を示した。他の歩行パラメータは有意ではなかった。さらに、サポートベースの高用量と低用量ハロペリドール条件(図6C;t(7)=2.651、p = 0.033)、最大接触面積(図6C;t(7)=4.635、p=0.002)の間に有意な差がありました。図 6C;t(7) = 3.098、p = 0.017)
自動化されたシステムの位置の正確さおよび誤り
PrAnCERの精度を評価するために、その自動分析を、6匹のコントロールラットの別のグループからランダムに選択された21本のビデオの手動スコアリングと比較しました。手の採点のために、ビデオは一連の画像に変換され、その後、印刷物の位置を手動でマークするために使用されました。効率化のため、後部プリントのみから測定された空間データに関する分析に焦点を当てました。各ビデオの平均ストライド長とBOSを抽出し、自動化値と比較しました。平均ストライド長は、手動スコアリングとPrAnCER解析(図7B;t(20)=-0.01、p=0.99)の間で有意に異なっていましたが、支持の基準は有意でした(図7A;t(20)= -2.21、p = 0.038)。自動スコアリングと手動スコアリングは一般的に良好に相関していましたが、自動システムは平均で5%大きいBOSを報告しました。この違いは、検出エラーではなく、セントロイド選択の分散が原因である可能性があります。手動スコアリングでは、PrAnCERの質量推定の中心の方法を手動で複製することは困難となるために、印刷場所は、各後部印刷のベースの周りに楕円形を描いてマークされました。明らかな傾向は、一部の動物が非対称的な方法でつま先を再生する可能性があるため、PrAnCERが手動スコアリングよりも極端な高等を観察する原因となる可能性があるため、PRAnCERがBOSを過大評価することでした。他のシステムはまた、一貫したストライド長さ測定17にもかかわらず、手動と自動スコアリングの間のBOSの大幅な増加を指摘しています。観察される小さな違いと他のシステムとの一貫性を考慮すると、PrAnCERは歩行パラメータの信頼性の高い尺度であると結論付けます。
すべての精度分析は、PrAnCERのGUIを使用して自動出力を手動で修正した後に行われたことに注意してください。既存の商用システムと同様に、この手順は、スコアリングのエラーを修正し、条件22を満たさない実行を排除するために必要です。ポストホックを修正する方が簡単なため、PrAnCER は偽陽性の側で誤りを修正するように調整しました。私たちは、PrAnCERが500以上のビデオの手動補正中に実際のプリントを検出するために失敗を観察したことがない。しかし、他のタイプのエラーが観察されました。これらは、誤検出 (印刷としての非印刷の検出)、誤分類 (前面/後部または左/右と誤ってラベル付けされた印刷)、および誤った組み合わせ (2 つの印刷物が誤ってマージされた) の 3 つのカテゴリに分類されます。これらのエラーは付属の GUI で簡単に修正され、通常は通常の条件下で撮影されたビデオのほんの一部でしか発生しません。このような補正を行っても、PrAnCERは歩行分析に関わる手作業量を著しく減少させる。各ビデオについて、PrAnCER を実行して出力エラーを修正するのに約 3 分かかると見積もっていますが、手動で同じビデオをスコア付けして分析するには約 10 分かかります。
図 1.歩行分析方法の比較(A)従来のインクと紙の方法では、足の形や位置の不正確なプリントが生成されます。(B)透明な床を持つビデオ録画は、足のプリントの詳細なビューを提供しますが、自動化されたスコアリングを複雑にするラットの体から多くの顕著な特徴が含まれています。(C)クリアフロアの上に軽量の用紙がノイズの多い画像を作成し、詳細を失います。(D)半透明の床を作成するためにベラムを使用すると、視覚的に体を排除しながら、非常に詳細なプリントを生成します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.歩行歩道装置及びビデオ録画の概略図。(A)ラットは、下から記録されている間、ホームケージゴールボックスに半透明の床を持つ明確な歩道を歩きます。この場合、ベラムは透明な床を覆い、半透明にします。歩道は、動物の足と体の間のレベルでその長さに沿って配置されたLEDストリップによって照らされます。(B)半透明の床の効果を示すビデオ録画のスクリーンショット。2本の足ははっきりと見えますが、ラットの体は本質的に検出できません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.足のプリントの1フレームの検出プロセス。(A)元の画像はノイズが除去され、背景減算(B)が行われます。(C)エッジ検出アルゴリズムが適用され、結果は輪郭(D)と呼ばれる一連の X、Y 座標に変換されます。(E)輪郭は近接でグループ化され、グループの凸部ハル(境界ボックス)は、印刷を含む単一の輪郭を生成するために取られます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.個々の検出を分類された印刷に変換する。(A)足のプリントは、最初にフレームのセットで識別されます。(B)個々のオブジェクト検出には、それらを印刷として識別する番号が与えられ、片方の片方の配置(C)を表します。(D)最後に、動物のパスの中線に対する位置に基づいて左右に分類され、前の足のプリントに対する位置に基づいて前後に分類されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.分析された歩行パラメータの図。(A)足のプリントの識別と位置を示す出力の例。元の検出されたエッジは黒で表示されます。最終的に検出された足とおおよその領域は、足の分類を示す色で示されます。この図では、黄色:左前、緑:左後部、シアン:正面右、マゼンタ:右後部。ただし、Python スクリプトではユーザーの好みに応じて色を変更できます。(B) 2つの主要な時間パラメータを示すプロット:各足が地面(スタンス位相)と空気中に接触する時間(姿勢相)と空気中(スイング相)。色付きのブロックはスタンスフェーズを示し、空白はスイングフェーズを示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.歩行に対するハロペリドールの影響(A)実験の結果1:高用量ハロペリドール(HalH)は、生理生理生理物の状態(Sal)と比較してストライド長および最大接触面積を有意に増加させた。(B)実験2は、より典型的なパーキンソニアン症状をもたらした。低用量ハロペリドール(HalL)有意に増加したスタンス持続時間および最大接触面積。(C)両実験からハロペリドール処理条件を比較した場合、高用量ハロペリドールは支持体のベースを増加させ、最大接触面積及び低用量条件と比較して四肢間距離を増加させた。データは±SEM、n =8を意味する。対になったサンプルt検定の違いは以下の通りでした: #p < 0.05, ## p < 0.01.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.自動分析の精度。(A)自動システムは、BOSを測定する際の手動スコアリングとは大きく異なりますが、検出エラーではなく、手動の経心度選択のバリエーションが原因である可能性があります。(B)自動システムは、ストライドの長さの手動スコアリングと大きく異なりません。これらの精度の結果は、他の利用可能なシステムの結果と一致します。データは±SEM、n=21を意味する。対になったサンプルt検定の違いは以下の通りであった: #p < 0.05.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8.時系列パラメータの比較。生理生理生理生理(A)および低用量ハロペリドール(B)で処理された動物の時間歩行パターン。(C)高用量ハロペリドールを与えられたラットからのブレースエスケープ応答の図。図5のように、色付きのブロックは足が地面に接触した日時 (スタンスフェーズ) を示し、空白は足が空中にいたとき(スイングフェーズ)を示します。略語: FL,左手前;HL,左後ろ;FR、正面右;HR、後ろだこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 実験 1 | 実験2 | |||||||
| テスト 1 | テスト 2 | テスト 3 | テスト 4 | テスト 5 | テスト 6 | テスト 7 | テスト 8 | |
| グループ A | ハルH | サル | ハルH | サル | サル | ハルL | サル | ハルL |
| グループ B | サル | ハルH | サル | ハルH | ハルL | サル | ハルL | サル |
表 1.実験設計。この表は、この研究で使用される実験計画を示しています。我々は、すべてのラットが高用量ハロペリドール(Hal H)、低用量ハロペリドール(HalL)および生理生理生理物(サル)条件で試験された被験者内設計を使用した。ラットを2つの群に分けました。テストは、一日の時間と条件の順序に対して相殺されました。
| パラメーター | 定義 |
| ストライドの長さ | 同じ足の連続する接触間の距離 |
| ステップの長さ | 動きの方向の軸に沿った反対方向前面または後ろ足の連続した接触間の距離 |
| サポートのベース (BOS) | 連続する反対方向の前部または後ろ足の間の距離は、動きの方向の軸に垂直 |
| 最大接触領域 | 後続印刷の最大検出領域 |
| リム間距離 | 前部と後ろ足の間の距離 |
| スタンスデュレーション | 足が地面に接触した時間の長さ |
| スイングデュレーション | 足が地面になかった時間の長さ |
| スイング比に対するスタンス(SSR) | スタンス持続時間/スイング持続時間 |
| 不連続速度 | 足のストライド長さ/(スタンス持続時間+スイング持続時間) |
| 平均速度 | 分析に使用される期間の離散速度の平均 |
| 速度の変動性 | 実行中の不連続速度の変化率 |
| 実行速度 | トンネル/トンネルの長さを横断する時間 |
表 2.歩行パラメータの説明。次の表は、最も一般的に使用される歩行パラメータについて説明します。本研究で使用したものは太字で示されています。
Discussion
本研究では、半透明の床を使用して生成されたコントラスト強化されたビデオを利用して動物の体を覆い隠し、簡単な自動検出のために明確に定義された足のプリントを得る新しい自動歩行解析システムPrAnCERをテストしました。PrAnCERは足の指紋を正確に識別し、モーター機能の変化に敏感である。PRAnCERを用い、PDの急性ハロペリドールモデルにおける歩行変化を評価した。ハロペリドールは、堅牢なPDモデルの予想される運動障害を誘発しませんでしたが、それでもPrAnCERが歩行パターンの変化を正確に検出できることを実証することができました。最後に、PrAnCERの精度を定量化し、キー歩行パラメータの測定が手動スコアリングの測定に匹敵することを実証しました。
ハロペリドール処理条件の両方で、凍結挙動(アキネシア)の高い発生率を観察し、その後、前方走行または境界のエスケープ応答が続いた。アキネシアは、いくつかの研究で同様の用量(0.25 mg/kg)で観察されているが、この境界行動は典型的なパーキンソニアン症状3、14、19と一致しない、 24.興味深いことに、高用量ハロペリドール治療は、ストライド長が有意に増加した結果であることがわかった。PDの他のハロペリドールモデルがストライド長3、19の減少を示しているので、この発見は最初は驚くべきことでした。しかし、De Ryck et al.(1980)が述べた「ブレーシングエスケープ」行動パターンに照らして、ラットはアキネティック期間の後に逃げ出し、ランニングやバウンディングなどの高速歩行が増加したストライドに関連していると報告した。長さ4、25(図8C)。高用量治療はまた、後肢の最大接触領域を有意に増加させた。低用量ハロペリドール治療は、スタンス持続時間および最大接触面積の有意な増加を含む、より特徴的なPD歩行変化をもたらした(図8A-B)。これらの結果は、ハロペリドール誘発アキネシアに関連する筋肉剛性の反映でありうっていう。
異常なブレースエスケープ動作にもかかわらず、PrAnCERが実際に歩行の変化を検出できることを実証することができました。我々は、正しい照明条件で、半透明の床が足の非常に対照的で詳細な画像を生成できることを示しました。本研究では、ベラムで覆うことで透明な床を半透明にした。同じ効果は、透明な床の上にMylarのような別の半透明のカバーを置くことによって達成することができる。あるいは、床自体は、例えば、曇ったプレキシガラスを使用して半透明にすることができる。半透明の床とシンプルなプレキシガラスの歩道は安価であり、午後に構築することができます。当社のエッジ検出ベースの解析システムは、装置の多くのバリエーションに対して弾力性があり、マウスなどの異なるセットアップ、疾患モデル、または小動物にシステムを適応させる調整可能なしきい値を提供します。
歩行パラメータ解析の一部は、歩道の側面のために従来の式から変更されました。たとえば、速度を計算する方法は、他の歩行研究とは異なります。LED照明と組み合わせた半透明の床は、ボディのビューを不明瞭にするので、通常のように速度を計算するために体の位置を追跡することは不可能です。本研究では、同じ足の2つの接触間を移動する距離を、第1接触から第2の接触までの時間で割ることによって速度を算出した。もちろん、他の式も使用できます。たとえば、全体的な速度の尺度が必要な場合は、実行の開始時と終了時のフォアポー位置の平均距離を実行の継続時間で除算できます。
当社の分析は、手動スコアリングと同じではありませんが、当社の自動化システムが高精度で動作し、歩行の信頼性の高い測定を生成することを確認します。ここで説明する装置は、モータ機能の簡便で低コストな分析のために最適化された。ただし、PrAnCER の有用性を拡張するいくつかの変更が行われる可能性があります。私たちのシステムの1つの制限は、半透明の床は、優れた足の検出を可能にしながら、動物の体軸を不明瞭にすることです。我々はそれが必要であることが見つかりませんでしたが、これはシステムにオーバーヘッドカメラを追加することによって対処することができます。もう一つの改善は、より高いフレームレートを持つビデオカメラの使用であろう。時間パラメータの一貫した推定値を得ることができましたが、これらのメジャーの精度は 100 fps8未満のフレーム レートで損なわれます。高速ビデオカメラを追加すると、時間的な測定の精度と精度を高めながら、分析ソフトウェアを変更する必要はありません。さらに、他のいくつかの歩行システムは、同時にラット2、8、13の横および腹部のビューを記録するためにミラーを使用する。この機能を装置に追加することで、速度をより正確に定量し、走行中の挙動をより良く観察することができます。
本研究では、半透明の床を用いることで、歩道床に接触しない物体の視認性を遮断することで、足のプリントを効果的に分離することを示した。このコントラストの高い足のプリントを利用して足を正確に識別する自動採点システムを開発しました。我々は、このシステム、PrAnCER、商業システムに匹敵する精度で歩行パラメータを定量化することを示した。ハロペリドールの高用量の投与は、生理生理に比べてストライド長および最大接触面積を増加させたと判断した。この変化は我々が期待したものとは正反対であるが、既存の文献のさらなるレビューは、ハロペリドールの急性投与に応じて観察された脱出行動の一部である可能性が高いことを示している。低用量ハロペリドール治療は、スタンス持続時間の増加および最大接触面積などのより典型的なPD症状をもたらした。我々は、急性高用量ハロペリドール投与はPDに関連する歩行障害を研究する貧弱なモデルであるが、我々の研究は、それにもかかわらず、運動機能の変化を正確に検出するPrAnCERの能力を実証したと結論付けた。将来的には、他の疾患モデルにおける運動運動の変化を研究することで、PrAnCERのさらなる検証を行いたいと考えています。
Disclosures
著者は、開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、ブラウン大学のカーニー脳科学研究所によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
|
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
|
| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
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| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
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| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
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| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
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