Summary
우리는 새로운 걸음걸이 분석 시스템, 대조 강화 기록의 발 인쇄 분석 (PrAnCER), 자동으로 새로운 반투명 바닥을 활용 쥐의 보행 특성의 정량화를위한 오픈 액세스 자동화 시스템 걸음걸이를 정량화합니다. 이 시스템은 파킨슨 병의 할로페리돌 모델을 사용하여 검증되었습니다.
Abstract
걸음걸이 분석은 질병의 많은 설치류 모형에 있는 운동 기능의 변경을 정량화하기 위하여 이용됩니다. 많은 연구 분야에서 걸음걸이 및 모터 기능을 평가하는 것이 중요함에도 불구하고 사용 가능한 상용 옵션은 높은 비용과 접근 가능한 개방형 코드의 부족과 같은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 보행의 자동 정량화를 위해 대비 강화 된 레코딩의 PrAnCER, 발 인쇄 분석을 개발했습니다. 대비를 강화한 레코딩은 표면에 접촉하지 않는 물체를 가리는 반투명 바닥을 사용하여 쥐의 발 인쇄를 효과적으로 분리하여 생성합니다. 이 비디오를 사용하여, 우리의 간단한 소프트웨어 프로그램은 안정적으로 시공간 보행 매개 변수의 다양한 측정합니다. PrAnCER가 운동 기능의 변화를 정확하게 감지할 수 있음을 입증하기 위해 파킨슨 병 (PD)의 할로페리돌 모델을 사용했습니다. 우리는 할로페리돌의 두 복용량에서 쥐를 테스트: 고용량 (0.30 mg/kg) 그리고 낮은 복용량 (0.15 mg/kg). Haloperidol 크게 증가 자세 기간 및 낮은 복용량 조건에서 뒷발 접촉 영역, PD 모델에서 예상 될 수 있는. 고용량 조건에서, 우리는 접촉 지역에 있는 유사한 증가 그러나 또한 보폭 길이에 있는 예기치 않은 증가를 찾아냈습니다. 추가 연구와 함께, 우리는이 증가 보폭 길이 일반적으로 haloperidol의 높은 복용량에서 관찰 브레이싱 탈출 현상과 일치 발견. 따라서, PrAnCER설치류 보행 패턴의 예상 및 예기치 않은 변화를 모두 감지할 수 있었다. 또한 걸음걸이 매개 변수의 수동 채점과 비교할 때 PrAnCER가 일관되고 정확하다는 것을 확인했습니다.
Introduction
설치류는 일반적으로 관절염1,파킨슨 병 (PD) 2,3,신경 근육 장애 4,5,수두증 6을 포함한 광범위한 질병 과 부상을 연구하는 모델로 사용됩니다. 및 척수 손상7. 이러한 조건에서, 통증 과 같은 증상, 균형, 그리고 모터 기능 동물의 보행 패턴을 공부 하 여 측정될 수 있다. 이러한 패턴은 발 인쇄의 위치와 타이밍뿐만 아니라 지면의 발 접촉 영역을 요약하는 시간적 보행 매개 변수 세트를 사용하여 정량화됩니다.
보행 분석에 대한 많은 옵션이 존재하지만 현재 시스템에는 몇 가지 단점이 있습니다. 전통적인 잉크 및 종이 테스트에서 동물의 발은 흰색 종이를 가로 질러 걷기 전에잉크로 코팅됩니다 (그림 1A). 그런 다음 결과 발 인쇄를 보폭 길이및 자세 너비로 측정할 수 있지만 속도 또는 걸음 수 와 같은 주요 시간 보행 매개변수는 평가할 수 없습니다. 최신 비디오 기반 시스템은 더 안정적이지만 비디오 분석에는 적절한 자동화 시스템을 사용하지 않는한 프레임별 채점이 필요합니다 8. 현재 사용 가능한 상용 자동 채점 시스템이 많이 있지만 이러한 시스템은 엄청나게 비쌀 수 있습니다. 또한 이러한 시스템은 투명한 바닥재 나 경우에 따라 러닝 머신에 의존하며, 이 둘 다 자연스러운 움직임을 변화시웁니다. 러닝머신은 일부 질병 모델 9에서 모터적자를 마스크하는 것으로 나타났으며, 클리어 플로어링(그림1B)은마우스가 개방된 필드의 둘레에 더 많은 시간을 할애하게 하는 반면, 증가된불안(10)을나타낸다. 이상적으로, 걸음걸이 분석 장치는 동물에게 최소한의 스트레스로 가장 자연스러운 운동 패턴을 생성하는 중 하나에 의존하지 않을 것입니다.
사용 가능한 오픈 소스 및 상용 옵션은 다양한 조명 조건, 동물 색상 및 인쇄 모양에도 불구하고 동물의 몸에서 발자국을 분리하는 어려움을 극복하기 위해 다양한 방법을 사용합니다. 일부는 압력7,11,12에대한 응답으로 빛을 방출표면을 사용하여 접촉 발의 대조를 향상하지만, 이들은 비용이 많이 들고 기술적으로 구성하기 어렵다. 다른 시스템은 전신 조정의 관찰을 허용하는 다중 시야각을 활용8,13. 이러한 옵션은 걸음걸이 이외의 추가 모터 파라미터를 측정할 때 이점을 제공하지만 간단한 걸음걸이 해석을 위해 불필요하게 복잡합니다. 또한, 이러한 기술의 모든 자연 행동을 변경 명확한 바닥에 의존한다.
PrAnCER는 조명과 반투명 바닥의 조합을 사용하여 인쇄물 감지를 향상시키는 콘트라스트 강화 레코딩을 기반으로 합니다. 아래에서 보면 표면과 접촉하지 않는 물체의 뷰를 가리면서 고대비 이미지(발 인쇄)를 만듭니다(그림1D). 위에서 보면 바닥이 불투명해 보입니다. 우리의 방법에서 발의 결과 salience는 우리의 새로 개발 된 자동화 된 시스템에 의해 보행 및 운동 특성의 다양한 정확한 식별을 허용합니다. 본 연구에서는 장치, 걸음걸이 분석 프로토콜 및 자동 채점 시스템인 PrAnCER에 대해 설명합니다. 당사의 장치는 쉽게 조립되며 PrAnCER는 광범위한 질병 및 부상 모델에서 모터 적자를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
PrAnCER가 비정상적인 걸음걸이 패턴을 감지하는 데 사용될 수 있음을 입증하기 위해, 우리는 PD의 할로페리돌 모델을 사용, 운동 변화14의과도 유도를위한 간단한 모델. 할로페리돌은 항정신병제로 널리 사용되는 도파민 수용체 길항제1. 그것은 줄무늬에서 도파민 신호를 변경 하 여 모터 시스템에 영향을, 기저 중 추에 모터 경로의 중요 한 구성 요소14. 할로페리돌의 단일 용량조차도 줄무늬의 세포 외 도파민 수치를 빠르게 감소시켜 파킨슨병과 같은 운동 배변을 유발하는15. 행동 효과는 비정상적인 위치11,16에배치 된 후 정상적인 자세로 돌아갈 수없는 것으로 정의되는 근육 강성, 운동 장애 및 카탈렙시입니다. 할로페리돌의 급성 투여는 운동 기능(17)의 로타로드 시험에서식별 가능한 운동 적자를 일으킨다. 우리는 할로페리돌 매개 운동 장애도 자동 걸음걸이 분석에 접근할 수 있는 여러 가지 특성에서 분명할 것이라고 추론했습니다.
할로페리돌에 대한 반응은 연구에 따라 매우 다양하지만, 할로페리돌의 카탈로틱 효과는 0.5 mg/kg 이상으로 나타나며, 감소된 반응성과 운동 장애는 더 낮은 용량(0.1 - 0.3 mg/kg)에서 검출가능하며,16, 17. 할로페리돌의 카탈로피 효과를 피하기 위해, 우리는 할로페리돌의 두 가지 복용량을 테스트하기로 결정했습니다 : 고용량 (0.30 mg / kg) 및 낮은 복용량 (0.15 mg / kg). 표1에 나타난 바와 같이, 실험 1은 고용량 할로페리돌의 효과를 조사한 반면, 실험 2는 저용량 할로페리돌의 효과를 시험하였다. 우리는 모든 쥐가 고용량, 낮은 복용량 및 제어 (식염수) 조건에서 테스트된 내 주제 디자인을 사용했습니다. 조건의 순서는 쥐에 걸쳐 균형을 했다. 우리는 할로페리돌의 급성 투여가 속도 감소, 보폭 감소, 자세 지속 시간3,14,18 등 PD의 다른 모델에서 발견된 것과 유사한 보행 장애를 일으킬 것으로 예상했습니다. ,19. 우리는 두 복용량에서 haloperidol 행정 다음 운동 장애를 포함 하 여 행동 변화를 관찰. 낮은 복용량 조건에서, 쥐는 크게 자세 기간 및 뒷발 접촉 영역을 증가 했다, 예상 대로. 이러한 보행 변화는 PD 환자 2,20사이에서일반적인 느리고 셔플 단계와 비슷합니다. 고용량 조건에서, 그러나, 우리는 보폭 길이의 증가뿐만 아니라 발 접촉 영역의 증가를 보았다. 보폭 의 증가는 예상치 못한 것이었지만, 문헌의 추가 검토는 할로페리돌유도 브레이싱-이스케이프 반응의 일부일 가능성이 높다는 것을 나타냈다. 우리는 PrAnCER는 실제로 신경 이완제의 사용과 일치 설치류 보행에 파킨슨 병 같은 변화를 감지 할 수 있다는 결론을 내린다.
Protocol
모든 절차는 브라운 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침에 따라했다.
1. 걸음걸이 분석 장치
- 투명 플렉시 유리 바닥에 배치 된 투명 플렉시 유리 동봉 된 통로 (36 "L x 3"W x4.5"H)로 구성된 보행 분석 보도를 준비하십시오 (그림 2A). 플렉시 유리 바닥을 16 LB 면 섬유 제도 벨룸 조각으로 덮어 통로와 동일한 너비로 자르십시오.
참고 : 바닥을 반투명하게 만드는 다른 방법이 있습니다. - 트랙의 중간을 캡처하기 위해 보도 바로 아래에 초당 30프레임(fps) 이상의 프레임 속도로카메라를 배치합니다(그림 2B).
- 12V LED 조명 스트립을 약 2인치 떨어진 18개의 LED/피트와 1인치 높이의 통로 바닥 위로 고정하여 트랙을 비추십시오.
2. 동물 준비
- 동물이 취급하기 전에 적어도 1 주일 동안 사육장에 적응할 수 있도록 하십시오. 실험을 시작하기 최소 5일 전에 쥐를 다루다. 이 연구는 사용 8 남성 롱 에반스 쥐 약 3 개월.
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동물을 시험실로 가서 실내 조명이 꺼져 있는 보행로에 습관을 들이세요.
- 쥐의 홈 케이지를 걸음걸이 통로 끝에 있는 표면 높이에 놓아 골상자역할을 합니다. 홈 케이지가 깊으면 숙성되거나 운동 능력이 손상된 쥐가 경사로 나 단계의 혜택을 받아 홈 케이지에 쉽게 접근 할 수 있습니다.
- 쥐가 실험자의 손에서 통로의 길이를 따라 걸어서 홈 케이지에 도달하게 하십시오.
- 쥐는 종종 홈 케이지로 뛰어 내려가기 전에 주위를 둘러보기 위해 보도의 끝에서 멈춥니다. 쥐가 보도를 빠져나가는 데 1분 이상 걸리는 경우, 부드럽게 밀어 넣은 채 홈 케이지에 들어가도록 권장합니다.
- 쥐가 돌아서면 작은 플렉시 글라스 조각을 사용하여 보도의 "시작"끝을 차단합니다. 총 3회 실행에서 반복합니다.
- 적어도 2 일 동안 또는 쥐가 동결하지 않고 꾸준한 속도로 산책로를 횡단 할 때까지 습관화하십시오.
3. 걸음걸이 테스트 절차
- 웹캠 소프트웨어의 설정을 조정하여 발 인쇄의 가장 선명한 그림을 얻을 수 있습니다. 모든 걸음걸이 테스트를 위해 실내 조명을 끕니다.
- 각 실행을 개별적으로 기록하고 자동화된 분석 프로그램과 함께 사용할 수 있는 적절한 라벨을 지정합니다.
- 벨룸에 반점이나 파편이 없는지 확인하십시오. 쥐가 산책로에 들어가기 전에 몇 초 간 녹음을 시작하고 쥐가 보도를 빠져나와 홈 케이지에 들어가면 멈춥시다.
- 허용되는 세 번의 실행이 완료되거나 10분이 경과할 때까지 계속합니다.
- 각 쥐 사이에 에탄올로 통로를 닦고 필요에 따라 벨룸을 교체하십시오.
참고: 허용 가능한 시험은 동물이 달리기의 처음 4단계에 대해 일시 정지 없이 일관되게 걷는 것으로 정의됩니다. 이를 달성하기 어려운 경우 일시 중지 또는 갑작스러운 가속 없이 발생하는 실행의 어느 지점에서든 연속 단계가 4단계인 시험을 포함하도록 기준을 조정합니다.
4. PrAnCER 자동화 분석
- 분석할 모든 비디오를 폴더에 넣습니다.
- 파이썬 스크립트 PrAnCER를실행하여 PrAnCER를 시작합니다. PrAnCER는 그림 3 및 그림 4에 설명된 단계를 기반으로 비디오를 분석합니다.
- 팝업 메뉴에서 폴더 선택 단추를 눌러 지정된 폴더를 선택합니다. 원하는 경우 분석을 위한 사용자 지정 옵션을 선택합니다. 각 매개 변수에 대한 자세한 설명은 옆에 있는 물음표를 클릭하여 찾을 수 있습니다. 완료되면 계속을 클릭합니다.
- 표시되는 통로 이미지에서 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 이렇게 하려면 왼쪽 을 클릭하여 위쪽 가장자리를 정의하고 오른쪽 단추를 클릭하여 아래쪽 가장자리를 정의합니다. 나타나는 상자가 올바른 경우 N을 눌러 계속합니다. 그렇지 않은 경우 Z를 눌러 취소합니다. N을 누르면 프로그램이 자동으로 실행됩니다.
- PrAnCER가 완료되면 터미널에 입력을 눌러 프로그램을 종료합니다.
- PrAnCER의 결과 출력을 수동으로 검토하려면 파이썬 스크립트 GaitEditorGUI를 실행하고 각 비디오에 적합한 .mp4 파일을 선택합니다. 필요한 경우 잘못 식별하거나 병합된 인쇄물을 수정합니다.
- 공간 및 시간 보행 매개 변수를 추출하려면 Python 스크립트 매개 변수 분석기를실행합니다. 분석할 뒷글인쇄 수와 분석할 동영상 폴더를 선택한 다음 계속을 클릭합니다. 이는 표 2에 설명되어 있고 그림5에 예시된 다수의 일반적인 걸음걸이 매개변수를 포함하는 각 비디오에 대해 .csv 파일을 출력합니다.
참고: 전체 스크립트와 데이터 읽기 및 분석에 대한 지침은 저자의 GitHub(www.github.com/hayleybounds)에서 확인할 수 있습니다. 우리는 무료, 오픈 소스 파이썬 라이브러리 OpenCV21을사용하여이 알고리즘을 구현했다. 또한 GitHub에는 걸음걸이 분석 보도를 구축하기 위한 지침이 포함되어 있습니다.
Representative Results
할로페리돌 절차
우리는 다양한 운동, 걸음걸이 및 균형 장애를 보여줄 것으로 예상되는 실험 쥐의 쥐와 대조군 쥐의 보행 매개 변수를 비교하기 위해 이 걸음걸이 분석 시스템을 개발했습니다. 우리는 모든 쥐가 식염수, 고용량 할로페리돌 및 저용량 할로페리돌 조건에서 테스트된 주제 내 디자인을 사용했습니다. 쥐는 균형을 맞추기 위해 두 그룹(A 및 B)으로 분리하였다. 걸음걸이 테스트는 하루 중 시간과 상태 순서에 대해 균형을 이루었습니다. 각 시험은 48 h. 쥐에 의해 분리되었다. 걸음걸이는 1시간 후 주사를 거쳤으며, 이 때 할로페리돌은 피크 레벨15,16,17에있어야 한다.
행동 결과
우리는 할로페리돌로 치료된 동물의 눈에 띄는 행동 변화를 관찰했습니다. 고용량 상태에서, 8 마리의 쥐 중 5 마리는 보도 의 시작 부분에 부동성의 기간을 가지고 있었고, 그 동안 실험자가 만지고 움직이기에 저항했습니다. 어떤 경우에는, 이 상태는 쥐가 보도에서 제거 될 때까지 몇 분 동안 지속. 다른 경우에, 움직이지 않는 쥐는 갑자기 급속하게 움직이거나 보도를 가로질러 "바운드"된 다음 끝 근처의 움직이지 않는 상태로 돌아갑니다. 낮은 복용량 조건에서, 3 의 8 쥐 는 부동성의 유사한 기간을 했다. 이 복용량에서, 경계 행동의 한 인스턴스만 있었다. 동물을 식염수로 치료했을 때 경계가 관찰되지 않았습니다.
지지대, 보폭 길이, 보폭 속도, 자세 지속 시간, 스윙 비율에 대한 자세, 최대 접촉 영역 및 중간다리 거리 등 다음 보행 매개변수에 대한 할로페리돌의 효과를 분석했습니다. 앞다리와 뒷다리의 많은 보행 매개변수는 동일하며 할로페리돌은 일반적으로 모든 팔다리에 균일한 영향을 미치기 때문에 뒷다리에 대해서만 매개변수를 계산하고 왼쪽 및 오른쪽 팔다리에 대한 데이터를 분리하지 않았습니다. 각 쥐에 대해 각 테스트 일에서 사용 가능한 모든 실행에서 각 보행 매개 변수의 평균을 계산했습니다. 모든 매개변수(속도 가변성 제외)는 실행의 처음 4단계에 대한 평균으로 계산되었습니다. 할로페리돌의 각 투여량이 보행에 큰 영향을 미쳤는지 여부를 평가하기 위해, 우리는 쌍을 이루는 샘플 t-검정을 사용했습니다. 실험 1에서, 고용량 할로페리돌로 처리된 동물에서 보폭 길이(도6A;t(7) = -2.962, p=0.021) 및 최대 접촉 영역(도6A;t(7) = -2.51, p=0.04)의 보폭 길이가 현저한 증가하였다. 지지기반, 스피드, 자세 지속시간, 스윙비율등은 중요하지 않았다. 실험 2에서, 저용량 할로페리돌주어진 동물은 식염수 조건에 비해 자세 지속시간(도6B;t(7) = -2.444, p=0.044) 및 최대 접촉 영역(도6B;t(7) = -3.085, p=0.018)의 유의한 증가를 보였다. 다른 걸음걸이 매개 변수는 유의하지 않았습니다. 또한, 지지대에서 고용량 및 저용량 할로페리돌 조건(그림6C;t(7) = 2.651, p =0.033), 최대 접촉 면적(도6C;t(7) = 4.635, p= 0.002) 및 인터림질 거리() 사이의 유의한 차이가 있었다. 그림 6C; t(7) = 3.098, p = 0.017).
자동화 시스템의 위치 정확도 및 오류
PrAnCER의 정확성을 평가하기 위해, 우리는 6 개의 대조군 쥐의 별도 그룹에서 무작위로 선택된 21 개의 비디오의 수동 채점과 자동화 된 분석을 비교했습니다. 핸드 채점 의 목적을 위해 비디오는 일련의 이미지로 변환된 다음 인쇄 위치를 수동으로 표시하는 데 사용되었습니다. 효율성을 위해 우리는 뒷글씨로만 측정된 공간 데이터에 대한 분석을 집중했습니다. 각 비디오의 평균 보폭 과 BOS를 추출하여 자동화된 값과 비교했습니다. 평균 보폭 길이는 수동 채점과 PrAnCER 분석(그림7B;t(20) = -0.01, p =0.99) 간에 유의하지 않았지만, 지지 기반은 유의했다(그림7A;t(20) = -2.21, p = 0.038). 자동 및 수동 채점은 일반적으로 상관 관계가 잘 되어 있었지만, 자동화 시스템은 평균적으로 BOS가 평균 5% 더 큰 것으로 보고되었습니다. 이러한 차이는 감지 오류가 아닌 중심 선택의 차이로 인한 것일 수 있습니다. 수동 채점의 경우, PrAnCER의 질량 추정 중심 방법을 수동으로 복제하기가 어렵기 때문에 각 뒷글인쇄의 베이스 주위에 타원형을 그리는 것으로 인쇄 위치가 표시되었습니다. PrAnCER가 BOS를 과대 평가하는 경향은 아마도 일부 동물이 비대칭 방식으로 발가락을 재생할 수 있기 때문에 PrAnCER가 수동 채점보다 더 극단적 인 중심을 관찰할 수 있기 때문입니다. 다른 시스템은 또한 일관된 보폭 길이 측정17에도불구하고 수동 및 자동 점수 매기기 사이의 BOS의 현저한 증가를 지적했다. 관찰된 작은 차이와 다른 시스템과의 일관성을 고려할 때, 우리는 PrAnCER가 보행 매개 변수의 신뢰할 수있는 척도라는 결론을 내렸습니다.
모든 정확도 분석은 자동화된 출력을 수동으로 수정한 후에 PrAnCER의 GUI를 사용하여 수행되었다는 점에 유의해야 합니다. 기존 상용 시스템에서와 마찬가지로 이 단계는 점수 매기기의 오류를 수정하고 기준22를충족하지 않는 실행을 제거하는 데 모두 필요합니다. 우리는 이것들이 사후 를 해결하기 쉽기 때문에, 거짓 긍정의 측면에 잘못 PrAnCER을 조정했다. 우리는 PrAnCER 500 개 이상의 비디오의 수동 보정 중에 실제 인쇄를 감지하지 못하는 것을 본 적이 없다. 그러나 다른 유형의 오류가 관찰되었습니다. 이러한 범주는 거짓 검색(인쇄물로 인쇄되지 않은 출력 감지), 잘못된 분류(앞뒤/뒷쪽 또는 왼쪽/오른쪽으로 잘못 레이블이 지정됨) 및 잘못된 조합(두 인쇄물이 잘못 병합됨)으로 나뉩니다. 이러한 오류는 함께 제공되는 GUI에서 쉽게 수정되며 일반적으로 정상적인 조건에서 촬영된 비디오의 극히 일부에 불과합니다. 이러한 수정에도 불구하고, PrAnCER는 현저하게 걸음걸이 분석에 관련된 수동 노동의 양을 감소. 각 비디오에 대해 PrAnCER를 실행하고 출력 오류를 수정하는 데 약 3분이 걸리는 반면(필요한 경우) 동일한 비디오를 수동으로 점수화하고 분석하는 데 는 거의 10분이 소요될 것으로 예상됩니다.
그림 1. 보행 분석 방법의 비교. (A) 전통적인 잉크 및 종이 방법은 발 모양과 위치의 부정확한 인쇄를 생성합니다. (B) 투명한 바닥으로 비디오 녹화는 발 인쇄의 상세한 보기를 제공하지만 자동 채점을 복잡하게 쥐의 몸에서 많은 현저한 기능을 포함하고 있습니다. (C) 투명한 바닥에 가벼운 종이가 시끄러운 이미지를 생성하고 세부 사항을 잃게됩니다. (D) 반투명 바닥을 만들기 위해 벨룸을 사용하면 몸을 시각적으로 제거하면서 매우 상세한 인쇄물을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 걸음걸이 보도 장치 및 비디오 녹화의 개략적 그림. (A) 쥐는 반투명 한 바닥으로 투명한 통로를 통과하여 홈 케이지 골 박스로 이동하면서 아래에서 기록됩니다. 이 경우 벨룸은 투명 한 바닥을 덮어 반투명하게 만듭니다. 산책로는 동물의 발과 몸 사이의 수준에서 길이를 따라 배치 된 LED 스트립에 의해 조명된다. (B) 반투명 바닥의 효과를 보여주는 비디오 녹화의 스크린 샷. 두 발은 선명하지만 쥐의 몸은 본질적으로 탐지 할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 발 인쇄의 한 프레임에 대한 감지 프로세스입니다. (A) 원본 이미지는 노이즈가 제거된 다음 배경 감속(B)을받습니다. (C) 에지 감지 알고리즘이 적용되고 결과는 윤곽선(D)이라고하는 일련의 X, Y 좌표로 변환됩니다. (e) 등고선은 근접에 의해 그룹화되고 그룹의 볼록한 선체(경계 상자)는 인쇄를 포함하는 단일 윤곽선을 생성하기 위해 촬영됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 개별 검색을 분류된 인쇄로 변환합니다. (A) 발 인쇄는 먼저 프레임 세트에서 식별됩니다. (B) 개별 개체 감지에는 인쇄물로 식별하는 숫자가 주어지며, 이는 한 발(C)의단일 배치를 나타냅니다. (D) 마지막으로, 그들은 동물의 경로의 중간선에 비해 자신의 위치에 따라 왼쪽 또는 오른쪽으로 분류하고, 앞또는 뒤는 이전 발 인쇄에 대한 자신의 위치에 따라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 분석된 걸음걸이 매개변수의 그림입니다. (A) 발 인쇄의 식별 및 위치를 보여주는 예제 출력입니다. 원래 감지된 가장자리는 검은색으로 표시됩니다. 마지막으로 감지된 발과 대략적인 영역은 발 분류를 나타내는 색상으로 표시됩니다. 이 그림에서 노란색: 앞왼쪽, 녹색: 왼쪽 뒷쪽, 시안: 앞오른쪽, 마젠타: 오른쪽 뒷시간. 그러나 사용자 기본 설정에 따라 Python 스크립트에서 색상을 변경할 수 있습니다. (B) 두 가지 주요 시간 매개변수를 보여주는 플롯: 각 발이 지면(자세 위상)과 공기(스윙 단계)와 접촉하는 시간의 양입니다. 컬러 블록은 자세 위상을 나타내고 공백은 스윙 단계를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 보행에 할로페리돌의 효과. (a) 실험 결과 1: 고용량 할로페리돌(Hal H)은 식염수 상태(Sal)에 비해 보폭 및 최대 접촉 면적을 현저히 증가하였다. (B) 실험 2보다 전형적인 파킨슨병 증상을 초래; 저용량 할로페리돌(Hal L) 현저하게 자세 지속 시간과 최대 접촉 영역을 증가. (c) 두 실험에서 할로페리돌 처리 조건을 비교할 때, 고용량 할로페리돌은 저용량 조건에 비해 지지, 최대 접촉 면적 및 내다리 거리의 염기를 증가시다. 데이터는 ±SEM, n=8을 의미한다. 페어링된 샘플 t-검정 차이는 다음과 같습니다: # p < 0.05, ## p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 자동화된 분석의 정확성. (A) 자동화 된 시스템은 BOS를 측정 할 때 수동 채점과 크게 다르지만 감지 오류가 아닌 수동 중심 선택의 변화로 인해 발생할 수 있습니다. (B) 자동화 된 시스템은 보폭 길이에 대한 수동 채점과 크게 다르지 않습니다. 이러한 정확도 결과는 사용 가능한 다른 시스템의 결과와 일치합니다. 데이터는 ±SEM, n = 21을 의미한다. 페어링된 샘플 t-검정 차이는 다음과 같다: # p & 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8. 시간 적 매개 변수의 비교. 식염수 (A) 및 저용량 할로페리돌 (B)로 처리 된 동물에 대한 시간 보행 패턴. (C) 고용량 할로페리돌 주어진 쥐로부터의 브레이싱-이스케이프 반응의 예. 그림5에서와 같이, 컬러 블록은 발이 지면과 접촉했을 때(자세 단계) 및 공백은 발이 공중에 있을 때(스윙 단계)를 나타냅니다. 약어: FL, 앞왼쪽; HL, 왼쪽 뒷쪽; FR, 정면 오른쪽; HR, 오른쪽 뒷말. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 실험 1 | 실험 2 | |||||||
| 테스트 1 | 테스트 2 | 테스트 3 | 테스트 4 | 테스트 5 | 테스트 6 | 테스트 7 | 테스트 8 | |
| 그룹 A | 할H | Sal | 할H | Sal | Sal | 할L | Sal | 할L |
| 그룹 B | Sal | 할H | Sal | 할H | 할L | Sal | 할L | Sal |
표 1. 실험적인 디자인. 이 표는 이 연구에 사용된 실험 설계를 보여 줍니다. 우리는 모든 쥐가 고용량 할로페리돌 (HalH),저용량 할로페리돌 (HalL)및 식염수 (Sal) 조건에서 테스트된 내 주제 디자인을 사용했습니다. 랫트는 두 그룹으로 나누어졌다; 테스트는 하루 중 시간과 상태 순서에 대한 균형을 맞췄습니다.
| 매개 변수 | 정의 |
| 보폭 길이 | 같은 발의 연속 된 접촉 사이의 거리 |
| 스텝 길이 | 반대쪽 정면의 연속접촉또는운동방향축을 따라뒷발사이의거리 |
| 지원 기지 (BOS) | 연속적인 반대쪽 앞발 또는 동작 방향의 축에 수직인 뒷발 사이의 거리 |
| 최대 접대 영역 | 뒷글인쇄의 최대 감지 영역 |
| 인터림거리 | 입측면 앞발과 뒷발 사이의 거리 |
| 스탠스 지속 시간 | 발이 지면과 접촉한 시간 |
| 스윙 지속 시간 | 발이 지면에 있지 않은 시간 |
| 스윙 비율에 대한 자세 (SSR) | 스탠스 지속 시간/스윙 지속 시간 |
| 이산 속도 | 보폭 길이/(자세 지속 시간 + 스윙 지속 시간) |
| 평균 속도 | 분석에 사용된 기간의 불연속 속도 평균 |
| 속도 가변성 | 주행 중 불연속 속도 의 백분율 변화 |
| 실행 속도 | 터널/터널 길이를 가로지르는 시간 |
표 2. 걸음걸이 매개변수에 대한 설명입니다. 이 표는 가장 일반적으로 사용되는 걸음걸이 매개변수에 대해 설명합니다. 이 연구에 사용된 것들은 굵게 표시됩니다.
Discussion
이 연구에서는 반투명 바닥을 사용하여 생성된 대비 강화 비디오를 사용하여 동물의 몸을 가리고 간단한 자동 감지를 위해 명확하게 정의된 발 인쇄를 생성하는 새로운 자동 보행 분석 시스템인 PrAnCER를 테스트했습니다. PrAnCER는 발 자국을 정확하게 식별하고 모터 기능의 변화에 민감합니다. 우리는 PD의 급성 할로페리돌 모델에서 걸음걸이 변화를 평가하기 위해 PrAnCER를 사용했습니다. haloperidol는 견고한 PD 모델의 예상 모터 적자를 유도하지 는 않았지만, 그럼에도 불구하고 PrAnCER가 걸음걸이 패턴의 변화를 정확하게 감지 할 수 있음을 입증 할 수있었습니다. 마지막으로, PrAnCER의 정확도를 정량화하고 주요 보행 매개변수의 측정이 수동 채점과 비슷하다는 것을 입증했습니다.
두 할로페리돌 치료 조건에서, 우리는 동결 행동의 높은 발생률을 관찰 (아키네시아) 실행 또는 앞으로 경계의 탈출 응답 다음. 유사근증이 여러 연구에서 유사한 용량(0.25 mg/kg)에서 관찰되었지만16,23,이러한 경계 행동은 전형적인 파킨슨병 증상3,14,19, 24. 흥미롭게도, 우리는 고용량 haloperidol 처리가 현저하게 증가한 보폭 길이 귀착되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 발견은 PD의 다른 할로페리돌 모델이 보폭3,19의감소를 보여주었기 때문에 처음에는 놀랐습니다. 그러나, 그들은 De Ryck 등 (1980)에 의해 설명 된 '브레이싱 - 탈출'행동 패턴에 비추어 의미가 있으며, 쥐가 아키네틱 기간 이후에 탈출하기 위해 달리고 달리기 및 경계와 같은 고속 걸음걸이가 증가 보폭과 관련이 있다고 보고했습니다. 길이4,25 (그림8C). 고용량 치료는 또한 뒷발의 최대 접촉 면적을 현저하게 증가시켰습니다. 저용량 할로페리돌 치료는 자세 지속 시간 및 최대 접촉 영역의 현저한증가를 포함하는 보다 특징적인 PD 보행 변화를 초래하였다(도 8A-B). 이러한 결과는 할로페리돌 유도 운동장애와 관련된 근육 강성의 반영일 수 있다.
특이한 브레이싱 이스케이프 동작에도 불구하고, 우리는 PrAnCER가 실제로 걸음걸이의 변화를 감지할 수 있다는 것을 입증할 수 있었습니다. 우리는 올바른 조명 조건에서 반투명 바닥이 발의 매우 대조적이고 상세한 이미지를 생성 할 수 있음을 보여 주었다. 본 연구에서, 우리는 벨룸으로 덮음으로써 투명한 바닥을 반투명하게 만들었습니다. 마일라와 같은 또 다른 반투명 커버링을 투명 한 바닥에 배치하면 동일한 효과를 얻을 수 있습니다. 또는, 바닥 자체는 예를 들어, 서리가 내린 플렉시 유리를 사용하여 반투명 할 수있다. 반투명 바닥과 간단한 플렉시 유리 산책로는 저렴하며 오후에 건설 할 수 있습니다. 당사의 에지 감지 기반 분석 시스템은 장치의 많은 변화에 탄력적이며 시스템을 다양한 설정, 질병 모델 또는 마우스와 같은 작은 동물에 맞게 조정 가능한 임계값을 제공합니다.
일부 보행 매개변수 분석은 보도의 측면 때문에 기존 수식에서 변경되었습니다. 예를 들어, 속도를 계산하는 우리의 방법은 다른 보행 연구와 다릅니다. LED 조명과 결합 된 반투명 바닥은 몸의 시야를 가리지 않으므로 일반적으로 수행되는 것처럼 속도를 계산하기 위해 신체 위치를 추적 할 수 없습니다. 이 연구에서는, 속도는 첫 번째 접촉에서 두 번째 접촉까지의 시간으로 같은 발의 두 접촉 사이의 이동 거리를 나누어 계산했다. 물론 다른 수식을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 전체 속도 측정이 필요한 경우 실행 시작 과 끝에 있는 포발 위치의 평균에서 거리와 실행 기간을 나눌 수 있습니다.
우리의 분석은 수동 채점과 동일하지는 않지만, 우리의 자동화 된 시스템은 높은 정확도로 수행하고 보행의 신뢰할 수있는 측정을 생성한다는 것을 확인합니다. 여기에 설명된 장치는 모터 기능의 간단하고 저렴한 분석을 위해 최적화되었습니다. 그러나 PrAnCER의 유용성을 확장하는 몇 가지 변경이 이루어질 수 있습니다. 우리 시스템의 한 가지 제한은 반투명 바닥, 우수한 발 감지를 허용하면서, 동물의 신체 축을 모호하게. 필요한 것은 찾지 못했지만 시스템에 오버헤드 카메라를 추가하여 해결할 수 있습니다. 또 다른 개선 사항은 프레임 속도가 높은 비디오 카메라를 사용하는 것입니다. 우리는 시간 적 매개 변수의 일관된 추정을 얻을 수 있었지만, 이러한 측정의 정확도는 100 fps8이하의 프레임 속도로 손상됩니다. 고속 비디오 카메라를 추가하면 시간적 측정의 정확성과 정밀도를 높이는 동시에 분석 소프트웨어를 변경할 필요가 없습니다. 또한, 여러 다른 걸음걸이 시스템은 동시에 쥐 2,8,13의측면 및 복부 뷰를 기록하기 위해 거울을 사용합니다. 이 기능을 장치에 추가하면 속도를 보다 정확하게 정량화하고 주행 중 동작을 더 잘 관찰할 수 있습니다.
이 연구에서는 반투명 바닥을 사용하면 보도 바닥과 접촉하지 않는 물체의 가시성을 차단하여 발 인쇄를 효과적으로 분리하는 것으로 나타났습니다. 우리는 발을 정확하게 식별하기 위해이 고대비 발 인쇄를 활용하는 자동 채점 시스템을 개발했습니다. 우리는 이 시스템인 PrAnCER가 상용 시스템에 필적하는 정확도로 보행 매개변수를 정량화한 것으로 나타났습니다. 우리는 할로페리돌의 고용량의 투여가 식염수에 비해 보폭 길이와 최대 접촉 면적을 증가시키는 것으로 결정했다. 이 변화는 우리가 예상한 것과 반대이지만, 기존 문헌의 추가 검토는 할로페리돌의 급성 투여에 대한 응답으로 관찰된 탈출 행동의 일부일 가능성이 있음을 나타낸다. 저용량 할로페리돌 치료는 자세 지속 시간 및 최대 접촉 영역과 같은 보다 일반적인 PD 증상을 초래했습니다. 우리는 급성 고용량 haloperidol 행정이 PD와 관련되었던 보행 손상을 공부하는 나쁜 모형인 동안, 우리의 연구 결과는 그럼에도 불구하고 모터 기능에 있는 변경을 정확하게 검출하는 PrAnCER의 기능을 설명했다는 것을 결론을 내립니다. 미래에, 우리는 그밖 질병 모형에 있는 운동 성 변경을 공부하여 PrAnCER를 더 유효하게 하는 것을 희망합니다.
Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 브라운 대학에서 뇌 과학에 대한 카니 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
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| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
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| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
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| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
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| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
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| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
References
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Lee, H. Y., Hsieh, T. H., Liang, J. I., Yeh, M. L., Chen, J. J. Quantitative video-based gait pattern analysis for hemiparkinsonian rats. Medical & Biological Engineering & Computing. 50 (9), 937-946 (2012).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Batka, R. J., Brown, T. J., Mcmillan, K. P., Meadows, R. M., Jones, K. J., Haulcomb, M. M. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record. 297 (10), 1839-1864 (2014).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson’s disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
- Williams, M. T., et al. Kaolin-induced ventriculomegaly at weaning produces long-term learning, memory, and motor deficits in rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 35, 7-15 (2014).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Pereira, J. E., et al. A comparison analysis of hindlimb kinematics during overground and treadmill locomotion in rats. Behavioural Brain Research. 172 (2), 212-218 (2006).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Márka, Z., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (50), (2015).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson’s disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
- Kulkarni, S. K., Bishnoi, M., Chopra, K. In vivo microdialysis studies of striatal level of neurotransmitters after haloperidol and chlorpromazine administration. Indian Journal of Experimental Biology. 47 (2), 91-97 (2009).
- Jain, N. S., Tandi, L., Verma, L. Contribution of the central histaminergic transmission in the cataleptic and neuroleptic effects of haloperidol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 139 (Part A), 59-66 (2015).
- Steinpreis, R. E., Anders, K. A., Branda, E. M., Kruschel, C. K. The Effects of Atypical Antipsychotics and Phencyclidine (PCP) on Rotorod Performance. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 63 (3), 387-394 (1999).
- Baptista, P. P. A., et al. Physical exercise down-regulated locomotor side effects induced by haloperidol treatment in Wistar rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 104, 113-118 (2013).
- Chuang, C. S., Su, H. L., Cheng, F. C., Hsu, S., Chuang, C. F., Liu, C. S. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17 (9), (2010).
- Bugalho, P., Alves, L., Miguel, R. Gait dysfunction in Parkinson’s disease and normal pressure hydrocephalus: a comparative study. Journal of Neural Transmission. 120 (8), 1201-1207 (2013).
- Bradski, G. The OpenCV Library. , (2000).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- De Ryck, M., Hruska, R. E., Silbergeld, E. K. Estrogen and haloperidol-induced versus handling-related catalepsy in male rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 17 (5), 1027-1035 (1982).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic Characterization of Speed-Associated Gait Changes in Mice Reveals Modular Organization of Locomotor Networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- De Ryck, M., Schallert, T., Teitelbaum, P. Morphine versus haloperidol catalepsy in the rat: a behavioral analysis of postural support mechanisms. Brain Research. 201 (1), 143-172 (1980).
